Intakte klasse I HLA / peptid-komplekser udgydt af kræftceller, der repræsenterer en potentiel relevant cancer biomarkør. Ved hjælp label-free sensor teknologi og T-celle-receptor efterligner monoklonale antistoffer, påvisning af skur MIF / HLA-A * 02: 01 komplekser i MDA-MB-231 cellesupernatanter, tilsat humant serum og patientens plasma påvises, muliggør udvikling af en ny cancer diagnostisk platform.
Ifølge den amerikanske Cancer Society, vil mere end 200.000 kvinder blive diagnosticeret med invasiv brystkræft hvert år, og ca. 40.000 vil dø af sygdommen. Den humane leukocyt antigen (HLA) Klasse I prøver peptider afledt fra proteasomalaktivitet nedbrydning af cellulære proteiner og præsenterer disse fragmenter på celleoverfladen for forespørgsel fra cirkulerende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL). Dannelse af T-celle-receptor efterligner (TCRm) monoklonale antistoffer (mAb'er), der genkender brystcancer specifikt peptid / HLA-A * 02: 01 komplekser, såsom dem, der stammer fra makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF 19-27) og NY-ESO- 1 157-165 muliggøre påvisning og destruktion af brystkræftceller i fravær af en effektiv anti-tumor CTL respons. Intakte klasse I HLA / peptid-komplekser udgydt af brystcancerceller og udgør potentielt relevante kræft biomarkører. I dette arbejde, et gennembrud biomarkør screening for kræft diagnoses inkorporere T-celle receptor efterligner monoklonale antistoffer kombineret med en roman, label-fri biosensor udnytte guidet tilstand resonans (GMR) sensorteknologi præsenteres. Påvisning af skur MIF / HLA-A * 02: 01 komplekser i MDA-MB-231 cellesupernatanter, tilsat humant serum og patientens plasma påvises. Virkningen af dette arbejde kan revolutionere personlig medicin gennem udvikling af companion sygdomsdiagnostik for målrettede immunterapier.
Klasse I humant leukocyt antigen (HLA) prøver peptider af 8-11 aminosyrer i længde afledt fra proteasomalaktivitet nedbrydning af det intracellulære protein repertoire og præsenterer disse peptider på overfladen af hver celle med kerne 1,2. HLA-kompleks er "naturens biomarkør", der indikerer sundhed hver celle (figur 1) til cirkulerende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL). Anerkendelse af sygdom forbundet peptider resulterer i fjernelse af de ulovlige celle ved CTL. Således reaktion adaptive immunrespons er meget effektiv til at fjerne viral infektion og tumor. Men immunsystemet udøver pres, der ofte fremmer selektion for vira eller tumor, der kan unddrage sig en effektiv CTL respons. T-celle-receptor efterligner (TCRm) monoklonale antistoffer (mAb'er), der genkender specifikke peptid / HLA-A * 02: 01 komplekser, såsom dem afledt af brystkræft associerede proteiner, makrofag migration inhibitorisk faktor (MIF19-27) 3 og NY-ESO-1 157-165, muliggøre påvisning og destruktion af brystkræftceller i fravær af en effektiv anti-tumor CTL respons 4,5. Dette repræsenterer arbejde er fokuseret på HLA-A * 0201-molekylet, som udtrykkes med op til 30% af befolkningen. Men identifikation af andre relevante HLA / peptidkomplekser, efterfulgt af produktionen af TCRm muliggør udvikling af målrettede immunterapier og følgesvend sygdomsdiagnostik, udvide anvendeligheden af dette arbejde til en meget bredere befolkning.
En del af peptid / HLA-komplekser på vej til celleoverfladen frigives i plasmaet. På grund af den meget komplekse karakter af peptid / HLA pools, aktuelle metoder til minedrift immunopeptidome for HLA associerede biomarkører er tidskrævende. Denne proces kræver affinitetsoprensning af opløseligt HLA fra plasma, adskillelse af HLA associerede peptider ved revers fase højtryksvæskekromatografi(RP-HPLC) og peptid-sekventering ved tandem massespektrometri (MS / MS) 6,7. Selv om denne proces er en farbar vej for opdagelsen af nye terapeutiske mål, er det en besværlig proces som en følgesvend diagnostisk værktøj til HLA tilknyttede mål, der allerede i det terapeutiske vaccine eller biofarmaceutisk rørledning 8-10. TCRm rettet mod disse mål give værktøjer til hurtig følgesvend diagnostisk udvikling har til formål at stratificere patienterne i relevante kliniske forsøg og give mere informerede behandlingsmuligheder.
I dette arbejde, er et gennembrud biomarkør screening for kræftdiagnostik præsenteret som anvender TCRm og en etiket-fri bioassay, der overvåger de biologiske interaktioner med minimale procestrin. Etiketten fri bioassay er baseret på en metode, der udnytter styret tilstand resonans (GMR), der opstår i dielektriske bølgeleder riste 11-14. Når bredbånd lys kontakter diffraktiverivning i pladerne er nødvendige for dette system er to specifikke bølgelængder reflekteres. Den bindende vekselvirkning mellem et immobiliseret receptor og dens ligand overvåges i realtid ved at spore resonansen bølgelængdeforskydningen med en spektrumanalysator 12. Separate resonanstoppe forekomme hændelse TE (elektrisk vektor normal til planet for forekomst) og TM (magnetisk vektor vinkelret på planet af forekomst) polarisationstilstandene leverer flere datapunkter, der potentielt kan forøge påvisning nøjagtighed 11,14. Anvendelse af antistof pre-sensibiliserede plader i denne etiket-fri assaysystem assayet driftstid med dataanalyse er ca. 45 min. Desuden kan flere patientprøver forespørges i en 96- eller 384-brønds format, en klar fordel i forhold til en HPLC-MS / MS baseret format.
Den heri beskrevne fremgangsmåde introducerer en biomarkør screening for kræftdiagnostik, der ville muliggøre hurtig påvisning af opløselige peptid / HLA-komplekser i patientens serum, plasma, urin eller spytprøver i et højt gennemløb 96- eller 384-brønds format. Dette assay, der anvender T-celle-receptor efterligner monoklonale antistoffer og et mærke-frit detection system skærer analyse tid til mindre end 1 time i forhold til 3,5 timer ved konventionel ELISA. Denne high-throughput fremgangsmåde muliggør hurtig lagdeling af patienter til kliniske forsøg til terapeutiske cancervacciner eller biopharmaceuticals. Aktuelle metoder til påvisning af disse sygdomstargets kræver affinitetsoprensning og HPLC-MS / MS af individuelle patientprøver, en besværlig og tidskrævende proces. Selv om denne metode er modtagelig for konventionelle ELISA-metoder, der er bekymring for, at sekundære påvisningsreagenser såsom anti-β2 mikroglobulin antistof kunne ændre strukturen af spirende HLEt molekyle og inhiberer binding til TCRm begrænsende detektion. Label-fri afsløring lindrer disse bekymringer. Denne procedure kan modificeres til anvendelse på andre label-fri systemer, såsom en overfladeplasmonresonans system. Dette ville imidlertid i høj grad reducere de højere throughput kapacitet i forhold til den biologiske system, der anvendes i denne undersøgelse.
Denne protokol kan effektivt modificeret til detektering af ikke-HLA biomarkører i patientens serum og plasma med overholdelse et par kritiske trin. Overvågning af den oprindelige antistof coating proces anbefales til optimering af overfladen, som <200 pm skift sandsynligvis vil resultere i lavt signal til det efterfølgende trin detektion. Baseline og post-vask læser er anvendelige til endepunktsanalyse som overflod af serumproteiner kan maskere binding af lav analytkoncentrationen. Endelig kan temperaturvariation af prøver resultere i brønd til brønd variation. Det anbefales, at alle prøver præinkuberes end etiketten fri biosassay enhed temperaturregulator sættes ved 2-3 ° C over stuetemperatur. Bør tillades Køle- prøver tid nok til at nå driftstemperaturen.
Fremtidige ændringer af denne protokol vil omfatte multiplexing af TCRm på pladens overflade. Bioassayet for øjeblikket er modtagelig for spotting af brønde ved en densitet på mindst 8-plex. Ved at indføre 4-8 TCRm til hver brønd, pr prøvevolumener test reduceres og muliggøre indsamling af stadig mere komplekse data per patient. Denne evne kan yderligere oplyse patienterne med hensyn til behandlingsmuligheder.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |