Abstract
Lipotransfer è uno strumento essenziale nella armamentarium del chirurgo per il trattamento di deficit dei tessuti molli in tutto il corpo. Il grasso è il filler dei tessuti molli ideale in quanto è facilmente disponibile, facilmente ottenuto, poco costoso, e intrinsecamente biocompatibile. 1 Tuttavia, nonostante la sua popolarità crescente, innesto di grasso è ostacolato da risultati imprevedibili e la sopravvivenza del trapianto variabili, con tassi di ritenzione pubblicati che vanno da 10 -80%. 1-3
Per facilitare le indagini sulle innesto di grasso, abbiamo quindi sviluppato un modello animale che consente l'analisi in tempo reale di ritenzione del volume iniettato grasso. Brevemente, un piccolo taglio nel cuoio capelluto di un CD-1 topo nudo e 200-400 ml di lipoaspirato trasformati è disposto sopra il cranio. Il cuoio capelluto viene scelta come sito ricevente causa della sua mancanza di grasso sottocutaneo nativa, e per l'eccellente contrasto sfondo fornito dal cranica, che aiuta nellail processo di analisi. Tomografia Micro-computerizzata (micro-CT) viene utilizzato per eseguire la scansione l'innesto al basale e successivamente ogni due settimane. Le immagini TC sono ricostruite, e un software di imaging è utilizzato per quantificare i volumi di innesto.
Tradizionalmente, le tecniche per valutare il volume del trapianto di grasso hanno reso necessaria l'eutanasia dell'animale studio per fornire una sola valutazione del peso del trapianto e volume misurazione fisica ex vivo. Confronti biochimici e istologici hanno altresì richiesto l'animale studio per essere eutanasia. Questa tecnica di imaging descritta offre il vantaggio di visualizzazione e la quantificazione oggettiva volume a più punti di tempo dopo l'innesto iniziale senza dover sacrificare l'animale studio. La tecnica è limitata dalla dimensione dell'innesto grado di essere iniettato come pelle grandi innesti rischio e necrosi grassi. Questo metodo ha utility per tutti gli studi che valutano fattibilità del trapianto di grasso e la ritenzione del volume. E 'particolarmente adatto per providing una rappresentazione visiva di innesti di grasso e dopo cambiamenti di volume nel tempo.
Protocol
NOTA: i protocolli sperimentali e moduli per il consenso dei pazienti per ottenere il grasso sono stati esaminati e approvati dal Stanford University Institutional Review Board (Protocol # 2188). Tutte le procedure di animali sono state approvate dal Pannello di Amministrazione Stanford on Laboratory Animal Care (APLAC) ai sensi del protocollo # 9999. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con il rispetto rigoroso di sicurezza degli animali e le linee guida per la cura umane.
1. Fat raccolta
- Utilizzando la procedura Coleman 17-19, ottenere tessuto adiposo umano dalle addome, fianchi, e / o regioni coscia di pazienti di sesso femminile sani sottoposti a liposuzione elettiva.
- Per elaborare la lipoaspirazione per l'innesto, iniziare consentendo il grasso di stabilirsi per 30 min.
- Lipoaspirato deposita tipicamente in tre strati, con olio in alto, grasso nel mezzo, e sangue alla base. Aspirare e scartare lo strato di olio superiore e lo strato di sangue inferiore.
- Per rimuovere ulteriormente qualsiasi tumesc rimanentient fluido o detriti cellulari, centrifugare il grasso per 5 minuti a 350 xg e 4 ° C, e aspirare lo strato acquoso inferiore.
- Calcolare la quantità di grasso necessario per l'innesto, consentendo il 20% errore di consegna, e trasferire il volume desiderato di grasso da 50 ml conica (s). Moltiplicare 400 per il numero di topi in studio per ottenere microlitri di grasso necessario per l'innesto.
- A questo punto, se si esegue cellulare Assisted lipotransfer 20,21, posto volume di grasso per innesto su ghiaccio. Poi raccolta di cellule derivate da tessuto adiposo stromali (CSA) dal grasso residuo utilizzando la tecnica standard descritta da Zuk et al 22.
2. innesto di grasso
- Ottenere femmina, omozigote CD-1 topi nudi per lo studio sperimentale. Scegli topi tra 8 - 12 settimane di età.
- Per indurre l'anestesia, posto del mouse in una scatola atterramento con 2,5% miscela isoflurano / ossigeno a 2 L / min per circa 10 min. Si prega di notare che ISOF raccomandatoDose lurane varia con ceppo di topi.
- Quando il tasso di respirazione del mouse ha rallentato, confermare adeguata sedazione con un pizzico punta. Applicare veterinaria lubrificante pomata oftalmica per entrambi gli occhi del mouse.
- Se il mouse non si muove in risposta a pizzico tep, a conferma di un piano adeguato di anestesia. Mettere il naso del mouse in un nosecone offrendo 2,5% miscela isoflurano / ossigeno 1-2 L / min. Se il mouse si ritrae dal pizzico punta, tornare alla casella di atterramento e ripetere il test dopo 5 min.
- Istituito campo sterile sotto il mouse e poi sterilizzare cuoio capelluto con 2,5% iodopovidone seguita da una soluzione di etanolo al 70%. Ripetere altre due volte.
- Mettere teli chirurgici sopra il mouse e fare attenzione a mantenere campo sterile. Strumenti sterili, guanti e DPI dovrebbero essere usati in qualsiasi momento.
- Se il volume di grasso da innestare precedentemente immesso sul ghiaccio, permettono di regolare il grasso primo a RT prima della consegna.
- Rinviare la siringa luer-lock 1 ml di 1 mldi grasso.
- Collegare un 14 G, a 8 cm di lunghezza grasso innesto cannula alla fine della siringa.
- Prime sistema premendo lo stantuffo della siringa fino tra 200 e 400 ml di grasso rimane nella siringa. Mentre lo stantuffo della siringa confermare che la cannula è completamente riempito di grasso osservando grasso uscendo dal foro distale della cannula.
- Utilizzando una pinza sottile, sollevare la pelle dorsale sulla linea mediana sovrastante la caudale-più aspetti del cranio. Fare un 1,5 millimetri tagliati in pelle con le forbici sottili.
- Posizionare un sutura 6-0 nylon attraverso mezzo del taglio che verrà successivamente utilizzato per portare i bordi della ferita insieme dopo viene eseguita l'innesto. Non legare la sutura.
- Creare una tasca sottocutanea sul cranio inserendo la cannula attraverso l'incisione cutanea e passando la cannula avanti e indietro in un modello a ventaglio sul cranio per liberare eventuali allegati tessuto connettivo per la pelle sovrastante.
- Una volta che la tasca è stato creato, posizionare il cAnnula sulla linea mediana del mouse direttamente sul cranio fino a quando la punta si trova alla rostrale-più aspetto della tasca che dovrebbe essere proprio dietro una linea tracciata tra gli occhi. (Figura 1A)
- Iniettare lentamente il grasso in modo retrogrado, avanzando lo stantuffo mentre si tira la cannula indietro. Utilizzando pinze, portare i bordi della ferita insieme e sollevare fino a mantenere il grasso di fuoriuscire dalla tasca.
- Legare la sutura precedentemente collocata, facendo in modo che il primo nodo si trova leggermente contro la pelle. Tie tre ulteriori nodi quadrati e tagliare la sutura con una coda 3 mm. (Figura 1B)
- Confermare con visualizzazione e palpazione manuale che la tasca non è troppo piena e la pelle sovrastante la tasca non è tesa. Se la tasca è stata riempita troppo, tagliare la sutura e togliere tutto il grasso all'interno della tasca. Lavare la tasca con tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4 e re-iniettare un volume inferiore di grasso.
- Rimuovere mouse da unnesthesia e posto sulla schiena o di lato in una gabbia pulita da sola. Monitorare l'animale per la respirazione normale, i movimenti normali, assenza di sanguinamento, e segni di dolore o disagio. Somministrare buprenorfina 0,1 mg / kg per via sottocutanea ogni 6 ore per un massimo di 48 ore se l'animale è nel dolore.
- Assicurarsi che l'animale si è svegliato a sufficienza per mantenere decubito sternale prima di lasciarlo incustodito. Non posizionare animale in una gabbia con altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato.
- Dopo 4 ore, assicurarsi che l'animale è in grado di mangiare e bere, muoversi e respirare normalmente e che non vi è alcun sanguinamento dal sito operatorio. Ritorna alla struttura di cura degli animali.
3. Micro-CT
- Topi Scan per il volume di base da post-operatorio Day 3, quindi ripetere la scansione alle settimane post-operatorie 2, 4, 6 e 8.
- Quando l'imaging i topi ad ogni tempo, seguire sedazione e la cura degli animali linee guida pre e post-procedurale come descritto in precedenza in SPTO 2.2-2.4 e 2,17-2,19.
- Eseguire la scansione su uno scanner micro-CT con una dimensione ricostruzione voxel di 100 micron o migliore.
- Con un picco a raggi X kilovoltaggio di 80 kVp e una corrente anodica di 450 μA, somministrare una dose razione di circa 5 centiGy durante un 9 min scansione per ogni mouse. Si prega di notare questi valori variano a seconda del protocollo di scansione.
- Prima di eseguire la prima scansione, calibrazione micro-CT con un fantasma di imaging che distingue tra aria, acqua, e l'intensità delle ossa.
- Mettere quattro topi in scanner in posizione ventrale, con due mouse in alto e due in basso. Un piano di scansione può essere facilmente costruito utilizzando 60 ml siringhe per tenere il corpo del mouse e 10 ml siringhe come coni naso. 23
- Mantenere i topi sotto anestesia con una miscela isoflurano / ossigeno 2,5% a 1-2 L al min.
- Conferma immagine scout con il che l'intero cranio del mouse, dal naso alla prima vertebra cervicale, e dall'alto del cranio a base di SKUll, sarà ripreso.
Analisi 4. Micro-CT
- Aprire le immagini ricostruite con un software di micro-CT di imaging di analisi che permette la creazione di regioni di interesse (ROI) selezionando voxel utilizzando soglie per l'intensità dei pixel. Software consente anche la creazione di superfici 3D attraverso l'interpolazione di voxel selezionati, e per l'analisi del volume.
- Inizia il caricamento delle immagini TC ricostruite in due dimensioni (2D) coronale, assiale, sagittale e viste. (Figura 2A)
- Utilizzando la fetta assiale come guida, accedere alla slice sagittale corrispondente all'aspetto più a sinistra dell'innesto grasso. Selezionare una soglia superiore e inferiore per intensità dei pixel che cattura tutti i voxel corrispondenti al trapianto di grasso, ma che esclude il tessuto circostante e ossa. (Figura 2B)
- Definire un ROI nella vista sagittale che corrisponde l'innesto di grasso utilizzando soglie di intensità di pixel definiti in precedenza. Ripetere questa procedura ogni quinta fetta sagittale, navigare fino a raggiungere il più a destra aspetto dell'innesto. (Figura 2C)
- Interpolare voxel selezionati da tutti i ROI 2D di in un unico, combinato 3D ROI. (Figura 2D)
- Volume ROI Record calcolata dal software.
- Render il isosurface 3D per visualizzare il volume finale grasso trapianto. (Figura 2E)
- In analisi successive, assicurarsi di mantenere la massima intensità dei pixel e dei valori minimi di soglia uguali a quelli utilizzati per l'analisi di base.
5. Fat Harvest
- Dopo i topi sono stati analizzati per la settimana 8 24,25 punto di tempo, anestetizzare i topi come precedentemente descritto ai punti 2.2-2.4 e 2,17-2,19.
- Seguendo le linee guida APLAC, eutanasia i topi separando le loro colonne vertebrali.
- Posizionare il mouse in campo operatorio. Utilizzando forbici tenotomia, aprire delicatamente la tasca e sezionare tegli sovrastante la pelle e gli allegati del tessuto connettivo del trapianto di grasso.
- A questo punto, può essere utile per asportare un pezzo di pelle sovrastante dorsale per facilitare l'estrazione del trapianto. (Figura 3A)
- Leggermente mantenere la trazione sul trapianto con una pinza e girare trapianto da un lato all'altro di visualizzare i punti successivi di tensione che devono essere rilasciati con le forbici.
- Resta il più vicino all'innesto possibile quando ablazione per minimizzare il tessuto connettivo presa con l'innesto. (Figura 3B)
- Dopo ablazione trapianto, misurare la massa su una scala tarato che ha una precisione di almeno 0,01 grammi.
- Calcolare il volume dell'innesto grasso utilizzando il valore di massa misurato e la densità media di grasso umano (0,9 g / ml) come tasso di conversione.
- Confronta volume calcolato di trapianto di grasso a quella ottenuta utilizzando micro-CT.
- Innesti di grasso possono essere trattati per istologia o ulteriori analisi, se necessario.
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Representative Results
Innesti Fat progressivamente diminuite in volume nel corso di studio, conseguente 62,2% di sopravvivenza media di Week 8. (Figura 4A) 24 Al completamento della scansione Settimana 8, ogni innesto grasso è stato estratto in un unico pezzo. Un test della somma dei ranghi Wilcoxan è stato utilizzato per confrontare la differenza tra le misure di volume di innesti di grasso ottenuti da una micro-CT o calcolati dalla massa fisica. Nessuna differenza significativa è stata trovata tra i due metodi (p bilaterale -VALORE = 0,9362). (Figura 4B)
Con 5 centiGy per scansione e cinque punti di tempo di scansione, ciascun topo ha ricevuto non più di un totale di 25 centiGy nel corso dello studio. Coerentemente, nessuno dei topi visualizzata alcuna prova lordo di ustioni radiazioni cutanee.
Figura 1. (A) (B) Nude del mouse su innesto di grasso completata, con una singola sutura di nylon utilizzato per portare ferita bordi insieme. La tasca è stato riempito, ma non è tesa.
Figura 2. (A) Le immagini ricostruite inizialmente visualizzato in assiale, coronale e sagittale vista. (B) Uso la vista assiale come una guida per navigare più aspetti sinistra dell'innesto a vista sagittale. Impostazione di una soglia per l'intensità dei pixel in modo che tutti i voxel selezionati all'interno della gamma soglia rappresenterà tessuto adiposo, quindi consentire per la demarcazione del volume grasso trapianto. (C) definito sulla vista sagittale partire al massimo aspetti sinistra dell'innesto e del ROI continua maiy quinta fetta trasferirsi all'altro capo del trapianto. (D) Tutti i voxel selezionati da 2D ROI di interpolato in un unico 3D ROI. (E) Una superficie tridimensionale è stata creata usando l'interpolazione cubica-spline per visualizzare i volumi totali di grasso innesto .
Figura 3. (A) Fat trapianto prima di espianto, con la patch dorsale di pelle rimosso. (B) Fat trapianto dopo espianto.
Figura 4. Analisi (A) volumetrico Micro-CT ha dimostrato graduale perdita di volume del trapianto di grasso in otto settimane. (B) i volumi di grasso innesto finale, misurata in micro-CT, corrispondeva strettamente a volumi calcolati dalle masse di trapianto di grasso espiantatos. La densità media di grasso umano (0,9 g / ml) è stato utilizzato come tasso di conversione.
Tabella 1. Calcolato Micro-CT Volume vs. reale misurata volume FAT 24
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Discussion
Fino a questo punto, la maggior parte dei ricercatori si sono basati sulle modalità non-imaging per quantificare la sopravvivenza a lungo termine degli innesti di grasso, ma questi metodi richiedono il sacrificio dell'animale studio e produrre soltanto una singola misura. 3,10-12 Il nostro studio rappresenta un metodo di analisi che consente una migliore obiettivo, in tempo reale quantificazione della sopravvivenza del trapianto di grasso in un modello murino.
Critical in questo processo è garantire che i topi immunocompromessi sufficientemente vengono utilizzati per lo studio, come questo impedisce il rigetto dell'innesto che si verificherebbe se vengono utilizzati topi con sistema immunitario intatto. Preservare l'integrità grasso è fondamentale durante la raccolta, l'elaborazione, e fasi di collocamento di innesto. In conformità con le norme tradizionalmente accettate, il grasso per l'innesto dovrebbe essere ottenuto mediante aspirazione assistita liposuzione (SAL). Durante il posizionamento, il grasso deve essere iniettato in un non più veloce di 0,5 ml / sec velocità di flusso costante. Una cannula calibro 14 è preferito per l'innesto ina del mouse, ma più grandi cannule di diametro possono essere utilizzati senza alcun pregiudizio per il grasso. Cannule piccole e aghi, specialmente quelli più stretto di 16 gauge-sono scoraggiati durante il posizionamento in quanto potrebbero causare il grasso di ripartizione a causa della maggiore sforzo di taglio. Sebbene descriviamo la tecnica preferita per la lavorazione sopra, qualsiasi combinazione di sedimentazione, centrifugazione e / o filtrazione può essere utilizzato fintanto che gli strati di olio e sanguigni sono adeguatamente separati dal grasso prima dell'innesto.
Innesti di grasso dovrebbe essere di almeno 200 ml di dimensione per ridurre al minimo la varianza dei risultati a causa della natura inconsistente di innesto di grasso. Innesti più grandi fino a 400 ml di dimensioni possono essere utilizzati, ma soprattutto questo volume, vascolarizzazione compromessa e la tensione della pelle eccessiva può causare grassi e necrosi cutanea. In definitiva, dimensione massima grasso innesto sarà determinata dalla superficie e volume della tasca. Per aumentare il volume di un innesto che può essere consegnato in modo sicuro, la pocket può essere ampliato con più ampia dissezione. Tuttavia, questo può posizionare grasso oltre i confini della parte superiore del cranio, che renderà il contrasto tra l'innesto e il tessuto circostante meno chiara. Quindi, successiva selezione voxel diventerà più difficile.
Se incisione cutanea iniziale è abbastanza piccolo, una sutura può non essere necessaria quando grasso rimane contenuta e non è visto fuoriuscita della tasca. Se una sutura è posto, bisogna fare attenzione a non legare il primo nodo troppo stretto, altrimenti lesioni cutanee possono verificarsi. Una sutura monofilamento non assorbibile come il nylon è preferito, poiché limita la reazione infiammatoria ed è meno probabile che porto infezione. Riepitelizzazione dell'incisione avverrà da 24 a 48 ore dopo l'intervento, e la sutura può essere rimosso in questo momento. Non devono essere utilizzati suture assorbibili e intrecciati. La pelle deve essere sempre maneggiato con la minima forza necessaria, e il chirurgo deve fare attenzione a non schiacciare la pellementre si tiene fino bordi della ferita.
A seconda di imaging software di analisi degli investigatori, l'esatta relazione tra intensità dei pixel e la densità del tessuto può variare. Gli investigatori dovrebbero scegliere soglie di intensità dei pixel per ottenere una portata massima e minima che contraddistingue più accuratamente l'innesto grasso dal tessuto circostante. Gli stessi valori di soglia massima e minima deve essere usato durante tutto volume analizza per mantenere la coerenza.
Ci sono diversi metodi per selezionare il volume del trapianto una volta impostati i valori di soglia di intensità dei pixel. Anche se troviamo la pittura con un pennello in vista sagittale meglio nelle nostre mani, altri metodi di selezione voxel per creare un ROI può essere utilizzato come disegno con lo strumento spline o la pittura nella vista assiale. È preferibile se una singola persona svolge tutto volume analizza modo più omogeneo possibile, al fine di ridurre l'errore di misurazione.
Il non-natura invasiva di questo metodo e la visualizzazione in tempo reale di evoluzione graft offrono vantaggi significativi rispetto alle tecniche tradizionali. Tuttavia, questa tecnica è limitata nella sua capacità di identificare la vitalità e la salute degli innesti rimanenti. Inoltre, esso non può dimostrare rivascolarizzazione relativa di innesti. Anche se i cambiamenti di aspetto e la densità del trapianto possono suggerire necrosi grassi, infezioni, formazione di cisti, o liquefazione, è difficile trarre conclusioni precise da micro-CT alone.
Ci auguriamo che questa tecnica servirà come base su cui possono essere condotti studi futuri per comprendere meglio i fattori causali di sopravvivenza del trapianto di grasso e di perdita. Variazioni su questo tema possano chiarire il ruolo che le cellule staminali, fattori di crescita, citochine, geni e marcatori di superficie cellulare svolgere nella conservazione finale di volume di trapianto di grasso. Con questo strumento migliore per verificare ipotesi contrastanti, non vediamo l'ora di una migliore comprensione del trasferimento di grasso che Transforms una tecnica capriccioso per il trattamento di deficit dei tessuti molli in una più prevedibile.
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Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Oak, il Laboratorio Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa, e il National Institute of Health, Grants NIHR21DE019274, NIHR01DE019434, NIHR01DE021683, e NIHU01HL099776 di MTLDCW è stato sostenuto dalla ACS Franklin H. Martin Faculty Research Fellowship, il Hagey Laboratorio per Pediatrica Medicina Rigenerativa, e la Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award. Micro-CT è stato condotto presso il Centro di Stanford per l'Innovazione in imaging in vivo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SAL lipoaspirate | |||
| Centrifuge | Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA | ||
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| CD-1 nude mice (Crl:CD1-Foxn1nu) | Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA | ||
| Isoflurane | Henry Schein, Dublin, OH | ||
| 2.5% Betadine | Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT | ||
| 70% Ethanol solution | Gold Shield, Hayward, CA | ||
| 1cc luer-lock syringe | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| 14 gauge cannula | Shippert Medical, Centennial, CO | ||
| Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | ||
| Tenotomy scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | ||
| 6-0 nylon suture | Ethicon, Blue Ash, OH | ||
| Phosphate buffered saline | Gibco, Carlsbad, CA | ||
| micro-CT scanner | Siemens Healthcare, Pleasanton, CA | ||
| Phantom | TriFoil Imaging, Northridge, CA | ||
| Imaging analysis software | IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA | ||
| Scale | Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH |
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