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Immunology and Infection

लेबल मुक्त Biosensor प्रौद्योगिकी का उपयोग स्तन कैंसर में मानव ल्युकोसैट प्रतिजन biomarkers की डिटेक्शन

doi: 10.3791/52159 Published: March 24, 2015

Summary

बरकरार वर्ग मैं एचएलए / पेप्टाइड परिसरों एक संभावित प्रासंगिक कैंसर बायोमार्कर का प्रतिनिधित्व करने, कैंसर कोशिकाओं द्वारा बहा रहे हैं। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, शेड MIF / एचएलए-ए का पता लगाने की नकल उतार लेबल से मुक्त सेंसर तकनीक और टी सेल रिसेप्टर उपयोग * 02: एमडीए MB-231 सेल supernatants में 01 परिसरों, मानव सीरम नुकीला, और रोगी प्लाज्मा के विकास को सक्षम करने, प्रदर्शन किया है एक उपन्यास कैंसर निदान मंच।

Abstract

अमेरिकन कैंसर सोसायटी के अनुसार, 200,000 से अधिक महिलाओं इनवेसिव स्तन कैंसर के हर साल के साथ का निदान किया जाएगा और लगभग 40,000 रोग से मर जाएगा। मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) वर्ग मैं नमूनों सेलुलर प्रोटीन की proteasomal गिरावट से व्युत्पन्न पेप्टाइड्स और परिसंचारी साइटोटोक्सिक टी lymphocytes (सीटीएल) द्वारा पूछताछ के लिए कोशिका की सतह पर इन टुकड़ों को प्रस्तुत करता है। टी सेल रिसेप्टर नकल की पीढ़ी (TCRm) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी स्तन कैंसर को पहचान जो (MABS) विशिष्ट पेप्टाइड / एचएलए-ए * 02: ऐसे बृहतभक्षककोशिका प्रवास निरोधात्मक कारक (MIF 19-27) और न्यूयॉर्क-ESO- से ली गई उन के रूप में 01 परिसरों एक 157-165 एक प्रभावी विरोधी ट्यूमर सीटीएल प्रतिक्रिया के अभाव में पता लगाने और स्तन कैंसर की कोशिकाओं के विनाश के लिए सक्षम है। बरकरार वर्ग मैं एचएलए / पेप्टाइड परिसरों स्तन कैंसर की कोशिकाओं द्वारा शेड और संभावित रूप से प्रासंगिक कैंसर बायोमार्कर का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। इस काम के निदान के कैंसर के लिए एक सफलता बायोमार्कर स्क्रीनिंग प्रणाली मेंटी सेल रिसेप्टर निर्देशित मोड प्रतिध्वनि (जीएमआर) सेंसर प्रौद्योगिकी के उपयोग के लिए एक उपन्यास, लेबल से मुक्त biosensor के साथ संयुक्त नकल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी शामिल है प्रस्तुत किया है। शेड MIF / एचएलए-ए की पहचान * 02: एमडीए MB-231 सेल supernatants में 01 परिसरों, मानव सीरम नुकीला, और रोगी प्लाज्मा प्रदर्शन किया है। इस काम के प्रभाव को लक्षित immunotherapies के लिए साथी रोग निदान के विकास के माध्यम से व्यक्तिगत चिकित्सा क्रांति आ सकती है।

Introduction

वर्ग मैं मानव ल्युकोसैट प्रतिजन (एचएलए) नमूने के intracellular प्रोटीन प्रदर्शनों की सूची के proteasomal गिरावट से व्युत्पन्न लंबाई में 8-11 अमीनो एसिड के पेप्टाइड्स और हर एकल कोशिका 1,2 की सतह पर इन पेप्टाइड्स प्रस्तुत करता है। एचएलए जटिल परिसंचारी साइटोटोक्सिक टी lymphocytes (सीटीएल) से (चित्रा 1) प्रत्येक कोशिका के स्वास्थ्य का संकेत "प्रकृति के बायोमार्कर," है। सीटीएल द्वारा हमलावर सेल के उन्मूलन में रोग जुड़े पेप्टाइड्स परिणामों की मान्यता। इस प्रकार, अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया वायरल संक्रमण और ट्यूमर को नष्ट करने में अत्यधिक प्रभावी है। हालांकि, प्रतिरक्षा प्रणाली को अक्सर एक प्रभावी सीटीएल प्रतिक्रिया से बच रहा करने में सक्षम वायरस या ट्यूमर के लिए चयन को बढ़ावा देता है जो दबाव डाल रही है। नकल उतार टी सेल रिसेप्टर (TCRm) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशिष्ट पेप्टाइड / एचएलए-ए * 02 को पहचान जो (MABS): ऐसे स्तन कैंसर से जुड़े प्रोटीन, बृहतभक्षककोशिका प्रवास निरोधात्मक कारक से ली गई उन के रूप में 01 परिसरों (MIF19-27) 3 और न्यूयॉर्क-ESO -1 157-165, सीटीएल 4,5 प्रतिक्रिया एक प्रभावी विरोधी ट्यूमर के अभाव में पता लगाने और स्तन कैंसर की कोशिकाओं के विनाश के लिए सक्षम है। यह प्रतिनिधि काम जनसंख्या का 30% तक द्वारा व्यक्त की है जो एचएलए-ए * 0201 अणु, पर केंद्रित है। हालांकि, TCRm के उत्पादन के द्वारा पीछा अन्य प्रासंगिक एचएलए / पेप्टाइड परिसरों की पहचान, एक बहुत व्यापक आबादी को इस कार्य की उपयोगिता का विस्तार, लक्षित immunotherapies और साथी रोग निदान के विकास के लिए सक्षम बनाता है।

कोशिका की सतह के लिए बाध्य पेप्टाइड / एचएलए परिसरों के एक हिस्से प्लाज्मा में जारी की है। कारण एचएलए जुड़े बायोमार्कर के लिए immunopeptidome खनन के लिए पेप्टाइड / एचएलए पूल, मौजूदा तरीकों की अत्यधिक जटिल प्रकृति के लिए समय लगता है। इस प्रक्रिया प्लाज्मा से घुलनशील एचएलए की आत्मीयता शुद्धि की आवश्यकता है, रिवर्स चरण उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा एचएलए एसोसिएटेड पेप्टाइड्स की जुदाईमिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस / एमएस) 6,7 द्वारा (आरपी-एचपीएलसी) और पेप्टाइड अनुक्रमण। इस प्रक्रिया के उपन्यास चिकित्सीय लक्ष्य की खोज के लिए एक व्यवहार्य विकल्प है, यह पहले से ही उपचारात्मक टीका या बायोफर्मासिटिकल पाइपलाइन 8-10 में एचएलए एसोसिएटेड लक्ष्यों के लिए एक साथी नैदानिक ​​उपकरण के रूप में एक बोझिल प्रक्रिया है। इन लक्ष्यों को प्रासंगिक क्लिनिकल परीक्षण में रोगियों stratifying और अधिक सूचित चिकित्सकीय विकल्प प्रदान करने के उद्देश्य से तेजी साथी नैदानिक ​​विकास के लिए उपकरण उपलब्ध कराने के खिलाफ TCRm का निर्देशन किया।

इस काम में, कैंसर निदान के लिए एक सफलता बायोमार्कर स्क्रीनिंग प्रणाली TCRm और कम से कम प्रसंस्करण कदम के साथ जैविक बातचीत पर नज़र रखता है कि एक लेबल से मुक्त bioassay प्रणाली का इस्तेमाल करता है जो प्रस्तुत किया है। लेबल से मुक्त bioassay प्रणाली ढांकता हुआ waveguide के gratings के 11-14 में होता है कि निर्देशित मोड प्रतिध्वनि (जीएमआर) प्रभाव का इस्तेमाल करता है जो एक विधि पर आधारित है। जब ब्रॉडबैंड प्रकाश संपर्कों diffractiveइस प्रणाली के लिए आवश्यक प्लेटों में झंझरी, दो विशिष्ट तरंग दैर्ध्य परिलक्षित होते हैं। एक स्थिर रिसेप्टर और उसके ligand के बीच बाध्यकारी बातचीत एक स्पेक्ट्रम विश्लेषक 12 के साथ गूंज तरंगदैर्ध्य पारी पर नज़र रखने से वास्तविक समय में निगरानी रखी जाती है। अलग गूंज चोटियों घटना ते (घटना के विमान को सामान्य बिजली वेक्टर) और टीएम (घटना के विमान को सामान्य चुंबकीय वेक्टर) संभावित पता लगाने सटीकता 11,14 वृद्धि कर सकते हैं कि कई डेटा बिंदुओं को उपलब्ध कराने के ध्रुवीकरण राज्यों के लिए होते हैं। इस लेबल से मुक्त परख प्रणाली में एंटीबॉडी पूर्व अवगत प्लेट का उपयोग, डेटा विश्लेषण के साथ परख चलाते समय लगभग 45 मिनट है। इसके अलावा, कई रोगी के नमूने एक HPLC-एमएस / एमएस आधारित प्रारूप पर, एक 96- या 384 अच्छी तरह प्रारूप में एक स्पष्ट लाभ पूछताछ की जा सकती है।

Protocol

आचार बयान: डी-पहचान मानव ऊतक और प्लाज्मा के नमूने एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड के तहत Hendrick मेडिकल सेंटर से प्राप्त किया गया प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी।

Biotinylated एंटीबॉडी के 1. वृद्धि

नोट: इस कदम की निगरानी वैकल्पिक है। निगरानी नहीं अगर वैकल्पिक प्रोटोकॉल देखें।

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध avidin व्युत्पन्न लेपित प्लेट (सामग्री और उपकरण तालिका देखें) प्राप्त करते हैं।
  2. वेल्स को 50 μl फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) पीएच 7.2 जोड़ें।
    नोट: 28 डिग्री सेल्सियस पर Preincubate पीबीएस तापमान संबंधित गूंज पारियों को कम से कम करने के लिए।
  3. ओपन bioassay स्कैनर सॉफ्टवेयर और कारतूस, मानकों के चयन और नमूने थाली लेआउट में, तापमान की स्थापना (28 डिग्री सेल्सियस), न्यूनतम प्रति स्कैन की संख्या भी शामिल है जो प्रायोगिक प्रक्रिया को परिभाषित करने के लिए सेटअप विज़ार्ड का पालन (1), और प्रयोग की लंबाई ( 150 मिनट के प्रारंभिक चरणों के लिए समायोजित करने के लिए)। लेबल मुक्त bioassay स्कैनर में तैयार परख थाली डालें और पहले स्कैन शुरू करते हैं। पहला स्कैन पूरा हो गया है, "शुरू करने के लिए स्वयं संदर्भ" का चयन करें। आधारभूत प्रयोग के शुरू में एकत्र स्कैन की प्रारंभिक सेट है। यह इस विशिष्ट प्लेट पर प्रदर्शन पहले पढ़ा है, तो स्कैनर तापमान संतुलित करना और आधारभूत में बहाव को खत्म करने के लिए चलाने के लिए अनुमति देते हैं। नमूना अलावा द्वारा पीछा एक आधारभूत का स्क्रीनशॉट के लिए चित्र 2 देखें।
  4. आधारभूत स्थिर है, या कम से कम 5 स्कैन के बाद, पढ़ें थामने के लिए और प्लेट बाहर निकालें।
  5. सिंक में डंपिंग से पीबीएस निकालें और थाली पर नियंत्रण कुओं, लेकिन सभी के लिए [पीबीएस पीएच 7.2 में 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /] पर 50 μl RL21A biotinylated एंटीबॉडी जोड़ें। नियंत्रण वेल्स को 50 μl पीबीएस जोड़ें।
  6. वापस bioassay स्कैनर में थाली डालें और संतृप्ति, लगभग 1.5 घंटा तक पहुँच जाता है पढ़ने को फिर से शुरू।
  7. पढ़ें रोकें और प्लेट बाहर निकालें।
  8. धोएं प्लेट 200 μl 200 μl / अच्छी तरह से पीबीएस पीएच 7.2 से 3 rinses के द्वारा पीछा / अच्छी तरह से फॉस्फेट बफर खारा + 0.05% बीच 20 (PBST) के साथ तीन बार। पीबीएस के साथ दोहराएँ। अगले कदम के लिए चलती करने से पहले कागज तौलिए पर थाली से अतिरिक्त पीबीएस ठोकर।
    नोट: यह कदम एक स्वचालित थाली वॉशर पर प्रदर्शन या एक सिंक में तरल डंपिंग और एक विंदुक के साथ PBST जगह से थाली 200 μl PBST के साथ तीन बार धोने जा सकता है।
  9. सभी सक्रिय वेल्स को 50 μl पीबीएस पीएच 7.2 जोड़ें।
  10. वापस bioassay स्कैनर में थाली डालें और बाद धो गूंज नजर रखने के लिए पढ़ने जारी रखें।
  11. पढ़ें बंद करो और प्लेट बाहर निकालें।

चरण 1 के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल:

  1. सभी कुओं के लिए [10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पीबीएस] पर 50 μl RL21A biotinylated एंटीबॉडी जोड़ें।
  2. 1.5 घंटा या रात में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  3. 200 μl के साथ थाली तीन बार धोएं / अच्छी तरह से PBST कदम 1.9 में के रूप में 200 μl / अच्छी तरह से पीबीएस के साथ तीन rinses के द्वारा पीछा किया।
analyte की jove_title "> दो। इसके अलावा

  1. पीबीएस निकालें और उपयुक्त परख बफर के प्रति अच्छी तरह से 50 μl जोड़ें। इस परख के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामान्य मानव सीरम पीबीएस में पतला 01:20 इस्तेमाल किया गया था।
  2. ओपन bioassay स्कैनर सॉफ्टवेयर प्रायोगिक प्रक्रिया को परिभाषित करने के लिए सेटअप विज़ार्ड का पालन करें और।
  3. Bioassay स्कैनर में थाली डालें और एक आधारभूत पढ़ने के लिए शुरू। यह इस विशिष्ट प्लेट पर प्रदर्शन पहले पढ़ा है, तो तापमान संतुलित करना और आधारभूत में बहाव को खत्म करने के लिए स्कैनर चलाते हैं।
  4. आधारभूत स्थिर है, या कम से कम 5 स्कैन के बाद, पढ़ें थामने के लिए और प्लेट बाहर निकालें।
  5. कुओं से परख बफर निकालें।
  6. साथ स्पाइक नियंत्रण एचएलए एक * 02: [0.625-10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /] से परख बफर में लेकर प्रासंगिक (FLSL) या सांद्रता में अप्रासंगिक (SLLV, YLEV, या KVL) पेप्टाइड्स असर 01 मोनोमर। थाली के नियंत्रण वेल्स को मानकों के 50 μl जोड़ें
  7. नमूने के लिए परख बफर में विश्लेष्य के 50 μl जोड़ेंथाली के कुओं। इस परख के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव सीरम इस्तेमाल किया गया था नुकीला।
  8. लगभग 30-60 मिनट वापस bioassay स्कैनर में थाली डालें और संतृप्ति तक पहुँच जाता है पढ़ने को फिर से शुरू।
  9. पढ़ें रोकें और प्लेट बाहर निकालें।
  10. 200 μl के साथ थाली तीन बार धोएं / अच्छी तरह से PBST कदम 1.9 में के रूप में 200 μl / अच्छी तरह से पीबीएस के साथ तीन rinses के द्वारा पीछा किया।
  11. सभी सक्रिय वेल्स को 50 μl परख बफर जोड़ें।
  12. वापस bioassay स्कैनर में थाली डालें और बाद धो गूंज नजर रखने के लिए पढ़ने जारी रखें।
  13. पढ़ें बंद करो और प्लेट बाहर निकालें।
    नोट: परख बफर पीबीएस, टिशू कल्चर मीडिया, या परख के लक्ष्य के आधार पर पीबीएस में 01:20 पतला मानव सीरम हो सकता है।

3. डेटा विश्लेषण

  1. Bioassay स्कैनर सॉफ्टवेयर या निर्यात वरीय सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए कच्चे डेटा फ़ाइलों का उपयोग का विश्लेषण करें। bioassay स्कैनर सॉफ्टवेयर स्वतः के आधार पर बाध्यकारी वक्र उत्पन्न करता हैप्रयोगात्मक सेटअप के दौरान प्रदान की थाली लेआउट।
    नोट: विश्लेषण के लिए bioassay स्कैनर सॉफ्टवेयर का उपयोग नहीं करते हैं, तो चरणों 3.2-3.4 का पालन करें।
  2. प्रत्येक बाद डेटा बिंदु से आधारभूत और नकारात्मक नियंत्रण घटाना।
  3. हर समय बिंदु पर दोहराने के कुओं के लिए मतलब है और मानक विचलन की गणना।
  4. बार रेखांकन के लिए बाध्यकारी वक्र या चयन अंत बिंदु डेटा का ग्राफ उत्पन्न करता है।

Representative Results

01 अणु 3: प्रयोगों का एक प्रतिनिधि सेट एचएलए-ए * 02 के संदर्भ में अच्छी तरह से विशेषता TCRm, RL21A, विशेष रूप से एक पेप्टाइड को पहचानता है, जो एक murine IgG2a मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (MIF 19-27 या FLSL) का उपयोग किया गया था। आत्मीय पेप्टाइड / एचएलए मोनोमर, साथ ही अप्रासंगिक एचएलए मोनोमर 15, वर्णित प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। तीन परख प्रारूप दिखाता है चित्रा।

RL21A अन्य पेप्टाइड / एचएलए तीन परिसरों के साथ थोड़ा पार जेट के साथ FLSL / एचएलए monomer के लिए विशिष्ट है। इस विशिष्टता लेबल से मुक्त bioassay प्रणाली (चित्रा 4) का उपयोग recapitulated है। स्थिर FLSL / एचएलए मोनोमर (चित्रा 5) पर RL21A एंटीबॉडी का अनुमापन द्वारा निर्धारित रूप में इस प्रयोग के लिए लेबल मुक्त bioassay प्रणाली की संवेदनशीलता कम nanomolar रेंज में है। पृष्ठभूमि संकेत काफी सीरम नमूनों में वृद्धि हुई है, यद्यपि हैनुकीला मानव सीरम में FLSL / एचएलए monomer के pecific पता लगाने चित्रा 6 में हासिल की है और एक एकाग्रता ढाल आसानी से discernable इन नमूनों में है। अंत में, एमडीए MB-231 सेल लाइन से supernatants, पहले FLSL / एचएलए-ए * 02 पेश करने के लिए दिखाया गया है: 01 अणु, इस लेबल मुक्त परख मंच (चित्रा 7) का उपयोग घुलनशील FLSL मोनोमर को रोकने के लिए दिखाए जाते हैं। FLSL / एचएलए monomer के बाद के अलावा RL21A पर संकेत (चित्रा 7) बढ़ जाती है। कारण प्रणाली की संवेदनशीलता को अच्छी तरह से करने के लिए आंकड़े 4 और 5 में मानक विचलन के एक समारोह के रूप में देखा के रूप में तापमान में उतार-चढ़ाव का एक परिणाम के रूप में हो सकता नकारात्मक गूंज पारियों सहित अच्छी तरह से बदलाव के लिए। इन बदलावों कमरे के तापमान से कुछ अधिक (यानी, 28 डिग्री सेल्सियस) में एक के तापमान पर सभी नमूनों और bioassay प्लेट रीडर के पूर्व ऊष्मायन से नाटकीय रूप से कम किया जा सकता है।

संक्षेप में 8 चित्रा, में, 96-well योग्य polystyrene प्लेटों के साथ लेपित रहे थे [10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /] RL21A की PBST के साथ धोया 0.5% कम वसा वाले दूध, साथ अवरुद्ध और के धारावाहिक dilutions के साथ कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए incubated PBST के साथ धोया कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए, सामान्य मानव सीरम में FLSL एचएलए मोनोमर एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए पीबीएस में 01:10 पतला या रोगी प्लाज्मा पीबीएस में 01:10 पतला। बरकरार एचएलए पता लगाने के लिए, और PBST में धोया: थाली PBST के साथ धोया गया था, खरगोश विरोधी मानव β2 माइक्रोग्लोब्युलिन [5000 1] के साथ कमरे के तापमान पर एक घंटा incubated। प्लेट्स तो बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी [1: 10,000] के साथ 30 मिनट के लिए incubated रहे थे और PBST के साथ धोया। वर्णमिति पता लगाने ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-सल्फोनिक एसिड] -diammonium नमक) एक 15 मिनट ऊष्मायन समय के साथ सब्सट्रेट और एक microplate पाठक पर 405 एनएम पर मनाया उपयोग किया गया था। FLSL / एचएलए तीन मरीज के नमूनों में पाया गया था।

चित्रा 8B में, रोगी प्लाज्मा RL.064 पीबीएस में 01:20 पतला और फिर जोड़ दिया गया थाथाली करने के लिए एड और 60 मिनट के लिए लेबल से मुक्त डिटेक्टर पर नजर रखी। रोगी सीरम में FLSL / एचएलए परिसर के विशिष्ट पहचान पूरा किया गया। छात्र के टी परीक्षण रेखांकन और आँकड़े सॉफ्टवेयर (पी <0.05) का उपयोग किया गया था।

चित्रा 8C में, ऊतक वर्गों माउस एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में विरोधी एचएलए-ए 2 (BB7.2), RL21A, IgG2b और IgG2a क्रमशः के रूप में नकारात्मक नियंत्रण के साथ एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / पर दाग रहे थे। धुंधला निर्माता द्वारा निर्देशित के रूप में परमाणु धुंधला के लिए एक विरोधी माउस का पता लगाने किट, थपका (diaminobenzadine), और hematoxylin क्यु का उपयोग करते हुए पाया गया। RL21A से ट्यूमर के ऊतक का धुंधला FLSL / एचएलए परिसरों की प्रस्तुति की पुष्टि करता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। वर्ग मैं मानव ल्युकोसैट प्रतिजन द्वारा ट्यूमर प्रतिजन प्रस्तुति कैंसर परिवर्तन एक intracellular विकार है। एचएलए नमूना intracellulगिरफ्तारी प्रोटीन और कोशिका की सतह पर कैंसर संबंधी परिवर्तन प्रकट करते हैं। सीटीएल और TCRm उन कोशिकाओं को अलग एचएलए-पेप्टाइड परिसरों के माध्यम से कैंसर कोशिकाओं को पहचान करने में सक्षम हैं।

चित्र 2
चित्रा 2:। प्रारंभिक आधारभूत दिखा डाटा अधिग्रहण की bioassay स्कैनर सॉफ्टवेयर में डाटा अधिग्रहण का स्क्रीनशॉट उदाहरण FLSL / एचएलए परिसर के 10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के साथ लेपित एक थाली में RL21A एंटीबॉडी अलावा द्वारा पीछा स्कैन। एंटीबॉडी की सांद्रता के रूप में संकेत कर रहे हैं। प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्ति को अच्छी तरह से समय के साथ नजर रखी प्रतिनिधित्व करता है।

चित्र तीन
चित्रा 3:। परख थाली पर कब्जा रिलायंस एनर्जी के diffractive झंझरी सतह पर स्थिर एंटीबॉडी की परख प्रारूप चित्रणevant पेप्टाइड / समाधान में एचएलए परिसरों।

चित्रा 4
चित्रा 4:। अप्रासंगिक एचएलए मोनोमर (YLEV, SLLV, और KVL) की तुलना में अपने प्रासंगिक (FLSL) एचएलए monomer के लिए biotinylated RL21A TCRm की विशिष्टता के FLSL / एचएलए जटिल प्रदर्शन के लिए RL21A की विशिष्टता। Biotinylated RL21A TCRm [10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /] avidin लेपित परख थाली सतह पर स्थिर किया गया था और पहचान पीबीएस में लेबल हटाया गया प्रासंगिक या अप्रासंगिक एचएलए मोनोमर [10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /] का उपयोग किया गया था। RL21A FLSL / एचएलए परिसर के लिए विशिष्ट था। दो-तरफा एनोवा रेखांकन और आँकड़े सॉफ्टवेयर (पी <0.001) का उपयोग किया गया था।

चित्रा 5
चित्रा 5:। Detecti के अपने आत्मीय पेप्टाइड / एचएलए परिसर के RL21A की संवेदनशीलता बंधन चित्रणसीमा और FLSL / एचएलए परिसर के RL21A की संवेदनशीलता बाध्यकारी पर। Biotinylated एचएलए Monomer FLSL [10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /] परख थाली सतह पर स्थिर किया गया था और संकेत के रूप में लेबल हटाया गया RL21A पीबीएस में धारावाहिक dilutions में थाली करने के लिए जोड़ा गया है। इस प्रणाली के लिए डिटेक्शन कम nanomolar रेंज में था।

चित्रा 6
चित्रा 6:। मानव सीरम में एचएलए का पता लगाने का नुकीला मानव सीरम प्रदर्शन में एचएलए परिसर की जांच। Biotinylated RL21A TCRm [10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /] avidin लेपित परख थाली सतह पर स्थिर हो गया था। प्रासंगिक (FLSL) या अप्रासंगिक (SLLV) एचएलए मोनोमर के साथ नुकीला जमा सामान्य मानव सीरम पीबीएस में 01:20 पतला और फिर थाली करने के लिए जोड़ा गया है और 60 मिनट के लिए लेबल से मुक्त डिटेक्टर पर नजर रखी थी। मानव सीरम में FLSL / एचएलए परिसर के विशिष्ट पहचान पूरा किया गया। सामान्य तौर पर, पृष्ठभूमि संकेत (अप्रासंगिक SLLV मोनोमर) उच्च हैएर पतला सीरम नमूनों के लिए पीबीएस में शुद्ध analytes (चित्रा 4 देखें) की तुलना में। दो-तरफा एनोवा रेखांकन और आँकड़े सॉफ्टवेयर (पी <.0001) का उपयोग किया गया था।

चित्रा 7
चित्रा 7:। घुलनशील एचएलए परिसरों स्तन कैंसर सेल संस्कृति supernatants में पाया गया कि स्तन कैंसर सेल supernatants में एचएलए पता लगाने की क्षमता का प्रदर्शन किया है। Biotinylated RL21A TCRm, RL9A TCRm (नकारात्मक नियंत्रण), और एक निर्धारण नियंत्रण परख थाली सतह पर स्थिर रहे थे। नुकीला [5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /] और unspiked एमडीए-231 सेल संस्कृति supernatants जोड़ा गया था और लेबल से मुक्त डिटेक्टर पर 60 मिनट के लिए नजर रखी थी बाध्यकारी। FLSL और SLLV एचएलए मोनोमर नमूने RL9A और RL21A बंधन के लिए सकारात्मक नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं नुकीला। एक तरह से एनोवा रेखांकन और आँकड़े सॉफ्टवेयर (पी <.0001) का उपयोग किया गया था।


चित्रा 8:। रोगी के नमूने में FLSL / एचएलए परिसरों की विशिष्ट पहचान (ए) immunosorbent परख (एलिसा) जुड़े पारंपरिक एनजाइम रोगी प्लाज्मा में FLSL / एचएलए विशिष्ट परिसरों का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था। (बी) Biotinylated RL21A TCRm या IgG2a [10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम /] avidin परख थाली पर स्थिर हो गया था। रोगी RL.064 से (सी) स्तन ट्यूमर के ऊतक पहले से FLSL / एचएलए परिसरों के ट्यूमर प्रस्तुति को सत्यापित करने के लिए 3 के रूप में वर्णित सना हुआ था। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

इस के साथ साथ वर्णित विधि एक उच्च throughput में रोगी सीरम, प्लाज्मा, मूत्र या लार के नमूनों में घुलनशील पेप्टाइड / एचएलए परिसरों का तेजी से पता लगाने के लिए सक्षम 96- ​​या 384 अच्छी तरह प्रारूप होता है कि कैंसर के निदान के लिए एक बायोमार्कर स्क्रीनिंग प्रणाली का परिचय। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और एक लेबल से मुक्त पहचान प्रणाली की नकल उतार टी सेल रिसेप्टर उपयोग यह परख प्रणाली पारंपरिक एलिसा द्वारा 3.5 घंटा की तुलना में कम से कम एक घंटा के लिए विश्लेषण समय काटता है। इस उच्च throughput दृष्टिकोण चिकित्सीय कैंसर के टीके या बायोफार्मास्यूटिकल्स के लिए क्लिनिकल परीक्षण के लिए रोगियों का तेजी से स्तरीकरण सक्षम बनाता है। इन रोग लक्ष्यों का पता लगाने के लिए मौजूदा तरीकों व्यक्ति रोगी के नमूने, एक बोझिल और समय लेने वाली प्रक्रिया की आत्मीयता शुद्धि और HPLC-एमएस / एमएस की आवश्यकता होती है। इस विधि पारंपरिक एलिसा तकनीक के लिए उत्तरदायी है, चिंता इस तरह के विरोधी β2 माइक्रोग्लोब्युलिन एंटीबॉडी के रूप में माध्यमिक पता लगाने अभिकर्मकों नवजात एच एल की संरचना को बदल सकता है कि वहाँ हैएक अणु और TCRm सीमित पता लगाने के लिए बाध्य रोकती हैं। लेबल मुक्त पता लगाने के लिए इन चिंताओं को दूर करता। यह प्रक्रिया एक ऐसी सतह plasmon अनुनाद प्रणाली के रूप में अन्य लेबल से मुक्त सिस्टम पर उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है। बहरहाल, यह बहुत इस अध्ययन में इस्तेमाल bioassay प्रणाली की तुलना में उच्च throughput क्षमताओं को कम करेगा।

इस प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से कुछ महत्वपूर्ण कदम के पालन के साथ रोगी सीरम और प्लाज्मा में गैर एचएलए बायोमार्कर का पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक <200 बजे पारी संभावना बाद में पता लगाने के कदम के लिए कम संकेत में परिणाम देगा के रूप में प्रारंभिक एंटीबॉडी कोटिंग की प्रक्रिया की निगरानी, ​​सतह के अनुकूलन के लिए सिफारिश की है। सीरम प्रोटीन की प्रचुरता कम एकाग्रता विश्लेष्य के बंधन मुखौटा हो सकता है के रूप में आधारभूत और बाद धो पढ़ता समापन बिंदु विश्लेषण के लिए उपयोगी होते हैं। अंत में, नमूने के तापमान परिवर्तन में अच्छी तरह से अच्छी तरह से बदलाव के लिए हो सकता है। यह सभी नमूने एक पूर्व incubated जा सिफारिश की है किडी लेबल मुक्त biosassay इकाई तापमान नियंत्रक कमरे के तापमान के ऊपर 2-3 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया जा। प्रशीतित नमूने ऑपरेटिंग तापमान तक पहुँचने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दी जानी चाहिए।

इस प्रोटोकॉल के भविष्य संशोधनों थाली सतह पर TCRm की बहुसंकेतन शामिल होंगे। bioassay प्रणाली में कम से कम आठ-Plex के घनत्व पर कुओं की खोलना करने के लिए वर्तमान में उत्तरदायी है। परीक्षण नमूना संस्करणों के अनुसार, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 4-8 TCRm शुरू करने से कम है और रोगी के प्रति तेजी से जटिल डेटा के संग्रह के लिए सक्षम कर रहे हैं। यह क्षमता आगे चिकित्सीय विकल्पों के संबंध में रोगियों को सूचित कर सकता है।

Disclosures

लेखकों, डेबरा Wawro Weidanz और रॉबर्ट Magnusson, इस लेख में इस्तेमाल bioassay प्लेट रीडर और परख प्लेटों का उत्पादन जो गुंजयमान सेंसर शामिल किया, पर क्रमश: मुख्य कार्यकारी अधिकारी और मुख्य प्रौद्योगिकी अधिकारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ResoSens Label-free Bioassay Detection System Resonant Sensors Incorporated
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates Resonant Sensors Incorporated
ResoVu software Resonant Sensors Incorporated
RL21A Biotinylated TCRm mAb  PureMHC, LLC
RL9A Biotinylated TCRm mAb  PureMHC, LLC
FLSL HLA-A*02:01 Monomer  Experimmune full peptide sequence: FLSELTQQL
SLLV HLA-A*02:01 Monomer  Experimmune full peptide sequence: SLLMWITQV
YLEV HLA-A*02:01 Monomer  Experimmune full peptide sequence: YLEPGPVTV
KVL HLA-A*02:01 Monomer  Experimmune full peptide sequence: KVLEYVIKV
Pooled Normal Human Serum  ThermoFisher BP2657100
MDA-MB-231 Cell Supernatant ATCC HTB-26 Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) Life Technologies 12440-053
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10082-147
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-63
Sodium Hydroxide ThermoFisher 5318-1
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher BP665-1
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) ThermoFisher BP337-500
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) ThermoFisher 37615
rabbit anti-human β2 microglobulin  Dako A0072
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG  Jackson Immunoresearch 111-035-144
Nunc  microplates ThermoFisher 439454
Synergy 2 microplate reader Biotek
Immpress Reagent Kit Vector MP-7402
Immpact DAB Vector SK-4105
Hematoxylin QS Vector H3403
IgG2a MP BioMedicals 50328
IgG2b MP BioMedicals 50330
anti-HLA-A2 (BB7.2) Experimmune
Prism 5 Graphpad

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References

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लेबल मुक्त Biosensor प्रौद्योगिकी का उपयोग स्तन कैंसर में मानव ल्युकोसैट प्रतिजन biomarkers की डिटेक्शन
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Weidanz, J. A., Doll, K. L., Mohana-Sundaram, S., Wichner, T., Lowe, D. B., Gimlin, S., Wawro Weidanz, D., Magnusson, R., Hawkins, O. E. Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology. J. Vis. Exp. (97), e52159, doi:10.3791/52159 (2015).More

Weidanz, J. A., Doll, K. L., Mohana-Sundaram, S., Wichner, T., Lowe, D. B., Gimlin, S., Wawro Weidanz, D., Magnusson, R., Hawkins, O. E. Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology. J. Vis. Exp. (97), e52159, doi:10.3791/52159 (2015).

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