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Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio

Published: December 3, 2014 doi: 10.3791/52230
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Department of Medicine, McGill University

Summary

Qui vi presentiamo un protocollo per analizzare le interazioni RNA / proteine. Il saggio spostamento mobilità elettroforetica (EMSA) si basa sulla migrazione differenziale di complessi RNA / proteine ​​e RNA libero durante elettroforesi su gel nativo. Utilizzando una sonda RNA radioattivo, RNA complessi / proteici possono essere visualizzati mediante autoradiografia.

Abstract

Interazioni RNA / proteine ​​sono fondamentali per vie di regolazione post-trascrizionale. Tra le RNA-binding proteins citosoliche più caratterizzati sono proteine ​​regolatrici del ferro, IRP1 e IRP2. Si legano al ferro elementi responsivi (IRES) all'interno delle regioni non tradotte (UTR) dei diversi mRNA bersaglio, controllando così la traduzione mRNA o la stabilità. Interazioni IRE / IRP sono stati ampiamente studiati da EMSA. Qui, descriviamo il protocollo EMSA per analizzare l'attività IRE vincolante di IRP1 e IRP2, che può essere generalizzato per valutare l'attività di altri RNA-binding proteins pure. Un lisato proteina grezza contenente una proteina legante l'RNA, o una preparazione purificata di questa proteina, viene incubato con un eccesso di 32 sonda RNA P-marcato, consentendo la formazione del complesso. L'eparina è aggiunto precludere proteina non specifica per sondare vincolante. Successivamente, la miscela viene analizzata mediante elettroforesi non denaturante su un gel di poliacrilammide. La sonda gratuitomigra veloce, mentre l'RNA / proteine ​​mostre complesse mobilità ritardato; di conseguenza, la procedura è chiamata anche "il ritardo gel" e il dosaggio "bandshift". Dopo il completamento della elettroforesi, il gel viene essiccato e complessi RNA / proteine, così come sonda free, vengono rilevati mediante autoradiografia. L'obiettivo generale del protocollo è quello di individuare e quantificare IRE / IRP e altre interazioni RNA / proteine. Inoltre, EMSA può anche essere usato per determinare la specificità, l'affinità di legame, e stechiometria dell'interazione RNA / proteina in esame.

Introduction

L'EMSA è stato originariamente sviluppato per studiare l'associazione di proteine ​​che legano il DNA con sequenze di DNA bersaglio 1,2. Il principio è simile per le interazioni RNA / proteine ​​3, che è il focus di questo articolo. Brevemente, l'RNA è caricato negativamente e migrerà verso l'anodo durante non denaturante elettroforesi in poliacrilammide (o agarosio gel). Migrazione nel gel dipende dalla dimensione del RNA, che è proporzionale alla sua carica. Legame specifico di una proteina di RNA altera la sua mobilità, e le migra complessi più lento rispetto alla RNA libera. Ciò è dovuto principalmente ad un aumento della massa molecolare, ma anche ad alterazioni nella carica e possibilmente conformazione. Utilizzando un RNA marcato come sonda permette un facile monitoraggio del "ritardo gel" o "bandshift". L'utilizzo di 32 sonde RNA P-marcato è molto comune e offre alta sensibilità. La migrazione di RNA / complessi proteici e RNA libero vengono rilevatimediante autoradiografia. Inconvenienti sono breve emivita di 32 P (14,29 giorni), il progressivo deterioramento della qualità della sonda a causa radiolisi, il requisito di una licenza radioattività e infrastruttura per lavoro radioattività, e potenziali problemi di biosicurezza. Pertanto, sono stati sviluppati metodi non isotopici alternativi per etichettare la sonda RNA, per esempio con fluorofori o biotina, che consentono il rilevamento da parte di imaging fluorescente o chemiluminescente 4,5. Limitazioni di questi metodi sono il costo elevato e spesso ridotta sensibilità rispetto all'etichettatura isotopica, e il potenziale di etichette non isotopici di interferire con l'interazione RNA / proteine. Gel non denaturante di poliacrilammide sono adatti per la maggior parte delle applicazioni di EMSA e sono comunemente usati. Occasionalmente, gel di agarosio possono rappresentare un'alternativa per l'analisi di grandi complessi.

Il principale vantaggio di EMSA è che combina semplicità, sensibilità, robustezza e 4 </ Sup>. Il test può essere completato nel giro di poche ore e non richiede una strumentazione sofisticata. Interazioni RNA / proteine ​​possono essere rilevati da EMSA a concentrazioni basse come 0,1 nm o inferiori, e all'interno di una vasta gamma di condizioni vincolanti (pH 4,0-9,5, la concentrazione di sale monovalente 1-300 mM, e la temperatura 0 - 60 ° C).

RNA / proteine ​​formazione del complesso può essere studiato mediante il saggio filtro vincolante. Questa è una procedura semplice, veloce ed economico basato sulla conservazione dei complessi RNA / proteine ​​in un filtro di nitrocellulosa, mentre una sonda di RNA libera attraversa 6. Rispetto al EMSA, è limitato nei casi in cui la sonda RNA contiene più siti di legame, o l'estratto grezzo contiene più di un RNA-binding proteins che si legano alla sonda nello stesso sito. Mentre molteplici interazioni RNA / proteine ​​sfuggiranno rilevamento da parte del saggio di filtro di legame, possono essere facilmente visualizzati tramite EMSA. In alcuni casi, la visualizzazione è vigilian possibile quando due complessi RNA / proteine ​​co-migrazione (per esempio, IRP1 umana / IRE e IRP2 / complessi IRE), con l'aggiunta di un anticorpo contro una delle RNA-binding proteins alla reazione EMSA, ottenendo un'ulteriore ritardo sul gel ( "supershift") 7.

L'EMSA è stato ampiamente utilizzato per studiare IRP1 e IRP2, che sono regolatori post-trascrizionali del metabolismo del ferro 8-10. Operano legandosi a IRE, strutture tornante filogeneticamente conservate nelle UTR di diversi mRNA 11. IRE sono stati scoperti nel mRNA codificanti ferritina 12 e transferrina recettore 1 (TfR1) 13, proteine ​​di stoccaggio ferro e l'assorbimento, rispettivamente. Più tardi, IRE sono stati trovati in specifici eritroide aminolevulinato sintasi (ALAS2) 14, aconitasi mitocondriale 15, ferroportina 16, divalente metallo transporter 1 (DMT1) 17, ipossia fattore inducibile 2 18, e altri mRNA 19-21. Il H- prototipi e mRNA L-ferritina contengono una IRE nella loro 5 'UTR, mentre TfR1 mRNA contiene più IRE nel suo 3' UTR. Interazioni IRE / GIV specificamente inibiscono ferritina traduzione mRNA da stericamente bloccando la sua associazione delle subunità ribosomiale 43S; inoltre, si stabilizzano TfR1 mRNA contro taglio endonucleolitico. IRP1 e quota IRP2 ampia similarità di sequenza e presentano un'elevata attività-IRE legame in cellule di ferro-fame. Nelle cellule ferro-piena, IRP1 assembla un cubano Fe-S cluster che converte in aconitasi citosolica a scapito della sua attività IRE vincolante, mentre IRP2 subisce la degradazione del proteasoma. Pertanto, le interazioni IRE / IRP dipendono dal livello di ferro cellulare, ma sono anche regolati da altri segnali, quali H 2 O 2, ossido nitrico (NO) o ipossia. Qui, descriviamo il protocollo per valutare l'attività IRE vincolante da estratti di cellule e tessuti greggi da EMSA. Abbiamo utilizzato un 32 P-marcato H-ferritina sonda IRE che è stato generato mediante trascrizione in vitro da un modello DNA plasmidico (I-12.CAT), dove la sequenza IRE è stato inizialmente introdotto in orientamento senso valle del sito polimerasi T7 RNA da clonazione di ricotto oligonucleotidi sintetici 22.

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Protocol

Procedure sperimentali con i topi sono stati approvati dal Comitato di McGill University (protocollo 4966) Animal Care.

1. Preparazione di estratti proteici di cellule in coltura

  1. Lavare le cellule in coltura per due volte con 10 ml di fosfato ghiacciata salina tamponata (PBS).
  2. Raschiare cellule aderenti sia con un poliziotto gomma o un raschietto cellulare plastica in 1 ml di sospensione di PBS, trasferimento fredda in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  3. Spin in una microcentrifuga per 5 minuti a 700 xg, a 4 ° C. Aspirare PBS.
  4. Aggiungere 100 ml di tampone di lisi citoplasmatica ghiacciata (Tabella 1) per 10 7 cellule, e pipetta su e giù.
  5. Incubare in ghiaccio per 20 min.
  6. Spin per 10 min a piena velocità in una microcentrifuga a 4 ° C.
  7. Pellet Rifiuta. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga e tenere in ghiaccio.
  8. Detconcentrazione ermine di proteine ​​(di solito 1-10 mg / mL) con il saggio Bradford 23.
  9. Aliquota e cellulari negozio estratti a -80 ° C fino al momento dell'uso.

2. Preparazione di estratti di proteine ​​di topo fegato e milza

  1. Euthanize un mouse con CO 2 inalazione.
  2. Posare l'animale eutanasia su un tappetino pulito su una tavola di dissezione. Aprire l'addome con le forbici.
  3. Staccare il fegato e la milza, utilizzando forbici e pinze, e lavare ogni tessuto in circa 50 ml ghiacciata PBS.
  4. Subito tagliare tessuti in piccoli pezzi con un bisturi (ad esempio: circa 1 - 2 mm 3).
  5. Senza indugio, mettere pezzi di tessuto in una fresca cryotube e quindi far scattare congelarli in azoto liquido. Conservare snap-congelati aliquote tessuto a -80 ° C fino al momento dell'uso.
  6. Omogeneizzare un pezzo di tessuto congelato (circa 1 - 2 mm 3) in 0,25-0,5 ml dighiacciato tampone di lisi citoplasmatica (Tabella 1) con un omogeneizzatore tessuto per 10 sec.
  7. Trasferimento omogeneizzato a 1,5 ml provetta e freddo in ghiaccio per 20 min.
  8. Spin per 10 min a piena velocità in una microcentrifuga a 4 ° C.
  9. Eliminare pellet e trasferimento surnatante in nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Mantenere su ghiaccio.
  10. Determinare la concentrazione di proteine ​​(di solito 1-10 mg / mL) con il saggio Bradford 23.
  11. Aliquota e cellulari negozio estratti a -80 ° C fino al momento dell'uso.

3. Preparazione di marcata radioattivamente IRE-probe

  1. Linearizzare il IRE contenenti plasmide I-12.CAT 22 incubando a 37 ° C per 1 ora con l'endonucleasi di restrizione XbaI (1 U per pg di plasmide), che scinde a valle della sequenza IRE. Il plasmide linearizzato sarà utilizzato come stampo per la trascrizione in vitro.
  2. Impostare unn in vitro reazione di trascrizione in un volume totale di 20 microlitri. Utilizzare le soluzioni azionari riportati in Tabella 2 e aggiungere: 1 ml modello plasmide linearizzato, buffer di trascrizione 4 ml; 1 ml mix di ATP mix / CTP / GTP, 10 ml [α- 32 P] -UTP, 2 microlitri ditiotreitolo, inibitore RNasi 1 ml e 1 ml T7 RNA polimerasi. Mescolare pipettando su e giù.
  3. Incubare a 40 ° C per 1 ora 24.

4. Purificazione di marcata radioattivamente IRE-probe

  1. Terminare la reazione di trascrizione in vitro con l'aggiunta di 1 ml di 0,5 M EDTA, pH 8. Mix pipettando su e giù.
  2. Aggiungere 10 ml di 10 mg / ml tRNA, come supporto per una migliore precipitazione. Mescolare pipettando su e giù.
  3. Aggiungere 82,5 ml di 3 M acetato di ammonio. Mescolare nel vortex.
  4. Aggiungere 273 ml di etanolo. Mescolare nel vortex.
  5. Lasciar riposare a temperatura ambiente per 5 min.
  6. Spin per 10 min a piena velocità in una microcentrifuga a RT. Surnatante Rifiuta.
  7. Lavare pellet con 100 ml di etanolo al 70%.
  8. Spin per 10 min a piena velocità in una microcentrifuga a RT. Surnatante Rifiuta.
  9. Aria pellet secco per 10 min.
  10. Risospendere pellet in 100 ml di bidistillata, precedentemente sterilizzato in autoclave H 2 O.
  11. Quantificare la radioattività in un contatore a scintillazione liquida, sonda IRE aliquota radiomarcato e conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso. Aliquote congelate possono essere usati fino a 3 settimane.

5. Preparazione di un gel di poliacrilammide nativo per EMSA

  1. Montare il gel (16 x 16 cm), utilizzando 1,5 millimetri distanziali e pettine.
  2. Per preparare un gel di poliacrilammide nativo il 6%, utilizzare le soluzioni madre indicate nella Tabella 3 Mescolare 7,5 ml di 40% acrilamide:. Bisacrilammide, 5 ml di 5x TBE e 37,5 mldoppia H distillata 2 O.
  3. Aggiungere 0,5 ml di 10% persolfato preparata ammonio (APS) e 25 ml tetrametiletilendiammina (TEMED).
  4. Versare immediatamente la soluzione acrilamide al gel e lasciare polimerizzare. Attendere per circa 30 min.
  5. Montare l'apparecchiatura elettroforesi con il gel, riempire i serbatoi con 0,5x TBE e connettersi con l'alimentazione.

6. Electrophoretic Mobility Shift Assay

  1. Diluire 25 mg di estratto proteico da cellule o tessuti con citoplasmatica tampone di lisi (Tabella 1) in un volume totale di 10 microlitri in (concentrazioni proteiche inferiori possono anche essere utilizzati). Mantenere su ghiaccio. Se necessario, aggiungere 1 ml di 1: 4 diluito 2-mercaptoetanolo (2-ME) per attivare IRP1 dormiente (concentrazione finale: 2%) 25.
  2. Diluire la sonda radioattivo IRE in doppia H 2 O distillata a 200.000 cpm / ml, denaturare calore a 95 °C per 1 min e raffreddare a temperatura ambiente per almeno 5 minuti.
  3. Impostare una reazione EMSA aggiungendo 1 ml di sonda IRE radioattivo al estratto proteico.
  4. Incubare per 20 minuti a RT.
  5. Aggiungere 1 ml di 50 mg / ml di eparina alla reazione (per inibire le interazioni proteina non specifiche con la sonda 9) e continuare l'incubazione per altri 10 min. Aliquota della soluzione madre di eparina (50 mg / ml) e conservare a -80 ° C.
  6. Quando si utilizzano sonde lunghe radiomarcati (> 60 nucleotidi), aggiungere 1 ml RNasi T1 (1 U / ml) e incubare per 10 minuti a RT per ridurre proteina legame non specifico alla sonda, e per consentire una migliore separazione della RNA / proteine complesso durante l'elettroforesi.
  7. Aggiungere 3 ml di tampone di caricamento (80% glicerolo + bromofenolo blu), mescolare e carico sul non-denaturazione gel di poliacrilammide al 6%.
  8. Eseguire il gel per 60 min a 130 V (5 V / cm).
  9. Trasferimento il gel su una grande carta da filtro e asciutta.
  10. Esporre a un film e sviluppare autoradiografia. Tempo di esposizione può variare da 1 ora (o meno) fino a O / N.

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Representative Results

Una sonda radiomarcata IRE è stato preparato, come descritto nelle sezioni 3 e 4 del protocollo. La sequenza della sonda era 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; i nucleotidi in grassetto rappresentano un residuo C spaiato e il ciclo, che sono caratteristiche critiche IRE. La radioattività specifica della sonda era 4,5 x 10 9 cpm / mg di RNA.

Per valutare gli effetti delle perturbazioni ferro sull'attività IRE vincolante, macrofagi RAW264.7 murini sono stati lasciati non trattati, o trattati con emina (fonte ferro) o deferoxamina (chelante del ferro). Lisati sono stati preparati e analizzati da EMSA con la sonda IRE (8.000 cpm proteina / mg). I dati rappresentativi sono mostrati in figura 1, con esposizioni più brevi e più lunghe delle autoradiogrammi sui pannelli sinistro e destro, rispettivamente. Murine IRE / IRP1 e IRE / IRP2 complessi esibiscono mobilità diversa e due bande distintesono visibili in corsia 1, corrispondenti a cellule non trattate. La chelazione del ferro profondamente indotto le attività IRE vincolanti sia IRP1 e IRP2 (corsia 2), mentre la supplementazione di ferro li diminuita (corsia 3). Il pretrattamento con IRP1 2% 2-ME completamente attivato (pannello inferiore), anche in estratti di cellule di ferro-trattata. Ciò dimostra che le perturbazioni ferro non incidono sulla stabilità del IRP1 e serve anche come controllo di caricamento. Al contrario il pretrattamento 2-ME inibito l'attività IRE vincolante IRP2. I veloce migrazione bande non specifiche non sono interessati da ferro.

Successivamente, abbiamo analizzato l'attività IRE vincolante in fegati di tipo selvatico, IRP1 - / - e IRP2 - / - mice, precedentemente alimentati per una settimana con uno standard o una dieta arricchita di ferro (Figura 2). Il IRP1 - / - e IRP2 - / - topi sono stati gentilmente forniti dal Dr. MW Hentze (EMBL, Heidelberg). In estratti di fegato di tipo selvatico, IRP1 rappresentava la principale frazione di attività IRE vincolante e IRE complessi / IRP2 erano difficilmentevisibili (corsie 1, 2), in accordo con precedenti osservazioni 26. IRP2 esposto potente attività IRE vincolante in estratti di fegato di IRP1 - / - mice (corsie 3, 4). In queste condizioni, non sono state osservate IRE / complessi IRP1. Allo stesso modo, nessun complesso IRE / IRP2 si sono formati in estratti di fegato di IRP2 - / - mice (corsie 5, 6). Nutrire i topi con una dieta ricca di ferro è diminuito epatica attività IRE vincolante sia IRP1 e IRP2; questo effetto è stato più drammatico sul IRP2 (corsie 7-12). Si noti che dopo il trattamento di tipo selvatico o IRP2 - / - estratti di fegato con 2-ME, l'attività IRE vincolante IRP1 stato migliorato per un punto in cui si è quasi tutta sonda IRE (questo è chiaramente osservata nel più breve esposizione dei autoradiogrammi sul pannello di sinistra).

Infine, abbiamo valutato l'attività IRE-binding in fegato e milza di tipo selvaggio e HJV - / - mice (Figura 3). Il HJV - / - topi sono stati gentilmente forniti dal Dr. NC Andrews (Duke University, NC). Questi animali rappresentano un modellodi emocromatosi ereditaria 27, una malattia del sovraccarico di ferro sistemico, dove il ferro eccessiva accumula nelle cellule parenchimali, mentre i macrofagi reticoloendoteliali rimangono carente di ferro 28. Come previsto, i fegati di HJV - / - mice (con epatociti ferro-caricata) hanno presentato ridotti attività IRE vincolante rispetto al wild-type (corsie 1-4). Al contrario, l'attività IRE vincolante è stata più elevata in milza di HJV - / - mice (contenenti macrofagi ferro-carenti; corsie 5-8). Anche qui, il trattamento 2-ME promosso quasi completa spostamento della sonda IRE negli estratti epatici (vedi più breve esposizione degli autoradiogrammi sul pannello di sinistra).

Tabella 1. tampone di lisi citoplasmatici.

1% Triton X100
25 mM Tris-HCl, pH 7.4
KCl 40 mM
  1. La soluzione dovrebbeAutoclavabili e conservati a temperatura ambiente.
  2. Gli inibitori della proteasi, come ad esempio 10 mg / ml leupeptina e 0,1 mm di fluoruro phenylmethanesulfonyl (PMSF) possono essere aggiunti prima dell'uso.
  3. L'aggiunta di dithiotheritol 1 mM fresco è consigliato per la rilevazione di attività IRP2.

Tabella 2. Le soluzioni madre per vitro reazione di trascrizione in.

1 mg / ml modello plasmide linearizzato
Buffer trascrizione 5x (fornito con T7 RNA polimerasi)
Mix di ATP, CTP e GTP 20 mM
3.000 Ci / mmol [α-32P] -UTP
Ditiotreitolo 100 mM
/ Inibitore RNase ml 10 U
20 U RNA / ml T7 polimerasi


<strong> Tabella 3. Soluzioni di riserva per non denaturare elettroforesi su gel di poliacrilammide.

40% acrilammide: bisacrilammide (37.5: 1)
5x TBE (Tris / borato / EDTA)

Per fare 1 L di 5x TBE, utilizzare 54 g di Tris base, 27,5 g di acido borico, e 20 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0).

Figura 1
Figura 1. regolazione ferro-dipendente delle attività IRE vincolante nei macrofagi RAW264.7. 10 7 cellule erano o sinistra O non trattata o trattata / N con 100 micron emina o deferoxamina. Lisati citoplasmatici sono stati preparati ed analizzati mediante EMSA con un P-marcato sonda 32 IRE in assenza (alto) o la presenza di 2% 2-ME (bottom). Le posizioni di IRE / IRP1 e complessi IRE / IRP2, e di sonda IRE gratuito sono indicati da frecce. La stella indica una banda non specifico. Esposizioni più brevi e più a lungo dei autoradiogrammi sono mostrati in pannelli sinistro e destro rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Analisi delle attività IRE vincolanti in fegati di wild type (WT), IRP1 - / - e IRP2 - / -. Topi cinque settimane di età topi (n = 2 per ogni genotipo), il tutto in C57BL / 6 di fondo 29, sono stati collocati su uno standard o una dieta ricca di ferro (contenente 2% di ferro carbonile). Dopo una settimana gli animali sono stati sottoposti ad eutanasia. Estratti proteici epatici sono stati preparati e analizzati da EMSA con un P-marcato sonda 32 IREin assenza (alto) o la presenza di 2% 2-ME (bottom). Le posizioni di IRE / IRP1 e complessi IRE / IRP2, e di sonda IRE gratuito sono indicati da frecce. La stella indica una banda non specifico. Esposizioni più brevi e più a lungo dei autoradiogrammi sono mostrati in pannelli sinistro e destro rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Analisi delle attività nel fegato e milza di wild type (WT) e HJV IRE vincolante - / - mice. 10 settimane di età topi (n = 2 per ogni genotipo), il tutto in C57BL / 6 di fondo 30, sono stati eutanasia. Epatica e estratti proteici splenici sono stati preparati ed analizzati mediante EMSA con un P-marcato sonda 32 IRE in assenza (alto) o la presenza di2% 2-ME (in basso). Le posizioni di IRE / IRP1 e complessi IRE / IRP2, e di sonda IRE gratuito sono indicati da frecce. La stella indica una banda non specifico. Esposizioni più brevi e più a lungo dei autoradiogrammi sono mostrati in pannelli sinistro e destro rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui, descriviamo un protocollo che è stato sviluppato per studiare le attività IRE vincolanti di IRP1 e IRP2, e mostriamo dati rappresentativi. Utilizzando diverse sonde, questo protocollo può essere regolato anche per lo studio di altre proteine-RNA vincolante. Un punto critico è la dimensione della sonda. L'utilizzo di sonde lunghe, che è comune quando l'esatto sito di legame è sconosciuto, può portare a complessi RNA / proteine ​​che non migrano in modo diverso rispetto alla RNA gratuito. In questo caso, è opportuno rimuovere RNA non legato mediante trattamento con RNasi T1 (passo 6.6). La qualità della sonda è anche molto importante. I migliori risultati si ottengono con appena preparato RNA radioattivo. Purificazione Gel 10 non è necessario, ma può migliorare l'aspetto del EMSA se la reazione di trascrizione in vitro per la preparazione sonda produce prodotti premature terminazione (e se non RNAse T1 fase di digestione è incluso). Esecuzione del gel elettroforesi nativa troppo veloce may causare surriscaldamento, che potrebbe portare alla dissociazione di complessi RNA / proteine ​​e causare bande fuzzy.

Risultati quantitativi possono essere ottenuti analizzando l'intensità delle bande ritardati con phosphorimaging. Quantificazioni sono validi solo quando la sonda RNA è presente in eccesso e non è limitante per l'RNA vincolante. L'affinità di interazione RNA / proteine, rappresentata dalla costante di dissociazione K d che è collegato al DeltaG energia libera o, può essere valutata in condizioni di equilibrio titolando l'attività legante l'RNA al diminuire quantità di sonda radiomarcata 3. L'interazione IRE / IRP1 è stato ampiamente caratterizzato fisico-chimica 9,31. Titolazione EMSA esperimenti con diverse quantità di una proteina-RNA binding possono essere eseguite per calcolare stechiometria 3. Specificità per il legame può essere facilmente validato da esperimenti di competizione con eccesso di senza etichetta comp "a freddo"etitor RNA 3. Solo concorrenti specifiche dovrebbero ridurre l'intensità della banda radioattiva ritardato. Specificità può anche essere monitorato includendo un anticorpo contro la proteina-RNA binding nella reazione EMSA, che produrrà un "supershift" 7. Questo può anche essere sfruttato per determinare l'identità della proteina-RNA vincolante. No "supershift" dovrebbe essere osservato con anticorpi non specifici o di siero pre-immune.

In conclusione, l'EMSA è un metodo efficace per l'analisi delle interazioni RNA / proteine. È relativamente facile da eseguire e richiede infrastrutture minime. Non è semplice come il saggio filtro vincolante, ma produrrà dati più informativi e accurati quando più RNA-binding proteins interagiscono specificamente con la sonda (come IRP1 e IRP2). Va notato che, a differenza murine, IRE umana / IRP1 e IRE / IRP2 complessi co-migrano in EMSA. Tuttavia, possono essere separate da "supershifts̶1; con anticorpi specifici 7. L'EMSA non è utile per la mappatura dettagliata delle interazioni RNA / proteine; altre tecniche, quali il test di protezione RNAse, toeprinting o reticolanti 32 sono più adatti. Tuttavia l'EMSA è una scelta eccellente per scoprire nuove interazioni RNA / proteine, come è stato il caso con IRP 8, ma anche per corroborare i dati ottenuti con approcci sperimentali di throughput computazionale o alto. Inoltre, l'EMSA è superiore per l'analisi di specificità e proprietà fisico-chimiche delle interazioni RNA / proteine.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio
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Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

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