Intakte klasse I HLA / peptidkomplekser er utgytt av kreftceller, som representerer en potensiell relevant kreft biomarkør. Utnytte etikett-fri sensorteknologi og T-celle-reseptor ligne monoklonale antistoffer, deteksjon av skur MIF / HLA-A * 02: 01 komplekser i MDA-MB-231-cellesupernatanter, tilsatt humant serum, og pasientens plasma demonstreres, slik at utvikling av en roman kreft diagnostisk plattform.
Ifølge American Cancer Society, vil mer enn 200.000 kvinner bli diagnostisert med invasiv brystkreft hvert år, og ca 40 000 vil dø av sykdommen. Den humane leukocytt antigen (HLA) klasse I prøvene peptider avledet fra proteasomal nedbrytning av cellulære proteiner og presenterer disse fragmentene på celleoverflaten for utspørring av sirkulerende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL). Generasjon av T-celle reseptor ligne (TCRm) monoklonale antistoffer (mAbs) som gjenkjenner brystkreft bestemt peptid / HLA-A * 02: 01 komplekser som de som stammer fra makrofag migrasjon hemmende faktor (MIF 19-27) og NY-ESO- 1 157-165 aktivere deteksjon og ødeleggelse av brystkreftceller i fravær av en effektiv anti-tumor CTL-respons. Intakte klasse I HLA / peptidkomplekser er utgytt av brystkreftceller og representerer potensielt relevante kreft biomarkører. I dette arbeidet, et gjennombrudd biomarkør screening system for kreft diagnostisks innlemme T-celle reseptor ligne monoklonale antistoffer kombinert med en roman, etikett-fri biosensor utnytte guidet-modus resonans (GMR) sensorteknologi er presentert. Påvisning av skur MIF / HLA-A * 02: 01 komplekser i MDA-MB-231 cellesupernatanter, piggete humant serum, og pasienten plasma er demonstrert. Virkningen av dette arbeidet kan revolusjonere personlig medisin gjennom utvikling av companion sykdomsdiagnostikk for målrettede immunotherapies.
Den klasse I humane leukocytt antigen (HLA) samples peptider med 8-11 aminosyrer i lengde avledet fra proteasomal degradering av intracellulære proteiner repertoaret og presenterer disse peptider på overflaten av hvert kjernedannelse celle 1,2. HLA-komplekset er «naturens biomarkør", som indikerer helsen til hver celle (figur 1) for å sirkulerende cytotoksiske T-lymfocytter (CTL). Anerkjennelse av sykdom forbundet peptider resulterer i eliminering av den fornærmende celle ved CTL. Således er den adaptive immunrespons meget effektiv på å eliminere virusinfeksjon og tumor. Men utøver immunsystemtrykk som ofte fremmer utvalget for virus eller svulst i stand til å unndra en effektiv CTL respons. T-celle-reseptor-ligne (TCRm), monoklonale antistoffer (mAbs) som gjenkjenner spesifikke peptid / HLA-A * 02: 01-komplekser, slik som de avledet fra brystkreft assosierte proteiner, makrofag migrerings inhiberende faktor (MIF19-27) 3 og NY-ESO-1 157-165, aktiverer deteksjon og ødeleggelse av brystkreft celler i fravær av en effektiv anti-tumor CTL respons 4,5. Denne representative arbeidet er fokusert på HLA-A * 0201-molekyl, som uttrykkes med opp til 30% av befolkningen. Imidlertid identifisering av andre relevante HLA / peptid-komplekser, etterfulgt av produksjon av TCRm muliggjør utvikling av målrettet immunterapi og ledsager sykdomsdiagnostikk, utvider nytten av dette arbeidet til et mye bredere populasjon.
En del av peptid / HLA-komplekser bundet til celleoverflaten er sluppet inn i plasma. På grunn av den svært komplekse natur av peptid / HLA bassenger, aktuelle metoder for gruvedrift immunopeptidome for HLA forbundet biomarkører er tidkrevende. Denne prosessen krever at affinitetsrensing av oppløselig HLA fra plasma, separering av HLA-assosierte peptider ved revers fase høytrykks-væskekromatografi(RP-HPLC) og peptid-sekvensering ved tandem-massespektrometri (MS / MS) 6,7. Selv om denne prosessen er et levedyktig alternativ for oppdagelsen av nye terapeutiske mål, er det en tungvint prosess som en følges diagnostisk verktøy for HLA tilhørende mål allerede i terapeutisk vaksine eller biofarmasøytisk rørledning 8-10. TCRm rettet mot disse målene gir verktøy for rask følges diagnostisk utvikling rettet mot stratifying pasienter i relevante kliniske studier og gi mer informerte behandlingsalternativer.
I dette arbeidet er et gjennombrudd biomarkør screening system for kreftdiagnostikk presenteres som benytter TCRm og en etikett fritt bioassay system som overvåker biologiske interaksjoner med minimal behandlingstrinn. Etiketten frie bioassay systemet er basert på en metode som benytter den ledet modusresonans (GMR) effekt som oppstår i dielektriske bølgeleder gitter 11-14. Når bredbånd light kontakter diffraktivegitteret i platene som kreves for dette systemet, er to spesifikke bølgelengder som reflekteres. Bindingen samspillet mellom en immobilisert reseptor og dens ligand overvåkes i sanntid ved å spore resonans bølgelengde skift med en spektrumanalysator 12. Separate resonanstopper oppstå for innfall TE (elektrisk vektor vinkelrett på innfallsplanet) og TM (magnetiske vektor vinkelrett på innfallsplanet) polarisasjonstilstander som gir flere datapunkter som potensielt kan øke deteksjonsnøyaktighet 11,14. Ved hjelp av antistoff pre-sensibiliserte plater i denne etiketten frie analysesystem, analyse kjøretid med dataanalyse er ca 45 min. I tillegg kan flere pasientprøver bli avlest i et 96- eller 384-brønners-formatet, en klar fordel i forhold til en HPLC-MS / MS basert format.
Den her beskrevne fremgangsmåte innfører en biomarkør screeningsystem for kreftdiagnostikk som ville muliggjøre rask deteksjon av oppløselige peptid / HLA-komplekser i pasientens serum, plasma, urin eller spytt prøver i en høy gjennomstrømning 96- eller 384-brønners format. Dette assay-system som anvender T-celle-reseptor ligne monoklonale antistoffer og en etikett fritt deteksjonssystem reduserer analysetiden til mindre enn 1 time, sammenlignet med 3,5 timer ved konvensjonell ELISA. Denne high-throughput tilnærming muliggjør rask stratifisering av pasienter til kliniske studier for terapeutiske kreftvaksiner eller Biopharmaceuticals. Nåværende metoder for å påvise disse sykdoms mål krever affinitetsrensing og HPLC-MS / MS av individuelle pasientprøver, en tungvint og tidkrevende prosess. Selv om denne metoden er mottagelig for konvensjonelle ELISA-teknikker, er det bekymring for at sekundære påvisningsreagenser som for eksempel anti-β2 mikroglobulin antistoff kunne endre strukturen i den begynnende HLEt molekyl og hemme binding til TCRm begrensende deteksjon. Etikett-free deteksjon lindrer disse bekymringene. Denne fremgangsmåten kan modifiseres for bruk i andre etikett-frie systemer, for eksempel en overflate-plasmonresonans system. Dette vil imidlertid i stor grad redusere de høyere gjennomstrømning kapasiteter i forhold til den biologiske metode som brukes i denne undersøkelsen.
Denne protokollen kan effektivt modifiseres for påvisning av ikke-HLA biomarkører i pasientens serum og plasma med tilslutning til noen kritiske trinn. Overvåking av det opprinnelige antistoff belegningsprosessen er anbefalt for optimalisering av overflaten, som en <200 pm skiftet vil trolig føre til lavt signal for den etterfølgende deteksjonstrinn. Grunnlinjen og ettervasker leser er nyttige for sluttpunktanalyse som overflod av serumproteiner kan maskere binding av lav konsentrasjon analytt. Endelig kan temperaturvariasjon av prøver resultere i brønn til brønn variasjon. Det anbefales at alle prøvene være pre-inkubert end etiketten gratis biosassay enhet temperaturregulator settes til 2-3 ° C over romtemperatur. Kjølte prøver bør få lov nok tid til å nå driftstemperatur.
Fremtidige endringer av denne protokollen vil omfatte multipleksing av TCRm på tallerkenen overflaten. Den biologiske metode Systemet er mottagelig for å fange opp av brønner i en tetthet på minst 8-plex. Ved å innføre 4-8 TCRm til hver brønn, per testprøvevolum reduseres og gjøre det mulig for innsamling av stadig mer komplekse data per pasient. Denne evnen kan videre informere pasienter med hensyn til behandlingsalternativer.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |