Intact klasse I HLA / peptide complexen worden vergoten door kankercellen, wat neerkomt op een potentieel relevante kanker biomarker. Met behulp labelvrije sensortechnologie en T-cel receptor nabootsen monoklonale antilichamen, detectie van stal MIF / HLA-A * 02: 01 complexen in MDA-MB-231 cel supernatanten, spiked humaan serum en plasma van een patiënt wordt aangetoond, waardoor de ontwikkeling van een nieuwe kankertherapie diagnostisch platform.
Volgens de American Cancer Society, meer dan 200.000 vrouwen worden gediagnosticeerd met invasieve borstkanker elk jaar ongeveer 40.000 zullen sterven aan de ziekte. Het menselijk leukocyt antigeen (HLA) klasse I monsters peptiden afgeleid van proteasomale afbraak van cellulaire eiwitten en presenteert deze fragmenten op het celoppervlak voor ondervraging door circulerende cytotoxische T-lymfocyten (CTL). Vorming van T-cel receptor nabootsen (TCRm) monoklonale antilichamen (mAbs) die borstkanker herkennen specifiek peptide / HLA-A * 02: 01 complexen zoals die afgeleid van macrofaagmigratie remmende factor (MIF 19-27) en NY-ESO- 1 157-165 inschakelen detectie en vernietiging van borstkankercellen in afwezigheid van een effectieve anti-tumor CTL respons. Intact klasse I HLA / peptide complexen worden vergoten door borstkankercellen en vertegenwoordigen potentieel relevante kanker biomarkers. In dit werk, een doorbraak biomarker screening voor kanker diagnostisches opnemen van T-cel receptor na te bootsen monoklonale antilichamen in combinatie met een nieuw, label-free biosensor gebruik te maken van geleide-modus resonantie (GMR) sensortechnologie wordt gepresenteerd. Detectie van loods MIF / HLA-A * 02: 01 complexen in MDA-MB-231 celsupernatanten, spiked humaan serum en plasma van de patiënt wordt aangetoond. De impact van dit werk kon gepersonaliseerde geneeskunde een revolutie door de ontwikkeling van de ziekte companion diagnostics voor gerichte immuuntherapie.
De klasse I menselijk leukocyt antigeen (HLA) monsters peptiden van 8-11 aminozuren in lengte afgeleid uit de proteasomale degradatie van het intracellulaire eiwit repertoire en presenteert deze peptiden op het oppervlak van een kernhoudende cel 1,2. De HLA-complex is "biomarker van de natuur", met vermelding van de gezondheid van elke cel (figuur 1) om circulerende cytotoxische T-lymfocyten (CTL). Erkenning van de ziekte geassocieerd peptiden resulteert in verwijdering van de gewraakte cel door CTL. Dus de adaptieve immuunreactie is zeer effectief bij het elimineren van virale infectie en tumor. Echter, het immuunsysteem druk uitoefent die vaak bevordert keuze voor virussen of tumoren kunnen ontwijken een effectieve CTL respons. T-cel receptor nabootsen (TCRm) monoklonale antilichamen (mAbs) die specifiek peptide / HLA-A * 02 herkennen 01 complexen zoals die afgeleid van borstkanker geassocieerde eiwitten, macrofaagmigratie remmende factor (MIF19-27) 3 en NY-ESO-1 157-165, maken detectie en vernietiging van borstkankercellen in afwezigheid van een effectieve anti-tumor CTL respons 4,5. Deze vertegenwoordiger werk is gericht op het HLA-A * 0201 molecuul, die wordt uitgedrukt tot 30% van de bevolking. De identificatie van andere relevante HLA / peptide-complexen, gevolgd door de productie van TCRm maakt de ontwikkeling van gerichte immuuntherapie en companion diagnostica, uitbreiden van de bruikbaarheid van dit werk een veel bredere populatie.
Een deel van het peptide / HLA-complexen gebonden voor het celoppervlak wordt vrijgegeven in het plasma. Vanwege de zeer complexe aard van peptide / HLA zwembaden, de huidige methoden voor de mijnbouw de immunopeptidome voor HLA geassocieerd biomarkers zijn tijdrovend. Dit proces vereist de affiniteitszuivering van oplosbare HLA uit het plasma scheiden van HLA geassocieerde peptiden met omgekeerde fase hogedrukvloeistofchromatografie(RP-HPLC) en peptide sequentiebepaling door tandem massaspectrometrie (MS / MS) 6,7. Hoewel deze werkwijze een haalbare optie voor de ontdekking van nieuwe therapeutische doelwitten is een moeizaam proces als gezelschap diagnostisch hulpmiddel voor HLA bijbehorende doelen reeds in de therapeutisch vaccin of biofarmaceutische pijpleiding 8-10. TCRm tegen de targets bieden de instrumenten voor snelle companion diagnostics ontwikkeling gericht op stratificatie patiënten in relevante klinische studies en meer gefundeerde therapeutische opties.
In dit werk wordt een doorbraak biomarker screening systeem voor de diagnostiek van kanker gepresenteerd die TCRm en een label-free bioassay systeem dat de biologische interacties met minimale stappen-monitors gebruikt. De ongelabelde bioassay is gebaseerd op een werkwijze, waarbij de geleide-modus resonantie (GMR) effect dat optreedt diëlektrische golfgeleider roosters 11-14 gebruikt. Toen breedband licht contact met de diffractierooster in de voor dit systeem platen worden twee specifieke golflengten gereflecteerd. De binding interactie tussen een geïmmobiliseerde receptor en zijn ligand wordt gevolgd in real time door het volgen van de resonantie golflengteverschuiving met een spectrum analyzer 12. Afzonderlijke resonantiepieken voordoen bij incident TE (elektrische vector loodrecht op het vlak van inval) en TM (magnetische vector loodrecht op het vlak van inval) polarisatietoestanden verschaffen van meerdere gegevenspunten die potentieel kan verhogen detectienauwkeurigheid 11,14. Met behulp van antilichaam pre-gesensibiliseerd platen in dit label-free testsysteem, de test run tijd met data-analyse is ongeveer 45 min. Bovendien kunnen meerdere patiëntmonsters worden opgevraagd in een 96- of 384 putjes, een duidelijk voordeel over een HPLC-MS / MS-gebaseerd formaat.
De werkwijze die hierin beschreven introduceert een biomarker screening systeem voor de diagnostiek van kanker die een snelle detectie van oplosbare peptide / HLA-complexen in de patiënt serum, plasma, urine of speeksel in staat zou stellen in een high throughput 96- of 384-wells-formaat. Dit testsysteem gebruikmakend van de T-cel receptor nabootsen monoklonale antilichamen en een ongelabelde detectiesysteem snijdt de analyse tot minder dan 1 uur in vergelijking met 3,5 uur met conventionele ELISA. Deze high-throughput aanpak maakt een snelle stratificatie van patiënten met klinische proeven voor therapeutische vaccins tegen kanker of biofarmaceutica. Huidige werkwijzen voor de detectie van deze ziekte doelen vereisen affiniteitszuivering en HPLC-MS / MS van individuele patiëntenmonsters, een omslachtig en tijdrovend proces. Hoewel deze methode is vatbaar voor conventionele ELISA-technieken is er bezorgdheid dat secundaire detectie reagentia zoals de anti-β2-microglobuline antilichaam de structuur van de ontluikende HL kunnen wijzigenEen molecuul en remt binding aan de TCRm beperken detectie. Label-free detectie verlicht deze zorgen. Deze procedure kan worden aangepast voor gebruik op andere labelvrije systemen zoals oppervlakte plasmon resonantie systeem. Dit zou echter sterk verminderen de hogere doorvoer mogelijkheden in vergelijking met de bioassay systeem gebruikt in deze studie.
Dit protocol kan effectief worden aangepast voor de detectie van niet-HLA biomarkers patiënt serum en plasma met volgen van een paar kritische stappen. Controle van de oorspronkelijke antilichaam bekledingsproces wordt aanbevolen voor optimalisering van het oppervlak, als <200 pm verschuiving zal waarschijnlijk resulteren in lage signaal voor de daaropvolgende detectiestap. De basislijn en post-wash leest bruikbaar voor de eindpuntanalyse de overvloed aan serumeiwitten binding van lage concentratie analyt kan maskeren. Ten slotte kan de temperatuur variatie van de monsters resulteren in goed om goed variatie. Het wordt aanbevolen dat alle monsters vooraf worden geïncubeerd eend het label gratis biosassay eenheid temperatuurregelaar worden ingesteld op 2-3 ° C boven kamertemperatuur. Gekoelde stalen moeten worden toegestaan genoeg tijd om de bedrijfstemperatuur te bereiken.
Toekomstige wijzigingen van dit protocol zal multiplexing van TCRm op de plaat oppervlak. De bioassay systeem nog vatbaar spotten van putjes met een dichtheid van ten minste 8-plex. Door de introductie van 4-8 TCRm aan elk putje, per monster volumes worden verminderd en kan de collectie van steeds complexere gegevens per patiënt. Deze mogelijkheid zou kunnen patiënten verder te informeren met betrekking tot de therapeutische opties.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |