Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.
Abstract
RNA / Protein-Interaktionen sind entscheidend für die Post-Transkriptionsregulationswege. Unter den am besten charakterisierten zytosolische RNA-bindende Proteine sind Eisen regulatorischen Proteinen, IRP1 und irp2. Sie binden an responsive Elemente (IRES) innerhalb der untranslatierten Regionen (UTR) von mehreren Ziel-mRNAs bügeln, damit die mRNA Translation oder Stabilität Steuerung. IRE / IRP Wechselwirkungen wurden weitgehend von der EMSA untersucht. Hier beschreiben wir die EMSA-Protokoll für die Analyse der IRE-Bindungsaktivität von IRP1 und irp2, die generali können, um die Aktivität von anderen RNA-bindenden Proteinen und zu beurteilen. A Rohprotein Lysat eine RNA-Bindungsprotein, oder ein gereinigtes Präparat des Proteins enthält, wird mit einem Überschuss von 32 P-markierten RNA-Sonde inkubiert, wobei zur Komplexbildung. Heparin zugesetzt wird, um nicht-spezifische Protein ausschließen zu Sondenbindung. Anschließend wird die Mischung durch nicht-denaturierende Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel analysiert. Die freien Sondewandert schnell, während die RNA / Proteinkomplex Exponate verzögert Mobilität; daher wird das Verfahren auch als "Gelretardation" oder "Bandshift" -Assay. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel getrocknet und RNA / Protein-Komplexe, sowie freier Sonde durch Autoradiographie detektiert. Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, nachzuweisen und zu quantifizieren IRE / IRP und andere RNA / Protein-Interaktionen. Außerdem kann EMSA verwendet, um die Spezifität, Affinität und Stöchiometrie des RNA / Protein-Wechselwirkung untersucht bestimmen.
Introduction
Die EMSA wurde ursprünglich entwickelt, um die Assoziation von DNA-bindenden Proteinen mit DNA-Zielsequenzen 1,2 studieren. Das Prinzip ist ähnlich für RNA / Protein-Interaktionen 3, die im Mittelpunkt dieses Artikels ist. Kurz gesagt wird RNA negativ geladen und werden in Richtung der Anode während der nicht-denaturierenden Elektrophorese in Polyacrylamid (oder Agarose) Gelen wandern. Migration innerhalb des Gels hängt von der Größe der RNA, die proportional zu ihrer Ladung ist. Spezifische Bindung eines Proteins an RNA verändert seine Mobilität und der Komplex wandert langsamer als das freie RNA. Dies ist vor allem auf eine Erhöhung der Molekularmasse, sondern auch Änderungen in der Ladung und ggf. Konformation. Mit Hilfe eines markierten RNA als Sonde ermöglicht eine einfache Überwachung des "Gelretardation" oder "Bandshift". Verwendung von 32 P-markierten RNA-Sonden ist sehr verbreitet und bietet hohe Empfindlichkeit. Die Migration von RNA / Protein-Komplexen und freien RNA nachgewiesen werdendurch Autoradiographie. Nachteile sind die kurze Halbwertszeit von 32 P (14,29 Tage), die allmähliche Verschlechterung der Qualität der Sonde durch Radiolyse, das Erfordernis einer Radioaktivität Lizenz und die Infrastruktur für die Radioaktivität der Arbeit, und potentielle biologische Sicherheit betrifft. Daher alternative nichtisotopische Methoden zur Markierung der RNA-Sonde entwickelt, zum Beispiel mit Fluorophoren oder Biotin, der Nachweis durch Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Abbildungs 4,5 ermöglichen. Beschränkungen dieser Verfahren sind die höheren Kosten und oft eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Isotopenmarkierung, und das Potential des nicht-isotopische Markierungen, mit der RNA / Protein-Wechselwirkung stören. Nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelen sind für die meisten Anwendungen EMSA und werden häufig verwendet. Gelegentlich kann Agarosegelen eine Alternative für die Analyse von großen Komplexen darstellen.
Der große Vorteil der EMSA ist, dass es kombiniert Einfachheit, Sensitivität und Robustheit 4 </ Sup>. Der Test kann innerhalb weniger Stunden abgeschlossen werden kann und keine ausgeklügelte Instrumentierung erforderlich. RNA / Protein-Interaktionen können von der EMSA bei Konzentrationen von nur 0,1 nM oder weniger erkannt werden, und in einem weiten Bereich von Bindungsbedingungen (pH 4,0 bis 9,5, monovalente Salzkonzentration von 1 bis 300 mM, und die Temperatur 0 – 60 ° C).
RNA / Protein-Komplexbildung kann ebenfalls durch den Filter-Bindungsassay untersucht werden. Dies ist ein einfaches, schnelles und kostengünstiges Verfahren auf der Basis der Beibehaltung der RNA / Protein-Komplexen in einem Nitrocellulose-Filter, während eine freie RNA Sonde durch 6 durchläuft. Im Vergleich zu EMSA, ist es in Fällen, wo die RNA-Sonde enthält mehrere Bindungsstellen oder der Rohextrakt enthält mehrere RNA-Bindeproteine, die an die Sonde binden, an der gleichen Stelle begrenzt ist. Während mehrere RNA / Protein-Interaktionen werden Erkennung durch den Filter-Bindungstest entgehen, können sie leicht durch EMSA visualisiert werden. In einigen Fällen ist die Visualisierung Vorabendn möglich, wenn zwei RNA / Protein-Komplexe co-migrieren (zum Beispiel menschliche IRP1 / IRE und irp2 / IRE-Komplexe), durch Zugabe eines Antikörpers gegen eines der RNA-Bindeproteine zu der EMSA Reaktion, wodurch man weitere Retardierung auf dem Gel ( "Supershift") 7.
Die EMSA wurde weithin verwendet, um IRP1 und irp2, die nach der Transkriptionsregulatoren des Eisenstoffwechsels 8-10 sind zu studieren. Sie funktionieren über die Bindung an IREs phylogenetisch konservierten Haarnadelstrukturen innerhalb der UTRs mehrerer mRNAs 11. IREs wurden zuerst in den mRNAs Ferritin 12 und Transferrin-Rezeptor 1 (TfR1) 13, Proteinen von Eisen Lagerung und Aufnahme beziehungsweise kodiert entdeckt. Später IREs wurden in erythroiden spezifische Aminolaevulinat Synthase (ALAS2) 14, mitochondrialen Aconitase 15. Ferroportin 16, zweiwertige Metall Transporter 1 (DMT1) 17, Hypoxie-induzierbaren Faktors 2 gefunden <em> α (HIF2α) 18 und anderen mRNAs 19-21. Der Prototyp H- und L-Ferritin-mRNAs enthalten ein IRE in ihren 5'-UTR, während TfR1 mRNA enthält mehrere IREs in ihrem 3'-UTR. IRE / IRP Wechselwirkungen spezifisch hemmen Ferritin-mRNA-Translation durch sterisch Sperrung der Assoziation der 43S ribosomalen Untereinheit; Darüber hinaus stabilisieren sie TfR1 mRNA gegen endonukleolytische Spaltung. IRP1 und irp2 Aktien umfassende Sequenzähnlichkeit und weisen eine hohe IRE-Bindungsaktivität in eisenversorgten Zellen. In eisenversorgten Zellen versammelt IRP1 eine Cuban Fe-S-Cluster, der es um cytosolische Aconitase wandelt auf Kosten der IRE-Bindungsaktivität, während irp2 erfährt proteasomalen Abbau. Somit hängen die IRE / IRP Wechselwirkung bei der zellulären Eisenstatus, sondern auch durch andere Signale, wie zum Beispiel H 2 O 2, Stickstoffmonoxid (NO) oder Hypoxie. Hier beschreiben wir das Protokoll für die Beurteilung der IRE-Bindungsaktivität von Rohöl Zell- und Gewebeextrakten von EMSA. Wir verwendeten eine 32 P-markiertem H-Ferritin-IRE-Sonde, die durch in vitro-Transkription von Plasmid-DNA-Matrize (I-12.CAT), wobei der IRE-Sequenz wurde ursprünglich in Sense-Orientierung stromabwärts des T7-RNA-Polymerase-Stelle durch eingeführten generated Klonen von geglüht synthetische Oligonukleotide 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das entwickelt wurde, um die IRE-Bindungsaktivitäten von IRP1 und irp2 studieren, und wir zeigen repräsentative Daten. Durch die Verwendung von verschiedenen Sonden, kann dieses Protokoll auch für die Untersuchung von anderen RNA-bindenden Proteinen eingestellt werden. Ein kritischer Schritt ist die Größe der Sonde. Verwendung von langen Sonden, die gemeinsam ist, wenn die genaue Bindungsstelle nicht bekannt ist, kann in der RNA / Protein-Komplexe, die nicht anders migrieren als …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).
Materials
| Name of the Materials | Company | Catalog Number |
| leupeptin | SIGMA | L2884 |
| PMSF | SIGMA | 78830 |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 |
| Rnase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 |
| heparin | SIGMA | H0777 |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 |
| Name of the Equipments | Company | Catalog Number |
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 |
| 20 wells combs 1.5mm thick | BIORAD | 165-1868 |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
References
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