Qui vi presentiamo un protocollo per analizzare le interazioni RNA / proteine. Il saggio spostamento mobilità elettroforetica (EMSA) si basa sulla migrazione differenziale di complessi RNA / proteine e RNA libero durante elettroforesi su gel nativo. Utilizzando una sonda RNA radioattivo, RNA complessi / proteici possono essere visualizzati mediante autoradiografia.
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Articolo metodologico
Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio
In questo articolo
Sommario
Abstract
Interazioni RNA / proteine sono fondamentali per vie di regolazione post-trascrizionale. Tra le RNA-binding proteins citosoliche più caratterizzati sono proteine regolatrici del ferro, IRP1 e IRP2. Si legano al ferro elementi responsivi (IRES) all'interno delle regioni non tradotte (UTR) dei diversi mRNA bersaglio, controllando così la traduzione mRNA o la stabilità. Interazioni IRE / IRP sono stati ampiamente studiati da EMSA. Qui, descriviamo il protocollo EMSA per analizzare l'attività IRE vincolante di IRP1 e IRP2, che può essere generalizzato per valutare l'attività di altri RNA-binding proteins pure. Un lisato proteina grezza contenente una proteina legante l'RNA, o una preparazione purificata di questa proteina, viene incubato con un eccesso di 32 sonda RNA P-marcato, consentendo la formazione del complesso. L'eparina è aggiunto precludere proteina non specifica per sondare vincolante. Successivamente, la miscela viene analizzata mediante elettroforesi non denaturante su un gel di poliacrilammide. La sonda gratuitomigra veloce, mentre l'RNA / proteine mostre complesse mobilità ritardato; di conseguenza, la procedura è chiamata anche "il ritardo gel" e il dosaggio "bandshift". Dopo il completamento della elettroforesi, il gel viene essiccato e complessi RNA / proteine, così come sonda free, vengono rilevati mediante autoradiografia. L'obiettivo generale del protocollo è quello di individuare e quantificare IRE / IRP e altre interazioni RNA / proteine. Inoltre, EMSA può anche essere usato per determinare la specificità, l'affinità di legame, e stechiometria dell'interazione RNA / proteina in esame.
Introduzione
L'EMSA è stato originariamente sviluppato per studiare l'associazione di proteine che legano il DNA con sequenze di DNA bersaglio 1,2. Il principio è simile per le interazioni RNA / proteine 3, che è il focus di questo articolo. Brevemente, l'RNA è caricato negativamente e migrerà verso l'anodo durante non denaturante elettroforesi in poliacrilammide (o agarosio gel). Migrazione nel gel dipende dalla dimensione del RNA, che è proporzionale alla sua carica. Legame specifico di una proteina di RNA altera la sua mobilità, e le migra complessi più lento rispetto alla RNA libera. Ciò è dovuto principalmente ad un aumento della mas....
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Protocollo
Procedure sperimentali con i topi sono stati approvati dal Comitato di McGill University (protocollo 4966) Animal Care.
1. Preparazione di estratti proteici di cellule in coltura
- Lavare le cellule in coltura per due volte con 10 ml di fosfato ghiacciata salina tamponata (PBS).
- Raschiare cellule aderenti sia con un poliziotto gomma o un raschietto cellulare plastica in 1 ml di sospensione di PBS, trasferimento fredda in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Spin in una microcentrifuga per 5 minuti a 700 xg, a 4 ° C. Aspirare PBS.
- Aggiungere 100 ml di tampone di lisi citoplasmatica ghiacciata
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Risultati
Una sonda radiomarcata IRE è stato preparato, come descritto nelle sezioni 3 e 4 del protocollo. La sequenza della sonda era 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; i nucleotidi in grassetto rappresentano un residuo C spaiato e il ciclo, che sono caratteristiche critiche IRE. La radioattività specifica della sonda era 4,5 x 10 9 cpm / mg di RNA.
Per valutare gli effetti delle perturbazioni ferro sull'attività IR.......
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Discussione
Qui, descriviamo un protocollo che è stato sviluppato per studiare le attività IRE vincolanti di IRP1 e IRP2, e mostriamo dati rappresentativi. Utilizzando diverse sonde, questo protocollo può essere regolato anche per lo studio di altre proteine-RNA vincolante. Un punto critico è la dimensione della sonda. L'utilizzo di sonde lunghe, che è comune quando l'esatto sito di legame è sconosciuto, può portare a complessi RNA / proteine che non migrano in modo diverso rispetto alla RNA gratuito. In questo caso, è op.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dell'Istituto canadese per la ricerca sanitaria (MOP-86514).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| leupeptin | SIGMA | L2884 | |
| PMSF | SIGMA | 78830 | |
| Saggio delle proteine BioRad | BIORAD | 500-0006 | |
| T7 RNA polimerasi | Termoscientifico | EPO111 | |
| Inibitore della RNasi | Invitrogen | 15518-012 | |
| UTP [alfa-32P] | Perkin-Elmer | ||
| Liquido di scintillazione | Beckman Coulter | 141349 | |
| eparina | SIGMA | H0777 | |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 | |
| Nome dell'apparecchiatura | |||
| Ruptor tissutale | Qiagen | 9001271 | |
| Contatore di scintillazione | Beckman Coulter | LS6500 | |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 | |
| pettini a 20 pozzetti | BIORAD | 165-1868 | spessore 1,5 |
| mm distanziatori | BIORAD | 165-1849 | |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Riferimenti
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A.
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Ristampe e permessi
