Bozulmamış sınıf I HLA / peptit kompleksleri potansiyel ilgili kanser biyobelirteç temsil, kanser hücreleri tarafından dökülür. Monoklonal antikorlar, atkı aralığı MIF / HLA-A saptanmasını taklit etiketi içermeyen sensör teknolojisi ve T-hücresi reseptörü kullanmak * 02: MDA-MB-231 hücre süpernatantlan içinde 01 kompleksleri, insan serumu katıldı ve hastanın plazma gelişmesine olanak gösterilmektedir Bir roman kanseri teşhis platformu.
Amerikan Kanser Derneği'ne göre, 200.000'den fazla kadın invaziv meme kanseri, her yıl teşhis edilecek ve yaklaşık 40.000 hastalıktan ölecektir. İnsan lökosit antijeni (HLA) klas I örnekleri hücresel proteinlerin proteozomal bozulması türeyen peptidleri ve sirkülasyon sitotoksik T lenfositleri (CTL) tarafından yapılan sorgulama için, hücre yüzeyi üzerinde, bu fragmanları sunulur. T-hücre reseptör Mimic nesil (TCRm) monoklonal antikorlar, meme kanseri kabul (mAb 'ler), spesifik peptit / HLA-A * 02: makrofaj göçü inhibe edici faktör (MIF 19-27) ve NY-esofago türetilenler gibi 01 kompleksler 1 157-165 etkili bir anti-tümör CTL yanıtının yokluğunda algılama ve meme kanseri hücrelerinin ortadan kaldırılması için. Bozulmamış sınıf I HLA / peptit kompleksleri meme kanseri hücreleri tarafından döken ve potansiyel olarak ilgili kanser biyobelirteçleri temsil edilir. Bu çalışmada, tanı kanser için bir atılım biyobelirteci eleme sistemindeT-hücresi reseptörünü güdümlü modu rezonans (GMR) sensör teknolojisini kullanan yeni, etiket-ücretsiz biyosensör ile kombine taklit monoklonal antikorlar içeren s sunulmuştur. Atkı aralığı MIF / HLA-A * 02 Algılama: MDA-MB-231 hücre süpernatantlan içinde 01 kompleksleri, insan serumu katıldı ve hastanın plazma gösterilmiştir. Bu çalışmanın etkisi hedeflenen imünoterapiler için arkadaşı hastalığı teşhis geliştirilmesi yoluyla kişiselleştirilmiş tıp devrim olabilir.
sınıf I insan lökosit antijeni (HLA) örnekleri hücre içi protein repertuarının proteozomal bozulması türetilen uzunluğu 8-11 amino asit arasında peptidler ve her çekirdekli hücre 1,2 yüzeyi üzerinde bu peptidleri sunulur. HLA kompleksi dolaşan sitotoksik T lenfositler (CTL), (Şekil 1), her bir hücrenin sağlık gösteren "doğanın biyomarker" dir. CTL ile kusurlu hücre ortadan kaldırılmasında hastalıkla ilişkili peptidler sonuçların tanınması. Bu nedenle, adaptif bağışıklık tepkisi, viral enfeksiyon ve tümör ortadan kaldırılması oldukça etkilidir. Ancak, bağışıklık sistemi genellikle etkili bir CTL yanıtı kaçma yeteneğine virüs veya tümör için seçimi teşvik basınç uygular. Taklit T-hücresi reseptörü (TCRm) monoklonal antikorlar, spesifik peptit / HLA-A * 02 tanır (mAb 'ler), meme kanseri ilişkili proteinler, makrofaj göçü inhibe edici faktör türetilenler gibi 01 kompleksleri (MIF19-27) 3 ve NY-ESO-1 157-165 CTL 4,5 tepki etkili bir anti-tümör yokluğunda algılama ve meme kanseri hücrelerinin ortadan kaldırılması için. Bu temsili çalışma nüfusunun% 30'a varan ile ifade edilir HLA-A * 0201 molekülü, odaklanmıştır. Ancak, TCRm üretimi takiben diğer ilgili HLA / peptit kompleksleri tanımlanması, çok daha geniş bir nüfusa bu işin programı genişleterek, hedeflenen imünoterapiler ve arkadaşı hastalığı teşhis gelişimini sağlar.
Hücre yüzeyi bağlı peptit / HLA komplekslerinin bir kısmı plazma salınır. Nedeniyle HLA ilişkili biyomarkerların için immunopeptidome madencilik için peptid / HLA havuzları, mevcut yöntemlerin son derece karmaşık doğası zaman alıcıdır. Bu işlem plazma çözünür HLA afinite saflaştırılmasını gerektirir, ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile, HLA ilişkili peptitler ayrılmasıTandem kütle spektrometrisi (MS / MS), 6,7 ile (RP-HPLC) ve peptit sıralaması. Bu süreç yeni terapötik hedeflerin keşfi için uygun bir seçenek olmasına rağmen, zaten terapötik aşı veya biofarmasötik boru hattı 8-10 HLA ilgili hedefler için bir arkadaşı tanı aracı olarak hantal bir süreçtir. Bu hedefler, ilgili klinik çalışmalarda içine hastaları stratifying ve daha bilinçli tedavi seçenekleri sunmak amacıyla hızlı arkadaşı teşhis gelişimi için araçlar temin karşı TCRm yönetti.
Bu çalışmada, kanser teşhis için bir atılım biyobelirteci tarama sistemi TCRm ve minimal işlem adımları ile biyolojik etkileşimleri izleyen bir etiket ücretsiz biyoanaliz sistemini kullanan hangi sunulmuştur. etiketsiz biyo-analizi sistemi dielektrik dalga kılavuzu ızgarası 11-14 oluşur güdümlü modda rezonans (GMR) etkisini kullanan yöntem dayanmaktadır. Ne zaman genişbant ışığı temas difraktifBu sistem için gerekli olan levhalarda ızgara, iki özel dalga boyu yansıtılır. hareketsizleştirilmiş reseptör ve ligand arasındaki bağlanma etkileşimi bir spektrum analiz cihazı 12, rezonans dalgaboyu kaymasını izleme gerçek zamanlı olarak izlenir. Ayrı rezonans tepeleri olay TE (geliş düzlemine dik elektrik vektörü) ve TM (insidans düzlemine normal manyetik vektör) potansiyel tespit doğruluğunu 11,14 artırabilir çoklu veri noktalarını sağlayan polarizasyon durumları için oluşur. Bu etiket özgür deney sisteminde antikor önceden duyarlı plakaları kullanarak, veri analizi ile tahlil çalışma süresi yaklaşık 45 dakikadır. Buna ek olarak, çok sayıda hasta numuneleri HPLC-MS / MS tabanlı format üzerinden, 96 veya 384 oyuklu formatta açık bir avantaj sorgulanabilir.
Burada tarif edilen yöntem, yüksek bir verim içinde hasta serum, plazma, idrar, tükürük örnekleri çözünür peptid / HLA komplekslerinin hızlı algılama sağlar 96- ya da 384-kuyucuklu format olur kanser teşhis için bir biyolojik işaretleyici tarama sistemi sunar. Monoklonal antikorlar ve etiket içermeyen algılama sistemi taklit T hücre reseptörü kullanan bu tahlil sistemi, geleneksel ELISA ile 3.5 saat kıyasla daha az 1 saat analiz süresini keser. Bu yüksek verimlilik yaklaşımı terapötik kanser aşıları veya biyofarmasötikler için klinik çalışmalarda hastaların hızlı tabakalaşma sağlar. Bu hastalık hedeflerin saptanması için güncel yöntemler tek tek hasta numuneleri, bir zahmet verici ve zaman alıcı bir afinite saflaştırmasını ve HPLC-MS / MS gerektirir. Bu yöntem, geleneksel ELISA teknikleri için uygun olmasına rağmen, endişe anti-β2 mikroglobulin antikor gibi ikincil algılama reaktifler doğmakta olan HL yapısını değiştirebilir ki oradaBir molekül ve TCRm sınırlayıcı algılama bağlanmayı inhibe eder. Etiket-ücretsiz algılama bu endişeleri azaltır. Bu yöntem, bir yüzey plazmon rezonans sistemi gibi diğer etiketi içermeyen sistemlerde kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Bununla birlikte, bu büyük ölçüde bu çalışmada kullanılan biyo-deney sistemi ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir çıktı kapasitesini azaltacaktır.
Bu protokol etkin bir şekilde birkaç kritik adımlar bağlılık ile hasta serumu ve plazma olmayan HLA biyomarkerların tespiti için modifiye edilebilir. Bir <200 um kayması olası daha sonraki belirleme adımında düşük sinyal neden olacağı için, başlangıç antikoru kaplama sürecinin gözlemlenmesi, yüzey optimizasyonu için tavsiye edilir. serum proteinleri zenginliği düşük konsantrasyon analitin bağlayıcı maske edilebilir baz ve yıkama sonrası okur bitiş noktası analizi için de yararlıdır. Son olarak, örneklerin sıcaklık değişimi iyi de varyasyona neden olabilir. Tüm numuneler, bir ön-inkübe edilmesi önerilmektedird etiketi serbest biosassay birim sıcaklık kontrol oda sıcaklığının üzerinde 2-3 ° C 'de ayarlanabilir. Soğutmalı örnekler çalışma sıcaklığına ulaşması için yeterli zaman tanınmalıdır.
Bu protokolün gelecek değişiklikler plaka yüzeyinde TCRm katlandınîmasını içerecektir. biyo-deney sistemi, en az 8-kompleks bir yoğunlukta kuyu tespit etmek uyarlanabilir. Test numunesi hacimleri başına, her kuyuya 4-8 TCRm tanıtarak azalır ve hasta başına giderek karmaşık verilerin toplanmasını sağlamak vardır. Bu özellik ayrıca tedavi seçenekleri ile ilgili hastaları bilgilendirmek.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |