Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Intra Imaging av aksonal Interaksjoner med Microglia og makrofager i en mus Dorsal kolonne Crush Injury

Published: November 23, 2014 doi: 10.3791/52228
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

Introduction

Inflammatorisk reaksjon på sykdom eller skade i sentralnervesystemet (CNS) er dårlig forstått, spesielt med hensyn til samspillet mellom immun og bosatt celler i vev. Undersøkelser av disse cellulære interaksjonene i ryggmargen er av særlig interesse i levende dyr. Den eneste lett tilgjengelige CNS hvit substans kanalen er i dorsal kolonner med ryggmargen, noe som gjør dette til et viktig område som å fokusere innsatsen på å forbedre mulig eksperimentell tilnærming. Disse undersøkelsene har vært begrenset på grunn av tekniske problemer med å få tilgang og stabilisere CNS for bildebehandling. Live-avbildning i ryggmargen har blitt beskrevet tidligere 1-13, men få studier har adressert cellulær bevegelse i en ryggmargsskade utover noen få timer etter den første fornærmelse. Den traumatiske ryggmargs lesjon er et komplekst miljø, med nevroner, astrocytter, fibroblaster, NG2 stamceller, og immunceller including microglia, nøytrofiler, makrofager, T-celler, B-celler og dendrittiske celler 14,15. Makrofager er den delen av immunceller som er ansvarlige for fagocytose i lesjonen, infiltrere fra sirkulasjonen. Rollen til disse fagocyttceller har vært diskutert, med rapporter som indikerer at disse cellene kan ta på både skadelige og beskyttende roller i det skadde vevet. Disse rollene varierer fra økt sekundær aksonal dieback etter en skade og handle på en phagocytic måte 16-22, til å ta på seg en sårheling fenotype og minkende funksjonelle underskudd i den skadde dyr 21,23,24.

Tidligere forsøk på å skille makrofager fra mikroglia har stolt primært på morfologi i friskt vev. Imidlertid aktiverte mikroglia og makrofager uttrykker mange av de samme markører og vise utvisket morfologi etter skade 25-29, noe som gjør separeringen av forskjellige aktivitetene til disse cellene vanskelige å studere based på disse faktorene alene 30. Disse cellene kan bli separert ved differensiell ekspresjon av CD45 ved hjelp av strømningscytometri 33,34, selv om denne fremgangsmåte er mindre nyttig for å diskriminere disse celletyper in vivo. Utnytte differensial uttrykk for CCR2 og CX3CR1 i mikroglia og makrofager har også blitt utforsket, selv om de dynamiske endringer i uttrykket av disse markørene som monocytter differensieres til makrofager kan komplisere nøyaktig analyse 35,36. Mikroglia er bosatt immunceller i CNS og oppstå fra plommesekkstamfedre under fosterutviklingen, mens makrofager er utledet fra beinmargsstamfedre og skriv den skadde CNS etter en fornærmelse 31,32. En alternativ tilnærming til bruk morfologi for å skille disse to celletyper er å erstatte benmargen med progenitorer fra en donor dyr som uttrykker et spor markør i makrofagene som stammer fra donor forløpere, og samtidig bevare CNS resident, reciptorer-avledet mikroglia. Disse benmarg kimære modeller er vanligvis benyttes i mange andre anvendelser 37-40. Denne metoden har unike begrensninger assosiert med skade på integriteten av blod-hjernebarrieren forårsaket av bestråling eller cytotoksiske medikamenter som brukes til å utrydde marg progenitorceller i verten, for derved å begrense dens bruk i visse anvendelser. Nylig er funksjonelle forskjeller mellom mikroglia og makrofager i CNS begynner å skjelnes ved hjelp av flowcytometri, genet chip rekke analyse og kimerisme metoder 24,26,41-44, som vil være svært nyttig i fremtiden. Selv skille disse to celletyper er fortsatt vanskelig, forstå deres unike funksjoner er viktig i fører til mer målrettede behandlinger av lidelser som involverer både mikroglia og makrofager innen CNS.

Beskrivelse av cellulære interaksjoner i ryggmargen lesjon har først og fremst kommet fra studier med cellekultur modeller. Dette er due til utfordringene med bildebehandling både ryggmargen lesjon og immunceller sammen i et levende dyr. Nåværende gnager modeller av ryggmargsskade av varierende type og alvorlighetsgrad inkluderer kontusjon modeller 45,46, Nålestikk skader 2, sårskader 47 og rygg kolonne knusningsskade beskrevet her 16,18,48. Betennelse i hjernehinnene øker med alvorlighetsgraden av skaden og gir unike utfordringer for implantasjon av vinduer eller operasjoner for serie bildebehandling. Noen av disse utfordringene inkluderer infiltrasjon av fagocytiske celler, så vel som dannelse av fibrøst vev over operasjonsstedet. Noen av disse problemene kan overvinnes ved å skape mindre lesjoner og dekker den eksponerte ryggmargen med ikke-immunogenisk kirurgisk dressing mellom dura og paraspinous muskler for å tillate påfølgende gjenåpning kirurgi, slik det gjøres her for å studere rygg kolonne klemskade . Evnen til bildet bare ryggdelen av spinnal ledningen begrenser også valg av skade, siden kontusjon modeller primært forårsake skader på sentral snor, ofte sparsom den mest dorsal del av ryggsøyler, spesielt på tidlig tidspunkt etter skade 45,49. Derfor beskriver vi en enkel skade modell som gir et rent, repeterbar, rektangulær formet lesjon som er nyttig både for observasjon av celle bevegelse i lesjonen, og for enkel kvantifisering av aksonal stilling i forhold til lesjonen.

Protocol

MERK: Alle dyr skal være plassert og utnyttes i samsvar med dyr omsorg og bruk komité (IACUC) ved institusjonen. Alle prosedyrer som er beskrevet her er godkjent av Case Western Reserve University IACUC.

1. Transgene dyr

  1. Bruke kommersielt tilgjengelige fluorescerende reporter mus til å merke axoner (Thy-en YFP H) 50 og mikroglia / monocytter (CX3CR1 GFP / GFP 51, se liste over materialer). Disse musene bør intercrossed og vedlikeholdes som enkelte hekkekolonier henhold til institusjonelle dyr omsorg politikk.

2. Bone Marrow hjernespinn

  1. Identifisere dyr som er minst 8 uker gamle for anvendelse som mottaker dyr.
  2. Plassere vertsdyr i en sirkulær bestråling holde buret utformet for å holde musen i en posisjon til å sikre enda, bestråling av hele kroppen.
  3. Still timeren på en cesium (Cs-137) irradiator å administrere en hele kroppen stråling dosalder av 800-1000 Rads til dyrene i henhold til produsentens instruksjoner (eksempler som vises her er 980 rad).
  4. Retur dyr til deres bur for å hvile i minst 4 timer.
  5. Velg donor dyr av den aktuelle genotype (se figur 2A) som kilden til margstamceller.
    MERK: De aktuelle donorer er dyr som uttrykker ulike avstamning-spesifikke fluorescerende reportere fra verten for å identifisere ulike cellepopulasjoner, eller en av samme genotype som kontroller.
  6. Fylle en petriskål med 70% alkohol, og en andre rett med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medier og en 40 mikrometer celle sil dynket i media. Fyll en 15 ml konisk tube med RPMI media. Hold retter og rør på is.
  7. Ofre donordyr av CO 2 kvelning i henhold til institusjonelle retningslinjer. Rengjør huden og pels av soaking hele dyret med 70% etanol til all pelsen er våt.
  8. Ta av skinn fra nedre halvdel av dyr ved å kutte rundt midtpartiet og trekke huden ned over bakbena å fullt avsløre beinmuskulaturen.
  9. Fjern tibia ved fremre overextension på kneleddet å forrykke bein, deretter ved hjelp av sterile tenger og sakser, skrelle og kutte muskler bort fra begge ender av tibia. Plasser benet i petriskål med alkohol i opp til 30 sekunder og deretter overføre til cellen sil inne i petriskål inneholdende media.
  10. Forrykke hofteleddet og skrelle bort musklene festet til femur, plassert femur kort i alkohol og deretter plassere den i samme celle sil inne i fatet.
  11. I en vev kultur hette, bruke steril saks for å klippe av begge endene av bein og sette inn en 21 gauge nål på en 1 ml sprøyte inn i enden av benet. Skyll marg inn i 15 ml konisk med media. Gjenta prosedyren for de resterende bein.
  12. Ved hjelp av på baksiden av stempelet fra en 3 ml sprøyte, slutter knuse bein i cellensil på petriskål for å trekke flere celler.
  13. Plasser filteret på toppen av en 50 ml konisk rør og overføre media med aspirerte celler fra 15 ml konisk tube. Bruk baksiden av stempelet for å knuse marg for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Vask de 15 ml konisk tube, bein fragmenter og celle sil med 30 ml av media i en 50 ml konisk tube.
  14. Sentrifuger cellene i 5 min ved 500 x g for å pelletere cellene.
  15. Lyse røde blodceller med 2 ml av ammonium-klorid-Kalium (ACK) lysebuffer i 2 min. Slukke lysis buffer med 10 ml media inneholdende 10% føtalt bovint serum. Sentrifuger ved 500 xg i 5 til 10 minutter for å pelletere.
  16. Vask cellene en gang i 10 ml RPMI-medium og to ganger i saltvann, sentrifugering ved 500 xg i 5 til 10 minutter for å pelletere for hver vask.
  17. Resuspender cellene i en sluttkonsentrasjon på 3 x 10 til 6 celler i 200 ul saltvann.
  18. Transfer 3 x 10 6 marg cellene via halevenen injeksjon i irradiated resipientmus.
  19. Plassere syrnet vann (pH 3,0) i mottaker bur og la mus å komme seg.
    MERK: Mus som ikke transplantasjon vil dø innen 10-14 dager etter inngrepet.
  20. Etter 8 uker, bekrefter marg tilberedning ved å undersøke perifert blod immunceller ved hjelp av flowcytometri (figur 2B-C).

3. Dorsal Column Crush Injury

MERK: Velg passende chimera dyr eller doble transgene dyr for kirurgi basert på eksperimentet ønsket. Dyr med enten merket bosatt eller benmargs avledet celler ble opprettet i forrige trinn.

  1. Forberede og autoklav kirurgiske verktøy, inkludert Rongeurs, Dumont # 4 tang, iris saks, pinsett for å holde vev, nål drivere og såret klipp.
  2. Forberede medisiner for å administrere til musene for smerte kontroll. Bupernex og Marcaine blir ofte brukt for smerte kontroll. Bruke egnede medisiner som krevde ennd godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
  3. Indusere anestesi med 4% isofluran og vedlikeholde med 1-2% isofluran for å oppnå en pustefrekvens på 60-100 pust per min. Påfør øye smøremiddel til dyrets øyne for å hindre tørrhet under anestesi og bekrefte manglende respons ved foten klemme. Opprettholde temperaturen bruker en varmepute og overvåke temperaturen med en rektal probe.
  4. Barbere baksiden av musen med en elektrisk barbermaskin over målrettet ryggmarg-nivå, og deretter swab området tre ganger med povidon-jod, etterfulgt av to ganger med 70% alkohol. Plasser dyret på en steril drapere, og dekke dyret med en annen steril drapere med et hull skåret på et egnet sted for å visualisere operasjonsstedet. Vedlikeholde alle verktøyene på sterile forheng hele operasjonen.
  5. Skjær huden langs midtlinjen i den ønskede høyde med rygg iris saks for å utsette muskelen på ryggen av dyret.
  6. Under en dissecting mikroskop, kuttet ryggmusklene, inkludert trapezius og leddbånd i latissimus dorsi langs midtlinjen hvor de skal festes til rygg spinal prosesser, og utsett ryggsøylen.
  7. Fjern de rotator musklene mellom rygg-og tverrtaggene av vertebra å avsløre lamina av den spesifikke ryggvirvel som skal fjernes (T11 i dette tilfellet). Identifiser T11 ved innsetting av den siste ikke-flytende ribben på denne prosessen.
  8. Sett tips av Rongeurs inn i rommet over og under prosessen for å bli fjernet og løft litt for å sørge for at de er godt på plass rundt ryggvirvel lamina men ikke for dypt til å skade ryggraden. Nære Rongeurs i en bevegelse for å fjerne lamina.
  9. Forstørre laminektomi etter behov ved hjelp av Rongeurs å fjerne små deler av den resterende ryggvirvel.
  10. Mål 1 mm fra tuppen av en # 4 tang ved å holde dem mot en linjal og merking med en permanent markør. Mål en 1 mm i separasjons betWeen de to tindene ved å holde pinsett mot herskeren og fikse den maksimale bredden av tipsene til en mm ved å skyve en gummi tang ring på plass over skaftet av tang.
  11. Lag et lite hull ved å sette inn en 30 gauge nål gjennom dura på de to innsettingspunkter for tindene av pinsett for å få tilgang til ryggmargen.
  12. Sett inn tang tindene i 90 ° vinkel til dura gjennom hullene til dybden av en mm er merket på sidene av tang, noe som gjør at merket er over dura. Knip lukke pinsett og hold i 10 sek. Utslipp, og gjenta tang presse to ganger for totalt tre holder. Fjerne tang fra ryggmargen.
  13. Suge et stykke absorberbare gelatin komprimert svamp i saltvann og sted over skadestedet.
  14. Ved hjelp av en løpende sting, sy muskelen på plass over laminektomi og gjennomvåt gelatin svamp med # 4 syntetiske ikke-absorberbare nylon suturer.
  15. Clip huden på plass med 5 mm såret clips.
  16. Injisere 10 pl Marcaine (1,0 mg / kg) i 490 mL av saltvann subkutant rundt innsnitt området og 5 mL Bupernex (0,1 mg / kg) intramuskulært i gluteus muskler.
  17. Tillate dyr å gjenopprette på en varm pad og overvåke eventuelle vanskeligheter i bevegelse eller tegn til lammelse i bakbena. Ikke la dyr uten tilsyn eller i nærvær av andre dyr inntil fullt restituert fra anestesi. Ikke bruk noen dyr som viser observer motoriske mangler.
    MERK: Selv om dette knuse lesjon kan utføres på alle nivåer langs ryggmargen, praktisk talt, T10-L4 utgjøre færre tekniske utfordringer for bildebehandling med hensyn til å puste og stabilisere kroppens bevegelser ved hjelp av klemmer. Klemme plassering må endres rundt brystkassen til bilde på thorax nivåer.

4. intra Imaging

  1. Forberede og autoklav kirurgiske verktøy, inkludert Dumont # 4 tang, iris saks, pinsett for å holde vev, nål delver og sår klipp.
  2. Bedøve mus som før med isofluran. Indusere anestesi på 4-5% og vedlikeholde på 1-2% som nødvendig for å opprettholde en pustefrekvens på 60-100 pust per minutt og en manglende respons på foten klemme. Hold musen oppvarmet, overvåke pustefrekvens når ikke imaging og kontinuerlig overvåke dyr temperatur med en rektal probe.
  3. Rens huden rundt såret klipp med Betadine og deretter alkohol og fjerne såret klipp i henhold til produsentens instruksjoner. Når sår klipp blir fjernet, fjerner hår med Nair hvis nødvendig og rengjøre området igjen med povidon-jod og 70% alkohol.
  4. Re-åpne huden med saks. Fjern eventuelle gjenværende sting fra muskel og trekke muskel fra hverandre med pinsett, kutte med saks hvis nødvendig.
  5. Under et disseksjonsmikroskop, skape lommer for ryggmargen klemmer ved å kutte muskelen med saks på siden av tverrtaggene på vertebra en ryggvirvel nivå over og under laminectomy.
  6. Plassere klemmer rundt hver av disse vertebra og stram. Justere etter behov for å gi rom for mikroskop mål å nå ryggmargen. Sørg for at ryggmargen er parallelt med bildebehandling plattform, og vedlikeholde vev stabilitet for bildebehandling. Hvis pusten artefakt er sett, omstille klemmer derfor å minimere bevegelse i bildefeltet.
  7. Dekk klemmer med parafilm.
  8. Ta av absorberbare gelatin komprimert svamp fra ryggmargen med pinsett, delikat å plukke ut så mange brikker som mulig, også fjerne så mye arrvev fra over hjernehinnene som mulig. Cover utsatt ryggmarg med saltvann og ny svamp.
    MERK: Hvis noen blødning oppstår fra omliggende muskler, enten trofast med svamp eller cauterize etter behov. Men ta vare ikke å røre ryggmargen med kirurgi. Dekk ryggmargen med enten et stykke fuktet vev eller gelatin komprimert svamp når cauterizing.
  9. Lag en well for å holde nedsenking fluid ved først å tette hud og vev med Vetbond, og deretter ved bruk av dental akryl å bygge opp en brønn mellom de to klemmer av ryggmargen holderen og sidene av dyret. Vent til akryl botemidler.
  10. Fyll godt med kunstig cerebral spinalvæske (aCSF) og sjekk igjen for noen blødning rundt kirurgi området.
  11. Eventuelt på dette punktet, injisere fluorescerende skipsfargestoffer intravenøst ​​ved halevenen injeksjon for å markere blodkar under bildebehandling.
    MERK: Fluorescent dekstran over 70 kDa er ofte brukt, selv om kvanteprikker og fluorescensmerkede lektiner også tjene som nyttige fartøy fargestoffer. 50 ul av 150000 WM TRITC-dekstran er vanligvis injiseres intravenøst.
  12. For å oppnå fysiologisk relevant immuncelle motilitet, må temperaturen av musen bli opprettholdt ved 37 ° C. Flytte musen til en temperatur kontrollert miljø under mikroskop for bildebehandling og overvåke dyret for riktige anesanestesi nivå av pustefrekvens og foten klemme. Overvåke dyret ofte under fotografering for å bestemme dybden av anestesi, med formål å oppnå en lufthastighet på 60-100 pust per minutt.
  13. Finn bildebehandling området gjennom mikroskop okularet.
  14. Justere to-foton laser scanning mikroskop for å ta en z-stack bildet hver 30-60 sek for å oppnå dynamiske bildedata.
  15. Når avbildnings er fullført fjernes dyret fra den oppvarmede boksen.
  16. Løsne ryggklemmene og ta musen fra klemmene. Trekk akryl vel vekk fra huden mens du fjerner klemmene.
  17. Hvis musen er å bli fotografert igjen, plasserer saltvann gjennomvåt gelatin komprimert svamp over ryggmargen. Lukke muskel og hud over kirurgi området. Ikke la dyr uten tilsyn eller i nærvær av andre dyr mens utvinne fra anestesi. Hvis dyret viser tegn på nevrologiske underskudd etter utvinning, skal dyret avlives. Ellers avlivemusen i en CO 2 kammer før det kommer ut anestesi ifølge IACUC-godkjent dødshjelp protokollen.
  18. Analysere fluorescerende bilder ved hjelp av bildeanalyse programvaren ved å følge instruksjonene fra produsenten.

Representative Results

Et skjematisk diagram som viser den dorsale kolonne knuse lesjon er vist i Figur 1A. Etter lesjon, blir dyret fremstilt og stabilisert for intravital mikroskopi ved hjelp av spinal klemmer (figur 1B). Et bilde tatt rett etter rygg kolonne knusningsskade viser en klart synlig rektangulær lesjon med pinsett tindeinnsettingspunktene som er klart identifiserbar. Axoner på skadestedet er kuttet over span av hele ryggsøyle (figur 1C). Integriteten av blodkar forblir intakt, og ingen tegn på fartøyet fargestoff lekkasje ble detektert ved fluorescens. Å utføre serie avbildning av den samme lesjon over uker, kan musklene og huden skal sys over laminektomi for påfølgende re-eksponering. Lignende lesjon morfologi er sett på senere tidspunkter (Tall 1D, E). 5 dager etter skade, pinsett innstikkssteder er fortsatt synlig, men lesjonen har begynt å øke i størrelse due til sekundærskader forårsaket av betennelse. Aksonene ved kaudal enden av lesjonen er trukket tilbake fra det første området av skaden via en prosess som kalles "aksonal dieback". Aksonene ved rostrale enden av lesjonen oppviste Wallerian lignende degenerasjon (figur 1D, E). Mellom 5 og 22 etter skade, har størrelsen på lesjonen stabilisert. Samtidig kan en stor tilstrømning av CX3CR1 + celler sees infiltrering i og rundt knuse lesjon i løpet av disse tidspunkter, selv om identiteten til disse celler (makrofager) microglia versus ikke kan skilles i fremstillingen som vist i figur 1.

For å skille oppførselen av mikroglia og makrofager i knuse lesjon mikromiljøet, ble en strålings chimera modellen benyttes (vist i figur 2A). Først blir benmargsstamceller i en CX3CR1 + / GFP mus erstattet med ikke-fluoriserende donor cells, og dermed bare GFP + CNS-resident mikroglia er synlige ved fluorescerende bildebehandling. Effektiviteten av marg rekonstituering kan bekreftes ved flowcytometri undersøkelse av perifert blod 8 uker etter margtransplantasjon (figur 2B, C). I figur 2B, F4 / 80 og GFP positive makrofager, fremhevet i blått, blir detektert i en CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 kimære mus, i hvilke noen GFP negative, men F4 / 80 positive monocytter er også til stede. I figur 2C, ingen doble positive F4 / 80 og GFP-positive celler blir igjen etter utskifting av CX3CR1 + / GFP mottaker benmarg med villtype benmarg. Før skade, er mikroglia jevnt fordelt i ryggmargen, viser en hvile, ramified morfologi (figur 2D). 8 dager etter skade, kan bare noen få mikroglia påvises i og rundt lesjonen. Disse mikroglia vise et amoeboid morfologi (2E). Sekund, beinmargstamceller i en ikke-fluoriserende mus er erstattet av margceller fra et CX3CR1 + / GFP mus derfor gjengi benmarg avledet CX3CR1 + monocytter / makrofager synlige ved GFP fluorescens (figur 2A). Før skade, den eneste GFP + celler detekteres er stort sett perivaskulær, som har blitt rapportert å være avledet benmarg og kontinuerlig slå over på en regelmessig basis 28 (figur 2F). Etter en knusningsskade, kan CX3CR1 + / GFP celler sees langs innsiden av blodårene som omgir lesjon (figur 2 H-J), og lesjonen sentrum er fylt med infiltrere CX3CR1 + / GFP makrofager (Figur 2G).

Tidsforløp avbildning av dorsal kolonnene kan bli utført i opptil 6 timer. I figur 3 viser vi en ikke-kimært CX3CR1 + / GFP mus umiddelbart etter skaden, hvor celler fra sirkulasjonen kan sen flytte ut av blodåren mot lesjon kjerne og flytter innenfor skadestedet (figur 3A, B; Supplemental Movie 1). Bildeanalyse utnytte fluorescens intensitet for å identifisere celler kan spore banene tatt av makrofager (figur 3A, B, Supplemental Movie 1). Tall fra bildeanalyse viser gjennomsnittlig motilitet av makrofager i lesjonen er 3,6 mikrometer / min (Figur 3D). Til slutt, på 22 dager etter skade, axoner, mikroglia og makrofager kan fortsatt bli oppdaget innen lesjonen demonstrere området bildebehandling er stabil over lang tid (Supplementary Movie 2).

Figur 1
Figur 1: Opprettelse og sekvensiell avbildning av rygg kolonne klemskade. (A) Den dorsaleKolonnen klemskade utføres ved å fjerne den dorsale prosessen av vertebra på nivået av interesse. Tang er satt inn i den dorsale kolonne av ryggmargen 1 mm fra hverandre, og blir så lukket tre ganger for å frembringe lesjonen er vist i purpur. (B) Dyret blir deretter plassert med ryggmargen klemmer for å oppnå stabilitet for intravital avbildning. (C) Umiddelbart etter skaden, kan pinsett innstikk (rød oval) og den rektangulære knusningsskade volum (grå boks) være tydelig identifisert. Aksoner i dorsal rot- kan sees (hvite piler), så vel som de skadede endene av aksonene på halesiden av lesjonen (fylte pilspisser). (D) 5 dager etter skade, pinsett innstikk (rød oval ), og omfanget av lesjonen (grå boksen) fortsatt kan lett visualiseres. Lesjonen har økt i størrelse siden den første fornærmelse. Aksoner gjennomgår Wallerian-lignende degenerasjon kan sees rostralt til lesjonen (åpen pil hoder) i additipå aksoner i dorsal rot- (hvite piler) og endene av skadde aksoner (hvite pilspisser). (E) 22 dager etter skade, er lesjonen området fortsatt identifiserbar med tilsvarende dimensjoner til skade etter 5 dager. Legg merke til det store antall CX3CR1 + -celler i og rundt det skadde området. Egenskaper som er merket, er de samme som i (D). Alle skala barer = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Bygging av kimære mus å spore CX3CR1 + / GFP uttrykke CNS-resident microglia eller benmargavledede makrofager i rygg kolonne knuse lesjon. (A) Et skjematisk diagram av kimære mus med enten generering CX3CR1 + / GFP uttrykke microglia eller makrofager. Først blir Thy-1 YFP H-mus bestrålt og benmargen rekonstitueres med margceller isolert fra en CX3CR1 + / GFP-mus, noe som resulterer i et kimært musemakrofager som er GFP +. For det andre er Thy-en YFP H / CX3CR1 + / GFP mus bestrålt og benmargen rekonstitueres med marg celler isolert fra et ikke-fluoriserende mus, produsere en kimære mus hvis mikroglia er GFP +. (B) Eksempel på flowcytometri data med F4 / 80 + og CX3CR1 GFP + celler i blod fra en kimære dyr med en CX3CR1 + / GFP marg donor transplanteres inn i et bestrålt C57BL / 6 mottaker. Celler avledet fra CX3CR1 positive givere som er positive for begge GFP og F4 / 80 er vist i det blå området markert. (C) Eksempel på flowcytometri data med F4 / 80 + og CX3CR1 GFP + celler i et kimært dyr med en C57BL6 donor marg transplantert inn en irStrålings CX3CR1 + / GFP mottaker. Legg merke til mangelen på dobbel positiv CX3CR1 + / GFP og F4 / 80 celler i blå uthevede området. (D) En intra to-foton mikroskopisk bilde av en mus fra første kimerisk ordningen, viser GFP + mikroglia med ramified morfologi innenfor rygg kolonne (pil hode). Disse cellene er ispedd blant axoner (gule) i rygg rot og rygg kolonnen. Skala bar = 100 nm. (E) intravital avbildning av den samme mus i (B) 8 dager etter ryggskader kolonne avslører noen CX3CR1 + mikroglia med store og amoeboid formede cellelegemer som mangler prosesser (pilhode). Skala bar = 100 nm. (F) øyeblikksbilde av en mus fra den andre kimære ordningen i (A), som viser snaut GFP + makrofager, innenfor CNS parenchyma. Skala bar = 100 nm. (G) intravital avbildning av den samme mus i (F) dorsal kolonne skade 8 dager etter avslører alarge tilstrømningen av makrofager i og rundt lesjonen. Skala bar = 100 nm. (H) En større forstørrelse bilde av CX3CR1 + blod avledede celler i kontakt med fartøyene i uskadde dyret. Skala bar = 30 mikrometer. (I) En rekonstruksjon av CX3CR1 celler i kontakt med beholderen, sett fra innsiden av beholderen. Skala bar = 30 mikrometer. (J) En rekonstruksjon av CX3CR1 celler i kontakt med beholderen, sett fra utsiden av beholderen. Skala bar = 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 3 :. Representative data celle sporing i et ikke-kimærisk CX3CR1 + / GFP mus umiddelbart etter rygg kolonne knuseskade. (A) Et øyeblikksbilde av CX3CR1 + mikroglia og makrofager rundt skadet axoner (gule) fra Supplerende Movie en umiddelbart etter en rygg kolonne klemskade. (B) Stiene (grå) tatt av CX3CR1 + celler i (A) i løpet av en 110 min intra bildebehandling økt. (C) En tidskodet representasjon av sporene i (B). Spor er farget på grunnlag av sin tid i hele 110 minutters film, som vist på tidslinjen. (D) histogram av den samlede motilitet av CX3CR1 + -celler. Alle skala barer er 30 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende Movie 1: Representant intra filmen umiddelbart etter rygg kolonne knusningsskade i dobbel heterozygot Thy-en YFP / + GFP / + mus. intra spinal bildebehandling ble utført umiddelbart etter en rygg kolonne klemskade på T11 nivå. Høyre panel viser bevegelsen av CX3CR1 + mikroglia og makrofager. Stiene i celle bevegelse vises som hvite spor på venstre panel. Skaden er lokalisert til øvre venstre hjørne. CX3CR1 + celler kan sees på vei inn i skadestedet langs disse sporene. Aksoner er vist i gult. Skala bar = 40 mikrometer. Total tid: 110 min. Avspillingshastighet: 300x.

Supplerende Movie 2:. Representant intra film på 22 dager etter rygg kolonne knuse lesjon i dobbel heterozygot Thy-en YFP / + / CX3CR1 GFP / + mus Vist her er en representant film tatt i en mus 22 dager etter den første rygg kolonne knuse skade på rygg nivå T11. Den injury ligger i øvre høyre hjørne av rammen. Aksoner (gul) stigende rostrally vises nederst til høyre. Rygg vene og blodårer er merket med TRITC-dekstran (rød). CX3CR1 + celler i lesjon flytte på en lavere hastighet sammenlignet med dem umiddelbart etter skade. Skala bar = 50 mikrometer. Total tid: 90 min. Avspillingshastighet: 600x.

Discussion

Imaging interaksjoner av ulike celletyper i sitt eget vev avdelinger under påfølgende patologi i sanntid har vakt stor interesse. Innen tett nettverk av CNS, celle-celle kontakt og signalering med tilstøtende celler er viktig for normal funksjon og for å forstå CNS patologi. Her har vi beskrevet anvendelse av 2-foton laser scanning mikroskop for observasjon av cellulær bevegelse i en mekanisk skade i ryggmargen. I tillegg til kvaliteten på operasjonen og vevspreparat, er mekanisk stabilitet av vev av vesentlig betydning for vellykket time-lapse mikroskopi, spesielt isolasjon av ryggmargen fra pustebevegelsesartefakter. Stabilitet kan bli vurdert ved å se på bevegelsen av ryggmargen under et disseksjonsmikroskop som svarer til den puls eller puste av dyret. Stabilitet bør vurderes både mens du utfører operasjonen og også umiddelbart før du begynner bildebehandling. Hvis animal er ikke stabil, justeringer bør gjøres til plassering og tetthet av ryggmargs klemmer. Celle-type spesifikke fluorescerende reporter musemodeller kombinert med benmargs chimera tilnærminger har tillatt identifisering av monocyttiske celler versus mikroglia og aksoner. Tidligere studier har vist at blod avledet monocytter og ikke mikroglia har ansvar for videregående aksonal skade etter traumer ved hjelp av metoden beskrevet her 43. Dekstran konjugert fartøy fargestoff tillater skipsidentifikasjon både å gi landemerker og å identifisere brudd i fartøyets integritet. Valget av den passende fluorescerende reporter musemodell er kritisk for å tillate identifikasjon av de ønskede celletyper som skal avbildes.

Utvikling av fluorescerende musemodeller som er aktuelle for de studiene som blir gjennomført er også avgjørende for å lykkes med eksperimenter. Skille mellom de to fagocytiske populasjoner av CX3CR1 + / GFP 52. Her har vi observert at antallet celler infiltrere inn i CNS ved stabil tilstand som et resultat av kimær generasjon er ubetydelig i motsetning til nummeneh av celler som kommer inn i lesjonen. Andre alternative modeller for å vurdere inkludere narkotikainduserte chimeras 52 eller parabiotic musemodeller 53.

Her har vi presentert et konkret, enkel og reproduserbar liten skade modell som resulterer i en lesjon til rygg hvit substans i ryggmargen som er lett å bilde ved hjelp av to-foton mikroskopi. Denne metoden gir også en kvantifiserbar lesjon å analysere graden av aksonal dieback i ryggsøyler som i litteraturen har blitt kombinert med utfyllende fast vev analyse 16,18,43,48,54. I denne modellen, dyr viser bare minimale underskudd og krever ingen spesiell behandling etter skade. Fremtidige studier med dorsal kolonne knuse skade- og imaging teknikker som er beskrevet her kan være kraftige screening verktøy for å vurdere effekten av behandling for ryggmargsskade. Disse behandlingene kan inkludere små molekyl hemmere, narkotika, celleprodukter, vev grafts og kombinatorisk behandlings. Samspillet mellom makrofager, mikroglia og neuroner er også sannsynlig å spille en rolle i andre sykdomsmodeller i ryggmargen, inkludert multippel sklerose, tumor, meningitt og amyotrofisk lateral sklerose, og denne teknikk kan være nyttig ved undersøkelsen av disse sykdommer, så vel .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CX3CR1 GFP mice Jackson laboratories 5582
Thy-1 YFP H mice Jackson laboratories 3782
Mouse pie cage Braintree Scientific MPC 2 set
60 mm2 Petri dish Corning 430166 For bone marrow isolation
Falcon 40 μm cell filter Fisher Scientific 08-771-1 For bone marrow isolation
1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube Fisher Scientific For bone marrow isolation
21 gauge needle BD 305177 For bone marrow isolation
1 ml syringe BD 309628 For bone marrow isolation
ACK lysis buffer Gibco A10492-01 For bone marrow isolation
HBSS Corning Cellgro 21-022-CV For bone marrow isolation
RPMI media Sigma R8758 For bone marrow isolation
F4/80 antibody Ebioscience 12-4801 PE For FACS verification of chimeras
30 gauge insulin syringe BD 328280 For tail vein injection
Spinal Cord Clamps Narshinge STS-A For imaging
Ortho-Jet Dental Acrylic powder Lang Dental REF1320 For imaging
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid Lang Dental REF1404 For imaging
Gelfoam gelatin sponges Pfizer 9034201 For imaging
4-0 Ethilon sutures Ethilon 1667G For surgery
Reflex Clips, 7 mm Kent Scientific INS750344 For surgery. Sterilize before use
Iris Scissors Fine Science Tools 14061-09 For surgery
45/5 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11251-35 For surgery
Rongeurs Fine Science Tools 16021-14 For surgery
30 gauge needle BD 305106 For making access holes in dura
Forceps Dumont #4 Biology tips Dumont 11242-40 For surgery
Needle Drivers Fine Science Tools 12002-12 For surgery
Michel Wound Clip Forceps Kent Scientific INS700753 For surgery
Wound clip remover Fine Science Tools 12033-00 For surgery
O-rings for Forceps Fine Science Tools 11200-00 For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately
Cordless Rechargable Animal trimmer Wahl Series 8900 for surgery
Vetbond 3M 1469SB For surgery
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) Purdue Products L.P. NDC 67618-150-08 For surgery
Nair Hair remover lotion Church & Dwight Co., Inc. NRSL-22329-05 For surgery
Isoflurane Butler Schein NDC 11695-6776-2 Drugs – for surgery
Marcaine Henry Schein NDC 0409-1587-50 Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously
Bupernex Henry Schein 121-7793 Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg
aCSF Chemicals from Sigma 119 mM NaCl
26.2 mM NaHCO3
2.5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1.3 mM MgCl2
10 mM glucose		 For surgery
From Cold Spring Harbor Protocols
TRITC-dextran 150,000 MW Sigma T1287 For intravenous administration to label vasculature

