Summary
여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.
Abstract
RNA / 단백질 상호 작용은 전사 후 조절 경로에 대한 중요합니다. 가장 특징 세포질 RNA 결합 단백질 중 철 조절 단백질, IRP1과 IRP2입니다. 그들은하여 mRNA를 번역 또는 안정성을 제어하는 여러 대상의 mRNA의 번역되지 않은 지역 (UTRs) 내에서 반응 요소 (IRES)을 다림질 결합한다. IRE / IRP 상호 작용은 널리 EMSA에 의해 연구되고있다. 여기서, 우리는 다른 RNA 결합 단백질의 활성을 평가하기 위해 일반화 될 수 IRP1과 IRP2 IRE의 결합 활성을 EMSA 분석 프로토콜을 설명한다. RNA 결합 단백질, 또는이 단백질의 정제 된 제제를 함유하는 조단백질 해물, 복합체 형성을 가능하게 표지 된 32 P-RNA 프로브의 과량과 함께 배양된다. 헤파린 결합 프로브 비 특정 단백질을 배제하기 위해 추가됩니다. 이어서, 혼합물을 폴리 아크릴 아미드 겔상에서 비 변성 전기 영동에 의해 분석된다. 무료 프로브, 빠른 마이그레이션하는 동안 RNA / 단백질 복합체 전시 지체 이동; 그러므로, 절차는 또한 "겔 위상차"또는 "bandshift"분석 불린다. 전기 영동 완료 후, 겔을 건조 및 RNA / 단백질 복합체,뿐만 아니라 자유 프로브는, 오토 래디오 그래피에 의해 검출된다. 프로토콜의 전반적인 목적은 감지 IRE / IRP 및 기타 RNA / 단백질 상호 작용을 정량화하는 것이다. 또한, EMSA는 조사중인 RNA / 단백질 상호 작용의 특이성 결합 친화력 및 화학량 론을 결정하는 데 사용될 수있다.
Introduction
EMSA는 원래 타겟 DNA 서열과 1,2- DNA 결합 단백질의 관계를 연구하기 위해 개발되었다. 원리는이 문서의 초점이다 RNA / 단백질 상호 작용 3, 비슷합니다. 간단히, RNA는 음전하 폴리 아크릴 아미드 (또는 아가로 오스) 겔에서 전기 영동 비 변성 중에 애노드쪽으로 이동한다. 겔 내에서 마이그레이션 충전량에 비례하는 RNA의 크기에 따라 달라집니다. 특정 RNA에 단백질의 결합은 무료 RNA에 비해 복잡한 마이그레이션하는 느린 이동성을 변경합니다. 이는 분자량의 증가뿐만 아니라, 충전 및 가능한 입체 구조의 변화에 주로 기인한다. 프로브로 표지 된 RNA를 활용하여 "젤 지연"또는 "bandshift"쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 32 P - 라벨 RNA 프로브의 사용은 매우 일반적이며 높은 감도를 제공합니다. RNA / 단백질 복합체 무료 RNA의 이동이 감지된다오토 라디오로. 단점 32 P (14.29 일), 방사선 분해로 인해 프로브의 품질의 점진적인 열화의 짧은 반감기이다 방사능 라이센스 방사능 작업 인프라 및 잠재적 생물 안전성 문제의 요구. 따라서, RNA 프로브 레이블을 대체 비 동위 원소 방법은 형광 또는 화학 발광 영상 4,5의 검출을 가능하게 형광 물질이나 바이오틴,와 예를 들어, 개발되었다. 이러한 방법의 제한은 높은 비용과 동위 원소 라벨에 비해 자주 감소 감도 및 RNA / 단백질 상호 작용을 방해하는 비 동위 원소 라벨의 가능성이 있습니다. 비 변성 폴리 아크릴 아마이드 겔은 가장 EMSA 애플리케이션에 적합하며 일반적으로 사용된다. 경우에 따라, 아가 로스 젤 큰 단지의 분석을위한 대안을 제기 할 수 있습니다.
EMSA의 주요 장점은 단순성, 감도 및 안정성을 겸비한 4 점이다 </ SUP>. 분석은 몇 시간 내에 완료 될 수 있고, 정교한 장비를 필요로하지 않는다. RNA / 단백질 상호 작용은 0.1 nm 이하의 낮은 농도에서 EMSA에 의해 검출 될 수 있고, 광범위한 결합 조건의 범위 내에서 (pH가 4.0-9.5, 가의 염 농도 1-300 ㎜, 온도 0-60 ℃).
RNA / 단백질 복합체 형성은 필터 결합 분석에 의해 연구 할 수있다. 자유 RNA 프로브가 6을 통과하면서는 니트로 셀룰로오스 필터 RNA / 단백질 복합체의 유지에 기초하여, 간단하고, 빠르고, 저렴한 절차이다. EMSA에 비해, 그것은 RNA 프로브가 다중 결합 부위를 포함하거나 조 추출물이 동일한 사이트에서 프로브에 결합하는 하나 이상의 RNA 결합 단백질이 들어 가지 경우에 한정된다. 여러 RNA / 단백질 상호 작용은 필터 결합 분석에 의해 탐지되지 것이지만, 그들은 용이 EMSA에 의해 시각화 될 수있다. 어떤 경우에는, 시각화 이브이다N 가능한 경우, 겔에 더 지체를 산출, EMSA 반응에 RNA 결합 단백질 중 하나에 대한 항체를 추가하여 공동 마이그레이션 (예를 들어, 인간의 IRP1 / IRE 및 IRP2 / IRE 단지) 두 RNA / 단백질 복합체 ( "supershift") 7.
EMSA 널리 철 대사 8-10의 전사 후 레귤레이터이다 IRP1과 IRP2을 연구하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지의 mRNA (11)의 UTRs 내에서 IRES, 계통 발생 학적으로 보존 헤어핀 구조에 결합함으로써 작동합니다. IRES 먼저 페리틴 (12)와 트랜스페린 수용체 1 (TfR1) (13), 각각 철 저장 및 흡수의 단백질을 암호화하는 mRNA를 발견했다. 나중에, IRES는 적혈구 특정 aminolevulinate 신타 (ALAS2) 14 미토콘드리아 aconitase 15 ferroportin 16, 2가 금속 수송 체 1 (DMT1) 17, 저산소증 유도 성 인자 (2)에서 발견 된
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Protocol
쥐 실험 절차는 맥길 대학 (프로토콜 4966)의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.
배양 된 세포에서 단백질 추출물 1. 준비
- 얼음처럼 차가운 인산 완충 생리 식염수 10 ㎖ (PBS)로 두 번 배양 세포를 씻으십시오.
- 고무 경찰관 또는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 얼음처럼 차가운 PBS, 전송 현탁액 1 ㎖의 플라스틱 셀 스크레이퍼 중 하나에 부착 된 세포를 다 쳤어요.
- 4 ° C에서 700 XG에 5 분의 microcentrifuge에 스핀. 대기음 PBS.
- 10 7 세포 당 얼음처럼 차가운 세포질 용해 버퍼 100 ㎕ (표 1)를 추가하고 아래로 피펫.
- 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션.
- 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀.
- 취소 펠렛. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 얼음에 보관하십시오.
- DET브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 순백의 단백질 농도.
- 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다.
마우스 간 및 비장에서 단백질 추출물 2. 준비
- CO 2 흡입으로 마우스를 안락사.
- 해부 보드 위에 깨끗한 패드의 안락사 동물을 놓습니다. 가위로 복부를 엽니 다.
- 가위 집게를 사용하여 간 및 비장을 해부하고, 약 50 ml의 빙냉 PBS에서 각 조직을 헹군다.
- 즉시 메스 작은 조각으로 조직을 절단 (예 : 약 1-2mm 3).
- 지체없이 신선한 cryotube에 조직의 조각을 넣고 액체 질소를 고정 스냅. 스토어 스냅인 냉동 조직 씩을 사용할 때까지 -80 ° C에서.
- 0.5 ㎖의 - 0.25 - (2 내지 3mm 정도 1) 동결 조직의 한 조각 균질화세포질 빙냉 용해 완충액 (표 1) 10 초 동안 조직 균질화.
- 20 분 동안 얼음에 1.5 ml의 microcentrifuge 관과 진정으로 균질을 전송합니다.
- 4 ° C에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀.
- 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 펠렛 및 전송 상층 액을 제거한다. 얼음에 보관하십시오.
- 브래드 포드 분석 (23)를 사용하여 - (10 ㎍ / μL 일반적으로 1) 단백질 농도를 결정합니다.
- 사용할 때까지 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 세포 추출합니다.
방사성 표지 IRE 프로브 3. 준비
- 제한 효소 XbaI으로 (플라스미드 당 1 μg의 U), IRE 서열의 하류로 절단하여, 1 시간 동안 37 ° C에서 배양하여 IRE 함유 플라스미드 I-12.CAT 22 선형화. 선형화 된 플라스미드는 시험 관내 전사를위한 템플릿으로 사용됩니다.
- 설정N 체외 20㎕의 전체 부피에서 전사 반응. 표 2에 나타낸 스톡 솔루션을 사용하고 추가 1 μL 선형화 된 플라스미드 주형 4 μL 전사 버퍼; ATP / CTP / GTP 믹스 1 ㎕를 혼합, 10 ㎕의 [α- 32 P] -UTP, 2 μL 디티 오 트레이 톨, 1 ㎕의 RNA 분해 효소 억제제 및 1 μL의 T7 RNA 폴리머 라제. 로 pipetting 아래로 섞는다.
- 1 시간 24 40 ° C에서 품어.
방사성 표지 IRE 프로브 4. 정제
- 피펫 팅 아래로 0.5 M EDTA, pH가 8 믹스 1 μl를 추가하여 시험 관내 전사 반응을 종료합니다.
- 더 나은 침전 캐리어로, 10 ㎎ / ㎖의 tRNA의 10 μl를 추가합니다. 로 pipetting 아래로 섞는다.
- 3 M 암모늄 아세테이트 82.5 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다.
- 에탄올 273 μl를 추가합니다. 와동에 의해 섞는다.
- 5 분 동안 RT에 서 보자.
- RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액.
- 워시는 70 % 에탄올 100 ㎕로 펠렛.
- RT에서 마이크로 원심에서 최고 속도로 10 분 동안 스핀. 취소 상층 액.
- 10 분 동안 공기 건조 펠렛.
- 이중 증류수 100 ㎕에 재현 탁 펠릿은, 이전에 H 2 O를 멸균
- 사용할 때까지 -80 ° C에서 액체 섬광 계수기의 방사능, 나누어지는 방사성 동위 원소 표지의 IRE 프로브와 저장소를 정량화. 냉동 분취 최대 3 주 동안 사용될 수있다.
EMSA에 대한 기본 폴리 아크릴 아미드 겔 5. 준비
- 1.5 mm 스페이서와 빗을 사용하여 겔 (16 × 16cm)를 조립합니다.
- 표 3에 도시 된 원액을 사용하여, 6 % 폴리 아크릴 아미드 겔 네이티브을 제조 7.5 ㎖의 40 % 아크릴 아미드의 혼합 :. 비스 아크릴 아미드, 5X TBE 5 ㎖과 37.5 ml에더블 증류수 H 2 O
- 10 % 새롭게 제조 된 황산 암모늄 (APS) 25 μL의 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)의 0.5 ML을 추가합니다.
- 즉시 젤에 아크릴 아미드 솔루션을 붓고 중합 할 수 있습니다. 약 30 분 동안 기다립니다.
- 상기 겔 전기 영동 장치를 조립하여 0.5X TBE의 탱크를 채우기와 전원 연결.
6. 전기 이동 기동성 교대 분석 실험
- 10 μL의 총 부피에서 세포질 또는 세포 용해 완충액 (표 1)과 조직으로부터의 단백질 추출물의 25 μg의 희석 (저급 단백질 농도도 사용될 수있다). 얼음에 보관하십시오. 25 : 4 휴면 IRP1 (2 % 최종 농도)를 활성화 2- 머 캅토 에탄올 (2-ME)로 희석 : 필요한 경우, 1의 1 μl를 추가합니다.
- 95 °에서 두 번 증류수에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브를 희석 2 O 200,000 CPM / μL, 열 변성에1 분 C, 그리고 적어도 5 분 동안 실온에서 냉각.
- 단백질 추출물에 방사성 동위 원소 표지 IRE 프로브의 1 μl를 추가하여 EMSA 반응을 설정합니다.
- 실온에서 20 분 동안 품어.
- 반응 50 ㎎ / ㎖ 헤파린의 1 μl를 추가 (프로브 (9)와 비 특정 단백질 상호 작용을 억제하기 위해) 또 다른 10 분 동안 배양을 계속합니다. -80 ° C에서 스톡 헤파린 용액 (50 ㎎ / ml) 및 저장소 나누어지는.
- 긴 방사성 표지 된 프로브 (> 60 개 뉴클레오티드)를 사용하는 경우, 1 μL의 RNase T1 (1 U / μL)를 첨가하고, RT에서 10 분 동안 인큐베이션 프로브 비특이적 결합 단백질을 줄이기 위해, 및 RNA / 단백질의 잘 구분할 수 있도록 전기 영동시 복잡한.
- 로딩 버퍼 (80 % 글리세롤 + 브로 모 페놀 블루)의 3 μl를 추가, 혼합 6 % 비 변성 폴리 아크릴 아미드 겔에로드.
- 130 V (5 V / cm)에서 60 분 동안 젤을 실행합니다.
- 티를 ransfer 큰 필터 종이 건조 위에 젤.
- 필름에 노출 및 오토 라디오를 개발한다. 노출 시간은 1 시간 (이하)에서 O / N까지의 범위 일 수있다.
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Representative Results
섹션 3 및 4 프로토콜에 기재된 방사성 표지 된 프로브 IRE 제조 하였다. 프로브의 서열은 5'-CUG GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC UUCAA C C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '이었다; 굵은 뉴클레오티드는 중요한 IRE 기능입니다 짝이없는 C 잔류 루프를 나타냅니다. 프로브의 특정 방사능 4.5 × 109 CPM / μg의 RNA의이었다.
활성 IRE는 결합에 철 교란의 효과를 평가하기 위해, 뮤린 RAW264.7 대 식세포는 방치 또는 헤민 (철 공급원) 또는 desferrioxamine (철 킬 레이터)으로 처리 하였다. 용 해물을 제조하고 IRE 프로브 (8,000 CPM / μg의 단백질)와 EMSA에 의해 분석 하였다. 대표 데이터는 각각 좌측 및 우측 패널의 autoradiograms 짧고 긴 노출이,도 1에 도시되어있다. 쥐 IRE / IRP1과 IRE / IRP2 단지 다른 이동성과 두 가지 대역을 전시처리되지 않은 세포에 해당하는 1 레인에서 볼 수 있습니다. 철분 보충을 감소하면서 철 킬레이트 뿌리깊, (레인 3) IRP1과 IRP2 (레인 2) 모두의 IRE 결합 활동을 유도. 심지어 철 처리 된 세포 추출물 2 % 2-ME가 완전히 활성화 IRP1 (하단 패널)와 전처리. 이것은 철분이 섭동 IRP1의 안정성에 충돌하지 않는 것을 보여주고 또한 로딩 대조군으로서 작용한다. 반면에 2-ME의 전처리 IRP2의 IRE 결합 활성을 억제 하였다. 빠른 마이그레이션 비특이적 밴드는 철의 영향을받지 않습니다.
다음으로, 우리는 야생형의 간에서 활성을 IRE가 결합 분석, Irp1 - / - 및 Irp2 - / - 이전에 표준 또는 철 풍부한 다이어트 (그림 2)와 함께 일주일 동안 공급 마우스. Irp1 - / - 및 Irp2 - / - 마우스는 친절 박사 MW Hentze (EMBL, 하이델베르크)에 의해 제공되었다. 야생형 간 추출물에서 IRP1은 IRE 결합 활동과 IRE / IRP2 단지의 주요 부분을 차지 거의 없었다이전의 관찰 (26)와 계약에 표시 (차선 1, 2). - / - 생쥐 (레인 3, 4) 간 IRP2 Irp1 추출물의 효능 IRE - 결합 활성을 나타내었다. 이러한 조건 하에서, 더 IRE / IRP1 착물은 관찰되지 않았다. - / - 마찬가지로, 어떠한 IRE / IRP2 착물 간 Irp2 추출물에 형성되지 않을 때 생쥐 (레인 5, 6). 모두 IRP1과 IRP2의 간 IRE-바인딩 활동이 높은 철 다이어트와 마우스를 감소 먹이; 이 효과는 IRP2 (차선 7-12)에 더 극적이었다. 참고 야생형 또는 Irp2의 치료 후 -이 명확하게 autoradiograms의 짧은 노출 관찰 (2-ME, IRP1의 IRE 결합 활동이 거의 모든 IRE 프로브를 이동 점으로 향상되었습니다와 간 추출물 - / 왼쪽 패널).
- / - 마우스 (그림 3) 마지막으로, 우리는 간과 야생형과 Hjv의 비장의 IRE 결합 활성을 평가 하였다. Hjv - / - 마우스는 친절 박사 NC 앤드류스 (듀크 대학, NC)에 의해 제공되었다. 이 동물 모델을 대표유전 혈색소 침착증 (27), 세망 내피 대 식세포가 철을 유지하면서 과도한 철, 실질 세포에 축적 전신 철 과부하의 질병은 28 결핍. 예상대로, Hjv의 간 - / - 전시 (철로드 간세포와) 마우스는 야생형 (차선 1-4)에 비해 활동을 IRE가 결합 감소했다. 반대로, IRE 결합 활동은 Hjv의 비장에서 더 높았다 - / - 마우스 (철 결핍 된 대 식세포를 포함, 5-8 차선). 여기에서 다시, ME-2 치료는 간 추출물 (왼쪽 패널의 짧은 노출 autoradiograms 참조) IRE 프로브의 거의 완전한 전환을 촉진.
표 1. 세포질 용해 버퍼입니다.
| 1 % 트리톤 (Triton) X100 |
| 25 mM 트리스 -HCl, pH 7.4 |
| 40 mM의 KCl을 |
- 해결해야멸균 및 RT에 저장 될 수있다.
- 프로테아제 억제제, 예컨대 10 ㎍ / ml의 류 펩틴, 0.1 mM의 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)를 사용하기 전에 첨가 할 수있다.
- 신선한 1 밀리미터 dithiotheritol 첨가 IRP2 활동의 검출을위한 시스템 권장된다.
시험 관내 전사 반응 표 2. 증권 솔루션을 제공합니다.
| / μL 선형화 플라스미드 템플릿 1 μg의 |
| 5 배 전사 버퍼 (T7의 RNA 중합 효소와 함께 제공) |
| ATP, CTP 및 GTP의 20 mM의 믹스 |
| 3000 CI / 밀리몰 [α-32P] -UTP |
| 100 mM의 디티 오 트레이 톨 |
| 10 U / μL의 RNase 억제제 |
| 20 U / μL의 T7 RNA 폴리머 라제 |
<폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 비 변성 강한> 표 3 모액.
| 40 % 아크릴 아미드 : 비스 아크릴 아미드 (37.5 : 1) |
| 5 배 TBE (트리스 / 보레이트 / EDTA) |
5X TBE 1 L의 제조 트리스베이스 54g, 붕산 27.5 g 및 0.5 M EDTA (PH 8.0) 20 ㎖을 사용한다.
RAW264.7 대 식세포의 활동을 IRE가 결합 그림 1. 철 따라 규제. 10 7 세포 / 100 μM 헤민 또는 desferrioxamine와 N 중 왼쪽 치료 또는 치료 O했다. 세포질 해물 2 % 2-ME를 (아래의 부재 (위) 또는 존재 하에서 32 IRE P 표지 된 프로브와 EMSA에 의해 제조 및 분석 하였다). IRE / IRP1과, 무료 IRE 프로브의 IRE / IRP2 단지의 위치는 화살표로 표시됩니다. 스타 비특이적 밴드를 나타낸다. autoradiograms의 짧은 긴 노출은 왼쪽과 오른쪽 패널에 표시됩니다, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 분석 야생형 (중량)의 간에서 활동을 IRE 결합, Irp1 - / - 및 Irp2는 - / -. 마우스 오주 된 마우스 (N = 2 각 유전자형의 경우), C57BL / 6 배경 (29)의 모든, 표준 또는 고 다이어트 철 (2 %, 카르 보닐 철을 포함)에 배치했다. 일주 후 동물은 안락사시켰다. 간장 단백질 추출물을 32 IRE P 표지 된 프로브와 EMSA에 의해 제조 및 분석 하였다2 % 2-ME (아래)의 부재 (위) 또는 존재. IRE / IRP1과, 무료 IRE 프로브의 IRE / IRP2 단지의 위치는 화살표로 표시됩니다. 스타 비특이적 밴드를 나타낸다. autoradiograms의 짧은 긴 노출은 왼쪽과 오른쪽 패널에 표시됩니다, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- / -. 간에서의 활동과 야생 유형 (중량) 및 Hjv의 비장 IRE가 결합 그림 3. 분석 마우스 (각 유전자형에 대한 N = 2) 십주 된 생쥐를 C57BL / 6 배경 (30) 모두, 안락사시켰다. 간과 비장 단백질 추출물 부재 (위)의 존재하에 또는 P-32 IRE 표지 프로브와 EMSA에 의해 제조 및 분석 하였다2 % 2-ME (아래). IRE / IRP1과, 무료 IRE 프로브의 IRE / IRP2 단지의 위치는 화살표로 표시됩니다. 스타 비특이적 밴드를 나타낸다. autoradiograms의 짧은 긴 노출은 왼쪽과 오른쪽 패널에 표시됩니다, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서, 우리는 IRP1과 IRP2의 IRE 결합 활동을 연구하기 위해 개발 된 프로토콜을 설명하고 우리는 대표적인 데이터를 보여줍니다. 다른 프로브를 사용함으로써,이 프로토콜은 다른 RNA 결합 단백질의 연구를 위해 조정될 수있다. 중요한 단계는 탐침의 크기이다. 정확한 결합 부위를 알 수없는 경우 일반적인 긴 프로브의 사용은 무료 RNA 다르게 마이그레이션되지 않습니다 RNA / 단백질 복합체가 발생할 수 있습니다. 이 경우, RNAse가 T1 (단계 6.6)으로 처리함으로써 미 결합 RNA를 제거하는 것이 바람직하다. 프로브의 품질도 매우 중요하다. 최상의 결과를 새로 제조 된 방사성 동위 원소 표지 된 RNA를 얻을 수 있습니다. 겔 정제 (10)는 필요하지 않지만 (더 RNAse가 T1 소화 단계가 포함되지 않은 경우 등)을 검사 준비를위한 시험 관내 전사 반응이 조기 종료되는 제품을 산출하는 경우 EMSA의 외관을 향상시킬 수있다. 기본 겔 전기 영동 너무 빨리 m 실행님이 RNA / 단백질 복합체의 해리 리드하고 퍼지 밴드가 발생할 수 있습니다 과열을 초래한다.
정량적 결과는 phosphorimaging와 지연 밴드의 강도를 분석함으로써 얻어 질 수있다. RNA 프로브를 초과 존재하고 RNA 바인딩에 대한 제한되지 않은 경우 정량화에만 유효합니다. 자유 에너지 ΔG 오 연결되어 해리 상수 K를 D로 표시 RNA / 단백질 상호 작용의 친화도는, 방사성 표지 된 프로브 (3)의 양이 감소함에 따라 RNA 결합 활성을 적정하여 평형 조건에서 평가 될 수있다. IRE / IRP1의 상호 작용은 광범위하게 물리 화학적 9,31 특징으로하고있다. RNA 결합 단백질 양의 변화와 EMSA 적정 실험 화학량 셋을 계산하기 위해 수행 될 수있다. 바인딩에 대한 특이성은 쉽게 레이블이없는 "콜드"빌려 과잉 경쟁 실험에 의해 검증 될 수있다etitor RNA를 3. 특정 경쟁은 지체 방사성 밴드의 강도를 감소시켜야한다. 특이성은 또한 7 "supershift"를 산출 할 것이다 EMSA 반응에서 RNA 결합 단백질에 대한 항체를 포함하여 모니터링 할 수있다. 이것은 또한 RNA 결합 단백질의 신원을 결정하는 데 이용 될 수있다. 없음 "supershift는"비 특이 항체 또는 사전 면역 혈청으로 관찰 될 수 없습니다.
결론적으로, EMSA는 RNA / 단백질 상호 작용 분석을위한 강력한 방법이다. 그것은 수행 비교적 쉽게 최소한의 인프라가 필요합니다. 이 필터 결합 분석하는 것만 큼 간단하지 않지만 여러 RNA 결합 단백질 (예 : IRP1과 IRP2 등) 프로브를 구체적으로 상호 작용을 할 때 더 유익하고 정확한 데이터를 얻을 것입니다. 이 뮤린 달리, 인간 IRE / IRP1 IRE 및 / IRP2 착체 EMSA의 동일 이주 주목해야한다. 그러나, 그들은 "supershifts̶ 의해 분리 될 수있다1; 특정 항체 7. EMSA는 RNA / 단백질 상호 작용의 상세한 매핑 유용한 아니다; toeprinting 32 또는 가교 등의 RNAse 보호 분석과 같은 다른 기술들이 더 적합하다. 그럼에도 불구하고 EMSA는 IRP를 8의 경우되고, 또한 계산 또는 높은 처리량 실험 방법으로 얻은 데이터를 확증을위한 것처럼, 새로운 RNA / 단백질 상호 작용을 발견하기위한 최적의 선택이 될 것입니다. 또한, EMSA는 RNA / 단백질 상호 작용의 특이성 및 물리 화학적 특성을 분석하기위한 우수하다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| leupeptin | SIGMA | L2884 | |
| PMSF | SIGMA | 78830 | |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 | |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 | |
| RNase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 | |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H | |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 | |
| heparin | SIGMA | H0777 | |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 | |
| Name of the Equipment | |||
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 | |
| 20 wells combs | BIORAD | 165-1868 | 1.5 mm thick |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 | |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
References
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
- Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
- Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
- Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
- Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
- Wang, J., Pantopoulos, K.
- Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
- Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
- Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
- Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
- McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
- Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
- Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
- Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
- Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
- Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
- Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
- Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
- Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
- Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
- Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
- Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
- Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
- Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
- Gopinath, S. C.
