Abstract
Alopezie ist eine häufige Form des Haarausfalls, die in vielen verschiedenen Bedingungen, einschließlich der männlichen Haarausfall, Syndrom der polyzystischen Ovarien und Alopecia areata auftreten können. Alopezie kann auch als Nebenwirkung der Chemotherapie bei Krebspatienten auftreten. In dieser Studie war es unser Ziel, eine konsistente und zuverlässige Methode, um Haarausfall bei Mäusen, die es erlauben Forschern, genau zu beurteilen und vergleichen Sie neue Therapieansätze für diese verschiedenen Formen von Haarausfall wird quantifizieren zu entwickeln. Das Verfahren nutzt ein Gel Standardbildgeber, um Bilder von Mäusen erhalten und verarbeiten, die Messung der Lichtabsorption, die in groben Verhältnis zu der Menge von Schwarz (oder Grau) Haar auf der Maus erfolgt. Daten, die auf diese Weise quantitativ bestimmt worden ist, kann dann unter Verwendung von statistischen Standardtechniken (dh, ANOVA, t-Test) analysiert. Diese Methode wurde in Mausmodellen von Chemotherapie-induzierter Alopezie, Alopecia areata und Alopecia aus Wachsen getestet. In diesem Bericht ist die detaillierte Protokoll prestierten zur Durchführung dieser Messungen, einschließlich der Validierung Daten von C57BL / 6 und C3H / HeJ-Mausstämme. Dieses neue Verfahren bietet eine Reihe von Vorteilen auf, einschließlich der relativen Einfachheit der Anwendung, der Verlässlichkeit von Geräten, die in den meisten Laboratorien leicht verfügbar ist, und Anlegen eines objektive, quantitative Beurteilung, die robuster als die subjektiven Bewertungen ist. Verbesserungen bei der Quantifizierung von Haarwachstum bei Mäusen wird Studie von Alopecia Modelle zu verbessern und Auswertung der vielversprechende neue Therapien in präklinischen Studien.
Introduction
Alopezie (Haarausfall) kann eine psychologisch und emotional belastenden Ereignis mit mehreren Ursachen. GPH ist die häufigste Ursache von Haarausfall, die etwa zwei Drittel der Männer im Alter von 35 ein. Ein ähnliches Muster des Haarausfalls kann bei Frauen mit PCO-Syndrom beobachtet werden. In beiden dieser Erkrankungen wird der Haarausfall Androgenrezeptor vermittelten. Alopecia können auch als Autoimmunkrankheit, Alopezie areata, die 1,7% der Bevölkerung betroffen 2 auftreten. Alopezie kann als Nebeneffekt von einigen medizinischen Behandlungen, wie die Chemotherapie 3 auftreten. Ein hoher Prozentsatz (65-85%) der Chemotherapie-Patienten erleben ein gewisses Maß an Haarausfall 4,5. Die psychischen Folgen von Haarausfall sind gut in der Chemotherapie-Einstellung untersucht. Chemotherapie-induzierter Alopezie kann in Angst, Depression, ein negatives Körperbild, senkte das Selbstwertgefühl und einer verringerten Gefühl von Wohlbefinden 6,7 führen. Eine hohe percentage (47-58%) der weiblichen Krebspatienten überlegen Haarausfall um die traumatischen Aspekt der Chemotherapie sein und bis zu 8% Rückgang Behandlung aus Angst vor Haarausfall 4,6. Es gibt auch Hinweise in androgenetische Alopezie, die Therapie, psychologische und sogar medizinischen Folgen von Haarausfall 8,9 reduzieren unterstützen. Ebenso Alopecia areata wurde berichtet, dass schwere psychische Folgen 2 haben und die lückenhafte Natur der Haarausfall kann zu einer unangenehmen kosmetische Ergebnis als die meisten anderen Ursachen für Haarausfall führen.
Während Medikamente mit milden anti-androgenen Wirkungen (dh Spironolacton) hatten mit mäßigem Erfolg als Therapie für Alopezie verwendet wurde, das erste wirksame Medikament für Alopezie Minoxidil war 10. Diese antihypertensive hat eine beobachtete Nebenwirkung verursacht Haarwachstum, und wird nun als topische Therapie für viele Formen der Alopezie verwendet. Allerdings sind Reaktionen oft unvollständig, mit einigen Themen, die nur langsaming von Haarausfall statt tatsächlichen Nachwachsen 10. Finasterid ist ein kompetitiver Antagonist II 5α-Reduktase zu Dihydrotestosteron Typ blockier Umwandlung von Testosteron, was zu Verbesserungen in der androgenen Alopezie zu Lasten der Teil systemische Androgenblockade. Die Ansprechraten mit langfristigen (10 Jahre) Therapie sind etwa 50% 11. Insgesamt trotz beträchtlicher Forschung in diesem Bereich gibt es immer noch keine angemessene Therapie für Haarausfall.
Seit Jahrzehnten haben Forscher und Kliniker Methoden zur Messung der Kopfhaarwachstum in klinischen Studien untersucht. Mit der Entwicklung von Medikamenten, die Alopezie zu behandeln, hat es einen erhöhten Bedarf an zuverlässigen, wirtschaftlichen und minimal invasive Mittel zum Messen des Haarwuchses und insbesondere als Reaktion auf die Therapie. Bildanalysetechnik für eine genaue Quantifizierung der Haardichte bei Patienten mit Haarausfall Erkrankungen ergab konsistent und gültige Ergebnisse in der Vergangenheit unter Verwendung einer Vielzahl von techniques, einschließlich der Analyse der digitalisierten Bilder 12, Bildanalyse der einzelnen Haare und Hautläsionen 13 und mikroskopische Scannen in Haarmasse in einem definierten Kopfbereich 14 zu quantifizieren.
Leider, während die oben genannten Methoden haben verbesserte Beurteilung der Wirksamkeit für das Haarwachstum fördernden Eingriffe in klinischen Versuchen, in diesen Verfahren nicht auf Studien an Nagetieren in präklinischen Untersuchungen angewendet. Unser Ziel ist es, eine konsistente und zuverlässige Methode, um Haarausfall bei Mäusen, die es erlauben Ermittler genauer bewerten und zu vergleichen neue Therapieansätze für verschiedene Formen von Haarausfall wird quantifizieren zu entwickeln. Wir haben eine Methodik mit Hilfe von Geräten in den meisten Labors, die eine schnelle und zuverlässige Quantifizierung der Haardichte bei Mäusen mit braunen oder schwarzen Haares ermöglicht leicht verfügbar entwickelt. Diese Methode wurde in Maus-Modellen von chemotherapieinduzierter Alopezie, Alopecia areata und Alopecia von Waxin getestetg. Ein detailliertes Protokoll zur Durchführung dieser Messungen, einschließlich der Validierung Daten von C57BL / 6 und C3H / HeJ-Mäusestämme dargestellt. Da dieses Verfahren beruht auf der Erfassung der Lichtabsorption von Pigmenten in den Haarschaft, kann es nicht verwendet werden, um das Haarwachstum bei weißen Mäusen oder Albino Mäuse nachzuweisen.
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Protocol
Ethik Hinweise: Alle Studien, die Tiere müssen von der IACUC der Einrichtung genehmigt werden (für die folgenden Daten wurden Protokolle durch die Montefiore IACUC, Protokoll # 11-6-240 und 13-7-100 # zugelassen). Tiere sind vorhanden Licht Anästhesie für den alleinigen Zweck halten sie noch während der Aufnahme angezeigt wird, gibt es keine schmerzhaften Eingriffen für dieses Protokoll erforderlich.
1. Erwerb von Fotografien
- Stellen Sie Fokus und Sichtfeld für Gel-Imager Papier mit gedrucktem Text. Stellen Sie sicher, Gleichmäßigkeit der Lichtquelle über fotografiert Region. Um sicherzustellen, Einheitlichkeit, mit einem Gel-Imager mit in Lichtquelle für reflektierende photography eine gebaut. Verwenden Sie keinen Durchlichtquelle, da dies eine Silhouette des Tieres, die für die weitere Analyse ungeeignet ist Graustufen erstellen.
Hinweis: Dadurch wird die Maus leicht unscharf, die optische Mittel in der Region of Interest (ROI) bietet Platz und wirdHilfe Quanten Fehler zu reduzieren für sehr kleine (dh <10 Pixel) Bereiche von Interesse. Größere Bereiche von Interesse werden durch diese geringfügige Fokussierungseinstellung beeinträchtigt werden, noch werden sie durch Unterschiede in der Größe des Tieres berührt. - Anesthetize Tiere unter Verwendung von Ketamin (100 mg / ml) / Xylazin (20 mg / ml) (2: 1), da dies eine schnelle Anästhesiewirkung und eine schnelle Wiederherstellung und ist optimal für das Fotografieren mehrerer Tiere.
HINWEIS: Anesthesia wird bestätigt, wenn das Tier noch genug Fotografie ermöglichen. Da die Tiere in der Regel von dieser Licht Anästhesie innerhalb von 10-15 Minuten zu erholen, hat der Tierarzt nicht empfohlen Nutzung von Augensalben. - Zeigen narkotisierten Tiere auf Gel-Imager in vertikaler Ausrichtung (so nah wie möglich parallel).
- Für Rücken Fotografien, legen Sie die Tiere in Bauchlage mit Gliedmaßen erweitert.
- Für ventralen Fotografien, platzieren Tiere in Rückenlage, wobei darauf geachtet, dass die Tiere nicht seitlich gedreht.
- Zeigen Graustufen-Standard in fotografiert Region.
- Schließen Zugangstür. Wichtig: Umgebungslicht kann Schwankungen Exposition einzuführen.
- Stellen Sie Blende zu einer Exposition, die den interessierenden Bereich im linearen Bereich des Erwerbs setzt (Lesen F-Stop).
HINWEIS: Die meisten Systeme werden angezeigt, wo das Bild ist gesättigt. - Nehmen Sie Fotos.
- Ändern F-Stopp in einen anderen Belichtungseinstellung, die den interessierenden Bereich im linearen Bereich legt durch Erhöhung oder Verringerung der F-stop um 1, so dass sowohl die Standard- und die Region von Interesse in einer linearen Reihe von Erfassung (Referenz bleiben F- hör auf).
- Nehmen Sie Fotos.
- Sobald Fotografie abgeschlossen ist, legen Sie Tiere auf einem Tisch Erwärmung und zu überwachen, bis sie Brustlage halten kann. Zurück Tiere in ihre Käfige. Bringen Sie die Gruppe von Tieren auf das Vivarium, sobald alle Tiere vollständig erholt.
2. Quantifizierung der Lichtabsorption </ P>
- Mark Regionen von Interesse auf die Bilder der Tiere unter Verwendung mitgelieferte Software für die Gel-Imager.
- Für Ganztier Dorsalansicht verwenden einen rechteckigen oder ovalen Bild sich von dem oberen Schenkel an den unteren Extremitäten, die sich seitlich so weit wie möglich, so dass kein Teil der Schachtel erstreckt sich über den Rücken des Tieres, wie in 1A gezeigt.
HINWEIS: Man könnte auch markieren den Bereich von Interesse mit einem Freihand-Zeichenwerkzeug. - Für ganze Tier Ventralansicht Verwenden 2 Rechtecke: eine für den Beckenbereich und eine für den Brustbereich, wie in 1B gezeigt.
- Für eine kleinere Region von Interesse, dh, die Lage der Arzneimittelverabreichung, Marke entsprechend.
- Für Ganztier Dorsalansicht verwenden einen rechteckigen oder ovalen Bild sich von dem oberen Schenkel an den unteren Extremitäten, die sich seitlich so weit wie möglich, so dass kein Teil der Schachtel erstreckt sich über den Rücken des Tieres, wie in 1A gezeigt.
- Region Marke (n) von Interesse auf Graustufen Absorption Standard.
- Record Absorption von jeder der markierten Regionen von Interesse.
3. Analyse
Absorptionsniveaus obtained für die Regionen von Interesse können müssen, um den Hintergrund-Standard für den Vergleich zwischen Fotografien normalisiert werden. Die Beziehung der Belastung durch Absorption log-log (dh die Beziehung linear zwischen log (Exposition) und log (Absorption)). Unter Verwendung dieser Beziehung kann die Absorption der interessierenden Region normiert auf eine Standard-Hintergrundwert, der ermöglicht Absorptionen direkt zwischen verschiedenen Aufnahmen, einschließlich derjenigen, die zu verschiedenen Zeitpunkten (dh seriellen Messungen innerhalb eines Studienprotokoll) aufgenommen verglichen werden. Das Verfahren für die Durchführung dieser Korrekturen wird in optionalen Schritte 3.1 und 3.2 beschrieben.
- (Optional) Plot Kurve von log (Belichtung) gegen log (Absorption) mit Hilfe von Graustufen Absorption Standard erhaltenen Werte.
- (Optional) Stellen Sie Schwankungen in der Standard jedes Fotos, wie folgt:
- Wählen Sie F-Stop für das Lesen und F-Stop Referenz (wie in Schritt 1.6 festgelegt) (wie in s bestimmttep 1.8).
- Berechnen Sie die durchschnittliche Absorption der Standard in allen Aufnahmen am Lesen F-stop. Dieser Durchschnitt ist die Referenz-Standard-Wert (RSV).
- Berechnen Absorptionsdifferenz zwischen dem Lesen und Referenzblendeneinstellungen in jeder Photographie für den Standard (Delta-S) und für jeden definierten ROI (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
- Berechnen Sie die korrigierte Absorptions für jede ROI wie folgt: Korrigierte Absorption (ROI-X) = Absorption (ROI-X) im Lesen F-stop + (RSV - Aufnahme von Standard zu lesen F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
- Kompilieren experimentellen Daten und eine Datenanalyse unter Verwendung von statistischen Standardtechniken für kontinuierliche Variablen (das heißt, ANOVA, T-Test).
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Representative Results
Diese Technik wurde mit C3H / HeJ Mäusen eingepflanzt, die Maus-Modell der Alopecia areata 16 validiert. Diese Tiere entwickeln globale Haarausfall die nach und nach im Laufe der Zeit fortschreitet. Allerdings tritt der Haarausfall bei Patches, und können von der Maus zum nächsten variieren, die Einführung erhebliche Variabilität und erschweren qualitative Bewertungen. Dieses Modell eine Gelegenheit, um Korrelationen zwischen den Messungen der optischen Dichte an unterschiedlichen Stellen auf der Maus, wie die Beurteilung der Gültigkeit zu prüfen.
Die erste Frage war, ob Maßnahmen mit unterschiedlichen Belichtungen, Schwankungen der ROI Abgrenzung und ROI von nicht überlappenden Bereiche auf die gleiche Maus wurden korreliert. Es gab eine signifikante Korrelation (p <0,0001) gesehen Vergleichen ROIs von rechteckigen vs. oval Standards auf der dorsalen Oberfläche der Maus (4A) definiert. Ähnlich hohe Korrelationen wurden an verschiedenen Stellen auf dem Tier und in verschie gesehenmieten Exposition (nicht dargestellt). Dies zeigt einen hohen Grad an Genauigkeit in den Messungen. Es war auch eine signifikante Korrelation zwischen der Absorption bei Blende 2,0 vs. 1,2 auf der dorsalen Oberfläche des Rücken mit rechteckigen ROIs (p <0,0001, 4B). Eine signifikante Korrelation wurde beobachtet, selbst bei einem Vergleich zwischen den Absorptionsmessungen der dorsalen und ventralen Oberfläche der gleichen Maus (p <0,0001, 4C). Diese Daten belegen, daß Absorptionsmessungen von verschiedenen Stellen auf dem gleichen Tier entnommen werden korreliert, wie in dem C3H erwartet / HeJ transplantierten Maus-Modell, und diese Korrelationen bleiben linear über einen breiten Bereich von Haarausfall. Dies hilft zu etablieren Gültigkeit der Graustufenmessungen und legt auch die Robustheit dieses Verfahrens auf Schwankungen der Bildaufnahme und Analysetechnik.
Die zweite Frage war, ob es die Konsistenz zwischen Serienmessungen entnommendasselbe Tier zu verschiedenen Zeitpunkten. Um dies zu beurteilen, wurden Bilder erhalten C3H / HeJ-Mäusen eingepflanzt wöchentlich für 3 Wochen. Die C3H / HeJ-Maus eingepflanzt würden voraussichtlich schrittweise Haarausfall in dieser Zeit angezeigt werden. Graustufen-Analyse auf der Bauchseite (Brustbereich, kastenförmige ROI) zeigten diese erwartete Haarausfall, mit konsistenten Abwärtstrend von einem Zeitpunkt zum nächsten (Abbildung 5). Zu beachten ist, nur 80% der C3H / HeJ transplantierten Mäusen zeigen, Haarausfall, und die mit den höchsten Grauwerte haben diesen Rückgang nicht zeigen, sondern zeigen konsistente Ergebnisse über den Versuchszeitraum. Diese Konsistenz Maßnahme bei Tieren ohne Haarausfall wurde auch in C57BL / 6-Maus 19 bestätigt. Die gleiche Analyse auf dem Oberschenkelbereich des ventralen Oberfläche und auf der dorsalen Oberfläche zeigte vergleichbare Ergebnisse über die Zeit (nicht gezeigt).
Mit diesen ermutigenden Ergebnissen aus der Anwendung dieser Technik in C3H / HeJ transplantierten Tieren,Weitere Untersuchungen wurden in einem anderen Tiermodell, das einer Chemotherapie-induzierter Alopezie geführt. C57BL / 6-Mäuse, die 3 Wochenkurse von Cyclophosphamid erhalten, werden unterschiedlich entwickeln globale schütterem Haar und Depigmentierung. Die hierin beschriebene Graustufenanalysetechnik wurde eingesetzt, um diese Änderungen zu quantifizieren und Reaktion auf therapeutische Interventionen 17 beurteilen. In diesem Modell zeigte sich die Graustufenanalyse ein leistungsfähiges Werkzeug bei der Bereitstellung von quantitativen Bewertungen chemotherapiebedingter Änderung der Haarlack sein und gestattet die Überprüfung der Behandlungseffekte durch statistische Analyse. In einem anderen Modell der Chemotherapie Haarausfall, gab es besondere Herausforderungen bei der Nutzung dieses Graustufenanalyse. In diesem Modell werden die Tiere auf der dorsalen Oberfläche gewachst, um die Haarfollikel zu synchronisieren, dann mit einer einzigen Dosis von Cyclophosphamid 9 Tage später, als Haarfollikel Anagen VI Stufe eingegeben und sind maximal empfindlich gegen Chemotherapeutika 18 behandelt. Das gewachsteBereich ist der Bereich von Interesse für die Studie, aber der Bereich der Wachs könnte variabler Größe sein. Die Beschränkung der ROI innerhalb des gewachsten Region ermöglicht die Quantifizierung von sowohl Ausfall und Nachwachsen der Haare nach der Cyclophosphamid Verwaltung 19. Darüber hinaus ermöglicht das Verfahren eine genaue Beurteilung der Dosis-abhängige Unterschiede in der Behandlungsreaktion eines Versuchs Therapie. Diese Anwendung zeigt die Vorteile der mit Flexibilität bei der Definition des ROI in dieser Technik.
Zur weiteren Erläuterung der Anwendung dieser Technik, sofern eine zwischenzeitliche Analyse der Daten aus einer laufenden Studie in C57BL / 6 unter Verwendung des Protokolls der wöchentlichen Verabreichung Cyclophosphamid oben angegeben. 8 Wochen alten Mäusen wurden mit Vehikel oder 50 mg / kg / Woche für 3 Wochen Cyclophosphamid behandelt. Chemotherapie-behandelten Mäuse zeigten visuell erkennbar Haarverlust nach 2 Monaten, während Träger behandelten Tiere hatten ein normales Fell (6A). Graustufen-Analyse war progebildet, wie oben angegeben, die eine signifikante (p <0,05) Unterschied zwischen Chemotherapie Mäusen und Fahrzeugsteuerungen (6B).
Abbildung 1: Brutto Blick auf Haar Veränderungen auf der dorsalen und ventralen Oberfläche der C3H / HeJ Mäusen eingepflanzt, das Mausmodell für Alopecia areata Hinweis die Tiere entwickeln globale Haarausfall die nach und nach im Laufe der Zeit fortschreitet (A) Dorsalansicht, mit repräsentativen Abgrenzung.. von Regionen von Interesse (ROI) für Graustufen-Analyse, oval oder rechteckig, wie angegeben. (B) Ventralansicht mit verschiedenen Bereichen von Interesse für Graustufen-Analyse in der Brust, was einem unpräparierten Bereich oder Oberschenkel, was einer gepflegten Umgebung.
Abb. 2:. Pixel-Ebene auf Graustufen-Analyse vs. Tiffen Nummer Standard ein Standard Tiffen Die Karte wurde auf einem Gel-Imager in den angegebenen F-Stops fotografiert (A) Grafische Darstellung der Pixel-Ebene gegen Tiffen Nummer und zeigt erwartete logarithmische Beziehung (B. ) Logarithmische Transformation in diesem Bereich nach wie vor eine nichtlineare Beziehung zu folgen.
Abb. 3: Pixelebene auf Graustufen-Analyse gegen F-stop ein Standard Tiffen Die Karte wurde auf einem Gel-Imager in den angegebenen F-Stops fotografiert. Aufgetragen sind die Schwankungen der Pixelebene für verschiedene Standards Tiffen ist gegen Blenden gesehen. Man beachte, daß die Linien nicht parallel sind, was anzeigt, daß Korrekturen an Standards zwischen photogra ausrichtenphs müssen individuell für jede Region von Interesse berechnet werden.
Abb. 4: Die Korrelation zwischen den verschiedenen fotografischen Techniken und Regionen von Interesse in Graustufenanalyse Gezeigt werden Korrelationen zwischen den angezeigten Messverfahren aus dem gleichen C3H genommen / HeJ transplantierten Maus gleichzeitig Punkt (A) Korrelation von Rechteck vs. oval Region. Zinsen auf die dorsale Ansicht. (B) Korrelation von F stoppen 2.0 vs. 1.2 mit rechteckiger Bereich von Interesse. (C) Korrelation von Grauwerten von Rücken- und Bauchblick, rechteckigen Bereich von Interesse. Alle Korrelationen waren statistisch signifikant, wie durch die lineare Regressionsanalyse (p <0,0001) bestimmt.
Abbildung 5: Zeitlicher Verlauf der Änderung der Absorption mit Graustufen-Analyse in C3H / HeJ Mäusen eingepflanzt Farben zeigen Serienmessungen von einzelnen Mäusen.. Beachten Sie die Konsistenz für jede Maus von einem Zeitpunkt zum nächsten.
Fig. 6:. Graustufenanalyse in Chemotherapie-induzierter Alopezie 6 Wochen alten C57BL6 / J-Mäuse wurden entweder mit Vehikel behandelt wurden (N = 6) oder 3 wöchentliche Dosen von Cyclophosphamid (50 mg / kg) (N = 6) (A) repräsentativen Gruppe von 3 Mäusen aus jeder der Behandlungsgruppen, fotografiert von 2 Monaten nach Beginn der Chemotherapie. (B) Zusammengestellt von Daten von Graustufen-Analyse aus jeder Gruppe und zeigt verminderte Resorption mit Cyclophosphamid Verwaltung (p <0,05). Beachten Sie den Zusammenhang zwischen sichtbaren HaarVerlust im Feld A und statistisch signifikante Reduktion der Absorption in Feld B
| Absorptionswerte sind wie folgt: | |||
| Foto | Blende | ROI | Absorption |
| 1 | 2 | Standard | 90 |
| 1 | 2 | ROI-1 | 100 |
| 1 | 2 | ROI-2 | 200 |
| 1 | 3 | Standard | 150 |
| 1 | 3 | ROI-1 | 160 |
| 1 | 3 | ROI-2 | 230 |
| 2 | 2 | Standard | 110 |
| 2 | 2 | ROI-1 | 120 |
| 2 | 2 | ROI-2 | 210 |
| 2 | 3 | Standard | 160 |
| 2 | 3 | ROI-1 | 170 |
| 2 | 3 | ROI-2 | 235 |
| Lesen Blende gewählt als 2,0, F-Stop Referenz als 3.0 gewählt. | |||
| Referenz-Standard-Wert (RSV) = Durchschnitt der Absorption von Standard von Foto 1 und Foto 2 bei Blende 2,0, RSV = mittel (90, 110) = 100 | |||
| Für Foto 1: | |||
| Delta-S = 150-90 = 60 | |||
| Delta-ROI-1 = 160-100 = 60 | |||
| Delta-ROI-2 = 230-200 = 30 | |||
| Korrigierte Absorption für ROI-1 = 100 + (100-90) * (60/60) = 110 | |||
| Für Foto 2: | |||
| Delta-S = 160-110 = 50 | |||
| Delta-ROI-1 = 170-120 = 50 | |||
| Delta-ROI-2 = 235-210 = 25 | |||
| Korrigierte Absorption für ROI-1 = 120 + (100-110) * (50/50) = 110 | |||
| Korrigierte Absorption für ROI-2 = 210 + (100-110) * (25/50) = 205 | |||
Tabelle 1:. Beispielrechnung zur Korrektur von Abweichungen in der Belichtung zwischen Fotografien Die Tabelle zeigt ein Beispiel, wie man für kleinere Unterschiede in der Absorption der Standards zwischen den Aufnahmen (optionaler Schritt 3.2) zu kompensieren.
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Discussion
In diesem Bericht wird eine detaillierte Beschreibung einer neuen Technik zur Quantifizierung von Haarausfall bei Nagetieren ist. Diese Technik verwendet ein Gel Imager für Bilderfassung und -analyse, die Ausrüstung, die in den meisten Laboratorien leicht verfügbar ist. Die Messungen haben gezeigt, robuste auf geringfügige Änderungen in der Technik (Figuren 4 - 5) zu sein, und mit dem Grad der visuellen Haarausfall bei Behandlungsmodelle (Abbildung 6) gut korreliert. Diese Techniken haben sich in Auswertung der experimentellen Therapien für Haarausfall 17 beschäftigt.
Ein quantitatives Instrument zur Beurteilung der Haarwuchs bei Nagetieren können bei der Förderung der Forschung in Therapeutika für Alopezie sehr wertvoll sein. Viele Mausmodellen für Alopezie haben intrinsische Variabilität, die es schwierig, Ergebnisse auf subjektiven Beurteilungen therapeutische Interventionen stützen lässt. Ebenso ist eine quantitative Beurteilung, die ein Ergebnis in Form lieferteiner kontinuierlichen Messung kann durch Gruppenmittelwerte und Standardabweichung / Standardfehler zusammengefasst werden, und können mit Hilfe statistischer Standardmethoden (ANOVA, t-Test) getestet werden. Dieses quantitative Bewertung kann verwendet werden, um Antworten auf eine Reihe von Zeitpunkten zu messen, und kann bei der Erzeugung einer Dosis-Wirkungs-Kurve für ein Testverbindung verwendet werden. Die quantitative Analyse ermöglicht somit für eine evidenzbasierte Bewertung der Wirksamkeit von Therapeutika, die in der Entwicklung sind.
Diese Technik nutzt den Unterschied in der Farbe zwischen Haarlack oder Haut in vielen Mausstämme. Für Mäuse mit dunklem Haar ist, desto größer ist die Dichte der Haare, die größere Menge an optischer Absorption. Dieses optische Absorption kann mit einem Gel bildgebende Vorrichtung, die dazu ausgelegt ist, die optische Absorption in einem definierten Bereich von Interesse zu bewerten, um die Proteinmengen in Western-Blot-Analyse quantifiziert quantifizieren. Ähnlich wie Western Blot-Analyse können die erhaltenen Absorptionsmessungen anal seinyzed mit Standard-statistischen Methoden zur Haardichte zwischen Gruppen von Mäusen (dh Behandlung vs. Kontrolle) zu vergleichen.
Western Blot-Analyse wird in der Regel auf einem einzigen Bild, das im Vergleich zu Standards auf diesem Bild zur Verfügung gestellt analysiert wird durchgeführt. Bei dieser Anwendung wird es notwendig, aber, um Vergleiche zwischen verschiedenen Bildern, die zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen werden können, zu machen. Mit sehr konsequent fotografischen Technik, können Unterschiede zwischen den Aufnahmen minimiert werden. Für experimentelle Anwendung, ist es hilfreich, wenn geringfügige Abweichungen in der Belichtung zwischen Aufnahmen ausgeglichen werden können. Daher ist es wichtig, dass ein Graustufen-Standard in der Fotografie aufgenommen werden (dh Tiffen die Graustufentabelle 15). Allerdings variiert die Beziehung zwischen Absorption und Belichtung auf der optischen Dichte des Targets (2A) variiert. Wenn also die Graustufen-Standard hat eine unterschiedliche optische Dichte vom taIhre Ziele, können die entsprechenden Korrekturen unterschiedlich sein. Logarithmische Korrekturen sind hilfreich, aber nicht bieten eine perfekte Lösung für dieses Problem (2B). Durch Fotografieren an 2 verschiedenen Blendenzahlen, kann man eine lineare Approximation für das Graustufenstandard und für jedes Ziel auf der Fotografie zu berechnen und somit eine geeignete Skalierung der Korrektur für die einzelnen Targets. 3 zeigt, wie Ziele mit unterschiedlicher optischer Dichten verschiedene Korrekturfaktoren, die aus den Unterschieden in der Absorption jedes Ziels an 2 verschiedenen Blendenstufen interpoliert werden können. Wenn man also die Standard-Wert von 150 normalisiert wünscht, ein Objekt an der optischen Dichte Tiffen 19 würde 148 sein, eine an Tiffen 18 wäre 140, eine an Tiffen 17 wäre 119, und so weiter. Anstatt die Lösung dieser Korrekturen grafisch, kann man ein Verhältnis von Pisten zwischen der Graustufen-Standard und dem Ziel zwischen verwenden die 2 F-Haltestellen, um die Korrektur fo berechnenr jedes Ziel, wie in dem angegebenen Beispiel erläutert (Tabelle 1).
Wie alle Techniken, die quantitative Analyse des Haarwachstums durch Graustufenanalyse hat einige Einschränkungen. Zuallererst gibt es erhebliche Rechenaufwand bei der Anwendung dieser Technik. Dies resultiert aus der Tatsache, dass die Analyse-Software für Gel-Imager zum Analysieren jeder Figur als separaten Versuch optimiert. So gibt es eine Voraussetzung, um manuell für jede Veränderung der Expositionen zwischen den Bildern zu korrigieren. Das linearisierte Näherung für solche Korrekturen nicht vereinfachen diesen Prozess. Ein Beispiel ist in Tabelle 1: Simulierte Daten von 2 Sets von Fotografien, erstellt am Blende 2.0 und 3.0, mit einem gemeinsamen Standard. Jeder Satz von Fotografien hat 2 ROIs, die zwischen den Sätzen verglichen werden müssen. Geringfügige Abweichungen in der fotografischen Bedingungen haben die erste Reihe von Fotografien verursacht eine etwas größere Belastung als der zweite Satz haben, Evident durch geringfügige Unterschiede in der Absorption des gemeinsamen Standard.
Das Beispiel zeigt, wie kleine Unterschiede in fotografischen Bedingungen offensichtlichen Unterschiede in der Absorption bei einer gegebenen ROI zu erzeugen, aber diese können mit einem Referenzstandard, in diesem Fall zeigen, dass die Absorption bei den ROIs nicht zwischen den 2 Gruppen von Bildern unterschiedlich korrigiert werden.
Es ist wichtig zu beachten, dass Veränderungen in der Lichtabsorption nicht immer direkt mit Haarmenge Depigmentierung oder andere Farbänderungen korrelieren könnte fälschlicherweise für Haarausfall oder den Haarwuchs ist. Leider kann die Genauigkeit dieser Technik nicht beurteilt werden, da es derzeit keine Gold-Standard, mit dem zu vergleichen. Doch wo gibt es offensichtlich Haarausfall, funktioniert die Technik erzeugen die erwarteten Ergebnisse (Abbildung 6). Schließlich gibt es noch keine Daten zu beurteilen, wenn die Ergebnisse mit dieser Technik korrelieren mit Ergebnissen in klinischen Studien von potenziellen Therapeutika.
<p class = "jove_content"> Das Graustufen-Analyse zur Quantifizierung der Haarausfall in verschiedenen Formen der Alopezie ist eine Chance zu verfeinern und zu vereinheitlichen Methoden zur Charakterisierung Modelle von Haarausfall und für die Prüfung Reaktionen auf potenzielle Therapeutika. Die Anwendung dieser Technik sollte zu verbessern Identifizierung und Entwicklung effektiver Therapien für Haarausfall.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KODAK Gel Logic 100 Imaging System | Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA | Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography. | |
| The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale |  Imatest |
Greyscale standard | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study | |
| C3H/HeJ engrafted mouse | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study |
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