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  2. Kerschensteiner, M., Schwab, M., Lichtman, E., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11 (5), 572-577 (2005).
  3. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), 2760 (2012).
  4. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
  5. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  6. Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLoS One. 8 (3), 58081 (2013).
  7. Steffens, H., Nadrigny, F., Kirchhoff, F. In vivo two-photon imaging of neurons and glia in the mouse spinal cord. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (12), (2012).
  8. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18 (1), 166-171 (2012).
  9. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One. 6 (3), (2011).
  10. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  11. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591 (19), 4895-4902 (2013).
  12. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows). J Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  13. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord). Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
  14. Popovich, P. G., Jones, T. B. Manipulating neuroinflammatory reactions in the injured spinal cord: back to basics. Trends Pharmacol Sci. 24 (1), 13-17 (2003).
  15. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
  16. Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci. 28 (38), 9330-9341 (2008).
  17. Fitch, M. T., Silver, J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 209, 294-301 (2008).
  18. Busch, S. A., Horn, K. P., Silver, D. J., Silver, J. Overcoming macrophage-mediated axonal dieback following CNS injury. J Neurosci. 29 (2), 9967-9976 (2009).
  19. Popovich, P. G., van Rooijen, N., Hickey, W. F., Preidis, G., McGaughy, V. Hematogenous macrophages express CD8 and distribute to regions of lesion cavitation after spinal cord injury. Exp Neurol. 182 (2), 275-287 (2003).
  20. Popovich, P. G., et al. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158 (2), 351-365 (1999).
  21. Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci. 29 (43), 13435-13444 (2009).
  22. Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Shechter, R., et al. Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. PLoS Med. 6 (7), 1000113 (2009).
  25. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  26. Popovich, P. G., Hickey, W. F. Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 60 (7), 676-685 (2001).
  27. Ransohoff, R. M. Microglia and monocytes: 'tis plain the twain meet in the brain. Nat Neurosci. 14 (9), 1098-1100 (2011).
  28. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  29. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  30. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (1152).
  31. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  32. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  33. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
  34. Herber, D. L., et al. Diverse microglial responses after intrahippocampal administration of lipopolysaccharide. Glia. 53 (4), 382-391 (2006).
  35. Saederup, N., et al. Selective chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red fluorescent protein knock-in mice. PLoS One. 5 (10), 13693 (2010).
  36. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
  37. Iwasaki, A. The use of bone marrow-chimeric mice in elucidating immune mechanisms. Methods Mol Med. 127, 281-292 (2006).
  38. Spangrude, G. J. Assessment of lymphocyte development in radiation bone marrow chimeras. Curr Protoc Immunol. 4 (4.6), (2008).
  39. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
  40. Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation. J Vis Exp. e4208. , 4208 (2012).
  41. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  42. Jung, S., Schwartz, M. Non-identical twins - microglia and monocyte-derived macrophages in acute injury and autoimmune inflammation. Front Immunol. 3, 89 (2012).
  43. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp Neurol. 254, 109-120 (2014).
  44. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
  45. Lee, J. H., et al. A contusive model of unilateral cervical spinal cord injury using the infinite horizon impactor. J Vis Exp. 65, 3313-3310 (2012).
  46. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
  47. Zhang, Y. P., et al. Controlled cervical laceration injury in mice. J Vis Exp. 75, 50030 (2013).
  48. Shen, Y., et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 326 (5952), 592-596 (1126).
  49. Ek, C. J., et al. Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat spinal cord. PLoS One. 5 (8), e12021 (2010).
  50. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  51. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  52. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  53. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Bone Prinz, M. marrow cell recruitment to the brain in the absence of irradiation or parabiosis bias. PLoS One. 8 (3), e58544 (2013).
  54. Filous, A. R., Evans, T. A., Lang, B. T., Silver, J. Synaptic-like connections between dystrophic axons and NG2+ cells: Another reason for regeneration failure after spinal cord injury. Neuroscience 2013, Society for Neuroscience. , Abstracts. San Diego. (2013).

Tags

Cellular Biology intra ryggmarg knusningsskade chimera mikroglia makrofager rygg kolonne knuse aksonal dieback
Intra Imaging av aksonal Interaksjoner med Microglia og makrofager i en mus Dorsal kolonne Crush Injury
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evans, T. A., Barkauskas, D. S.,… More

Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury. J. Vis. Exp. (93), e52228, doi:10.3791/52228 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter