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Biology

La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA) para el estudio de las interacciones RNA-proteína: El IRE / IRP Ejemplo

Published: December 3, 2014 doi: 10.3791/52230
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Department of Medicine, McGill University

Summary

Aquí se presenta un protocolo para analizar las interacciones RNA / proteína. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) se basa en la migración diferencial de los complejos de ARN / proteína y ARN libre durante la electroforesis en gel nativo. Mediante el uso de una sonda de RNA radiomarcada, complejos / proteína de ARN pueden ser visualizados por autorradiografía.

Abstract

Interacciones RNA / proteína son críticos para las vías de regulación post-transcripcional. Entre las proteínas de unión al ARN citosólicos mejor caracterizados son proteínas reguladoras del hierro, IRP1 y IRP2. Se unen al hierro elementos de respuesta (IRES) dentro de las regiones no traducidas (UTRs) de varios mRNAs objetivo, controlando así la traducción o la estabilidad ARNm. Interacciones IRE / IRP han sido ampliamente estudiados por la EMSA. Aquí se describe el protocolo de EMSA para analizar la actividad de unión a IRE de IRP1 y IRP2, que se puede generalizar para evaluar la actividad de otras proteínas de unión al ARN también. Un lisado de proteína cruda que contiene una proteína de unión al ARN, o una preparación purificada de esta proteína, se incuba con un exceso de 32 sonda de ARN marcado con P, lo que permite la formación de complejos. La heparina se añade para impedir la proteína no específica a la unión de la sonda. Posteriormente, la mezcla se analizó por electroforesis no desnaturalizante en gel de poliacrilamida. La sonda libremigra rápido, mientras que el ARN / proteína exposiciones complejas movilidad retrasados; por lo tanto, el procedimiento se denomina también "retardo en gel" o ensayo "bandshift". Después de la finalización de la electroforesis, el gel se seca y complejos de ARN / proteína, así como sonda libre, se detectan por autorradiografía. El objetivo general del protocolo es detectar y cuantificar IRE / IRP y otras interacciones RNA / proteína. Por otra parte, EMSA también se puede utilizar para determinar la especificidad, afinidad de unión, y la estequiometría de la interacción de ARN / proteína bajo investigación.

Introduction

La EMSA se desarrolló originalmente para estudiar la asociación de las proteínas de unión al ADN con secuencias de ADN diana 1,2. El principio es similar para las interacciones RNA / proteína 3, que es el foco de este artículo. Brevemente, el ARN está cargado negativamente y migrará hacia el ánodo durante la electroforesis no desnaturalizante de poliacrilamida en (o agarosa) geles. La migración dentro del gel depende del tamaño de la ARN, que es proporcional a su carga. La unión específica de una proteína de ARN altera su movilidad, y los complejos migra más lento en comparación con el RNA libre. Esto se debe principalmente a un aumento en la masa molecular, pero también a alteraciones en la carga y posiblemente conformación. Utilizando un ARN marcado como sonda permite un fácil monitoreo del "retardo en gel" o "bandshift". El uso de 32 sondas de ARN P-etiquetados es muy común y ofrece una alta sensibilidad. La migración de ARN / complejos de proteínas y ARN libre se detectanpor autorradiografía. Los inconvenientes son la corta vida media de 32 P (14,29 días), el deterioro progresivo de la calidad de la sonda debido a radiólisis, la exigencia de una licencia de radiactividad y la infraestructura para el trabajo de la radiactividad, y posibles problemas de seguridad de la biotecnología. Por lo tanto, los métodos no isotópicos alternativos para marcar la sonda de ARN se han desarrollado, por ejemplo, con fluoróforos o biotina, que permiten la detección mediante formación de imágenes fluorescente o quimioluminiscente 4,5. Las limitaciones de estos métodos son el mayor costo y, a menudo sensibilidad reducida en comparación con marcaje isotópico, y el potencial de marcadores no isotópicos para interferir con la interacción de ARN / proteína. Geles de poliacrilamida no desnaturalizantes son adecuados para la mayoría de aplicaciones EMSA y se usan comúnmente. En ocasiones, geles de agarosa pueden representar una alternativa para el análisis de grandes complejos.

La principal ventaja de EMSA es que combina la simplicidad, sensibilidad y robustez 4 </ Sup>. El ensayo puede completarse en unas pocas horas y no requiere instrumentación sofisticada. Interacciones ARN / proteína pueden ser detectados por la EMSA, en concentraciones tan bajas como 0,1 nM o menos, y dentro de una amplia gama de condiciones de unión (pH 4,0 a 9,5, la concentración de sal monovalente 1 - 300 mM, y la temperatura de 0 - 60 ° C).

La formación de complejos de ARN / proteína también puede ser estudiada por el filtro obligatorio de ensayo. Este es un procedimiento simple, rápido y barato basado en la retención de los complejos de ARN / proteína en un filtro de nitrocelulosa, mientras que una sonda de ARN libre pasa a través de 6. En comparación con EMSA, se limita en los casos en que la sonda de ARN contiene múltiples sitios de unión, o el extracto crudo contiene más de una proteínas de unión al ARN que se unen a la sonda en el mismo sitio. Mientras múltiples interacciones RNA / proteína no se detectarán por el filtro obligatorio de ensayo, que se pueden visualizar fácilmente por EMSA. En algunos casos, la visualización es vísperan posible cuando dos complejos de ARN / proteína co-migran (por ejemplo, humano IRP1 / IRE y complejos IRP2 / IRE), mediante la adición de un anticuerpo contra una de las proteínas de unión al ARN a la reacción de EMSA, produciendo más retraso en el gel ( "supershift") 7.

El EMSA se ha utilizado ampliamente para estudiar IRP1 y IRP2, que son reguladores post-transcripcional del metabolismo del hierro 8-10. Operan mediante la unión a IRE, estructuras de horquilla conservadas filogenéticamente dentro de los UTRs de varios mRNAs 11. IREs fueron descubiertos por primera vez en los ARNm que codifican la ferritina y transferrina 12 receptor 1 (TfR1) 13, las proteínas de almacenamiento de hierro y la absorción, respectivamente. Más tarde, IREs se encontraron en erythroid específicos aminolevulinato sintasa (ALAS2) 14, aconitasa mitocondrial 15, ferroportina 16, transportador de metales divalentes 1 (DMT1) 17, factor inducible por hipoxia 2 18, y otra ARNm 19-21. El H- prototipo y ARNm de L-ferritina contienen uno IRE en sus 5 'UTR, mientras TfR1 ARNm contiene múltiples IREs en su extremo 3' UTR. Interacciones IRE / IRP inhiben específicamente ferritina traducción de ARNm bloqueando estéricamente su asociación de los 43S subunidad ribosomal; además, se estabilizan mRNA TfR1 contra la escisión endonucleolítica. IRP1 y compartir IRP2 extensa similitud de secuencia y exhiben alta actividad de unión IRE-en las células hierro de hambre. En las células de hierro repleta, IRP1 reúne un cubane Fe-S clúster que convierte a la aconitasa citosólica a expensas de su actividad de unión a IRE, mientras IRP2 sufre degradación proteasomal. Por lo tanto, las interacciones IRE / IRP dependen del estado del hierro celular, sino que también están regulados por otras señales, tales como H 2 O 2, el óxido nítrico (NO) o hipoxia. Aquí se describe el protocolo para evaluar la actividad de unión a IRE a partir de extractos crudos de células y tejidos por EMSA. Se utilizó una sonda de IRE marcado con 32P H-ferritina que se ha generado mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plásmido (I-12.CAT), donde la secuencia IRE se introdujo originalmente en orientación sentido aguas abajo del sitio de la polimerasa T7 RNA por clonación de los oligonucleótidos sintéticos hibridados 22.

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Protocol

Los procedimientos experimentales con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill (protocolo 4966).

1. Preparación de extractos de proteínas de las células cultivadas

  1. Lavar las células cultivadas dos veces con 10 ml de fosfato enfriada con hielo de solución salina tamponada (PBS).
  2. Raspe células adherentes ya sea con una goma de policía o un raspador de células de plástico en 1 ml de suspensión de PBS, la transferencia enfriado con hielo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  3. Girar en una microcentrífuga durante 5 min a 700 xg, a 4 ° C. Aspirar PBS.
  4. Añadir 100 l de tampón de lisis citoplasmática helado (Tabla 1) por 10 7 células, y la pipeta hacia arriba y abajo.
  5. Incubar en hielo durante 20 min.
  6. Centrifugado durante 10 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga a 4 ° C.
  7. Pellet Descartar. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1.5 ml y mantener en hielo.
  8. Detconcentración ermine proteína (normalmente 1 - 10 mg / l) utilizando el ensayo de Bradford 23.
  9. Alícuotas y celulares tienda extractos a -80 ° C hasta su uso.

2. Preparación de extractos de proteínas de ratón hígado y el bazo

  1. La eutanasia a un ratón con inhalación de CO2.
  2. Coloque el animal sacrificado en un cojín limpio sobre una tabla de disección. Abra el abdomen con unas tijeras.
  3. Diseccionar el hígado y el bazo mediante el uso de tijeras y fórceps, y enjuagar cada tejido en PBS aproximadamente 50 ml de hielo-frío.
  4. Inmediatamente cortar tejidos en trozos pequeños con un bisturí (por ejemplo: aproximadamente 1 - 2 mm 3).
  5. Sin demora, poner trozos de tejidos en un criotubo fresco y luego haga presión para congelar en nitrógeno líquido. Tienda complemento congelados alícuotas de tejido a -80 ° C hasta su uso.
  6. Homogeneizar una pieza de tejido congelado (aproximadamente 1 - 2 mm 3) en 0,25 hasta 0,5 ml detampón de lisis enfriado con hielo citoplásmica (Tabla 1) con un homogeneizador de tejidos durante 10 s.
  7. Transferencia homogeneizado a 1,5 ml tubo de microcentrífuga y enfriar en hielo durante 20 min.
  8. Centrifugado durante 10 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga a 4 ° C.
  9. Deseche pellet y transferencia sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantener en hielo.
  10. Determinar la concentración de proteína (normalmente 1 - 10 mg / l) utilizando el ensayo de Bradford 23.
  11. Alícuotas y celulares tienda extractos a -80 ° C hasta su uso.

3. Preparación de sonda radiomarcada IRE-

  1. Linealizar el plásmido I-12.CAT IRE-que contiene 22 mediante la incubación a 37 ° C durante 1 hora con la endonucleasa de restricción XbaI (1 U por g de plásmido), que escinde aguas abajo de la secuencia IRE. El plásmido linealizado se usó como molde para la transcripción in vitro.
  2. Configurar unan in vitro reacción de transcripción en un volumen total de 20 l. Utilice las soluciones madre se muestran en la Tabla 2 y añadir: 1 l plantilla plásmido linealizado, tampón de transcripción 4 l; 1 l de mezcla de ATP mezcla / CTP / GTP, 10 l [α- 32 P] -UTP, 2 l de ditiotreitol, inhibidor de RNasa 1 l y 1 l de ARN polimerasa T7. Mezclar pipeteando arriba y abajo.
  3. Incubar a 40 ° C durante 1 hr 24.

4. Purificación de radiomarcado IRE-sonda

  1. Terminar vitro reacción de transcripción in mediante la adición de 1 l de 0,5 M EDTA, pH 8. Mix pipeteando arriba y abajo.
  2. Añadir 10 l de 10 mg / ml tRNA, como vehículo para una mejor precipitación. Mezclar pipeteando arriba y abajo.
  3. Añadir 82,5 l de acetato de amonio 3 M. Mezclar por agitación.
  4. Añadir 273 l de etanol. Mezclar por agitación.
  5. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 min.
  6. Haga girar durante 10 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga a RT. Sobrenadante Descartar.
  7. Lavar el precipitado con 100 l de etanol al 70%.
  8. Haga girar durante 10 minutos a toda velocidad en una microcentrífuga a RT. Sobrenadante Descartar.
  9. Aire pellet seco durante 10 min.
  10. Resuspender pellet en 100 l de doble destilada, autoclave previamente H 2 O.
  11. Cuantificar la radiactividad en un contador de centelleo líquido, sonda IRE radiomarcado alícuota y almacenar a -80 ° C hasta su uso. Alícuotas congeladas se pueden utilizar durante un máximo de 3 semanas.

5. Preparación de un gel de poliacrilamida nativo para EMSA

  1. Montar el gel (16 x 16 cm) mediante el uso de espaciadores 1,5 mm y un peine.
  2. Para preparar un gel de poliacrilamida nativo 6%, utilice las soluciones de reserva que se muestran en la Tabla 3 Mezclar 7,5 ml de 40% de acrilamida:. Bisacrilamida, 5 ml de 5x TBE y 37,5 mldoble H2O destilada
  3. Añadir 0,5 ml de persulfato 10% recién preparada de amonio (APS) y 25 l tetrametiletilendiamina (TEMED).
  4. Inmediatamente vierta la solución de acrilamida al gel y se deja polimerizar. Espere aproximadamente 30 min.
  5. Montar el aparato de electroforesis con gel, llenar los tanques con TBE 0,5x y conectar con la fuente de alimentación.

Ensayo de cambio de movilidad electroforética 6.

  1. Diluir 25 g de extracto de proteína a partir de células o tejidos con tampón de lisis citoplásmica (Tabla 1) en un volumen total de 10 l en (concentraciones de proteína más bajas también se pueden utilizar). Mantener en hielo. Si es necesario, añadir 1 l de 1: 4 diluido 2-mercaptoetanol (2-ME) para activar IRP1 latente (concentración final: 2%) 25.
  2. Diluir la sonda IRE radiomarcado en doble H 2 O destilada a 200.000 cpm / l, desnaturalización por calor a 95 °C durante 1 minuto, y se enfríe a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos.
  3. Configurar una reacción EMSA añadiendo 1 l de sonda IRE radiomarcado al extracto de proteínas.
  4. Incubar durante 20 min a TA.
  5. Añadir 1 l de 50 mg / ml de heparina a la reacción (para inhibir las interacciones no específicas de proteínas con la sonda 9) y continuar la incubación durante otros 10 min. Alícuota de la solución madre de heparina (50 mg / ml) y se almacena a -80 ° C.
  6. Cuando se utilizan sondas radiomarcadas largos (> 60 nucleótidos), añadir 1 l de RNasa T1 (1 U / l) y se incuba durante 10 min a RT para reducir la proteína de unión no específica a la sonda, y para permitir una mejor separación de la ARN / proteína complejo durante la electroforesis.
  7. Añadir 3 l de tampón de carga (80% de glicerol + azul de bromofenol), mezcla y carga sobre la no desnaturalización gel de poliacrilamida al 6%.
  8. Ejecutar el gel durante 60 min a 130 V (5 V / cm).
  9. Transfer el gel sobre un papel de filtro grande y seco.
  10. Exponer a una película y desarrollar autorradiografía. El tiempo de exposición puede variar de 1 hr (o menos) hasta O / N.

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Representative Results

Una sonda IRE radiomarcado se prepara, como se describe en las secciones 3 y 4 del protocolo. La secuencia de la sonda era 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; los nucleótidos en negrita representan un residuo C desapareado y el bucle, que son características críticas de IRE. La radiactividad específica de la sonda fue de 4,5 x 10 9 cpm / g de ARN.

Para evaluar los efectos de las perturbaciones de hierro sobre la actividad de unión a IRE, macrófagos murinos RAW264.7 se dejaron sin tratar o tratados con hemina (fuente de hierro) o desferrioxamina (quelante de hierro). Los lisados ​​se prepararon y se analizaron por EMSA con la sonda de IRE (proteína / g 8000 cpm). Los datos representativos se muestran en la Figura 1, con exposiciones más cortas y más largas de los autorradiogramas de los paneles izquierdo y derecho, respectivamente. Complejos murino IRE / IRP1 y IRE / IRP2 exhiben diferente movilidad y dos bandas distintasson visibles en el carril 1, que corresponde a las células no tratadas. La quelación del hierro profundamente induce las actividades IRE-unión de ambos IRP1 y IRP2 (carril 2), mientras que la administración de suplementos de hierro les disminuida (calle 3). El pretratamiento con IRP1 2% de 2-ME completamente activado (panel inferior), incluso en extractos de células tratadas con hierro. Esto demuestra que las perturbaciones de hierro no afectan a la estabilidad de IRP1 y también sirve como control de carga. Por el contrario el tratamiento previo 2-ME IRE inhibió la actividad de unión de IRP2. Las bandas no específicas que migran rápido no se ven afectados por el hierro.

A continuación, analizamos la actividad IRE vinculante en los hígados de tipo salvaje, IRP1 - / - y IRP2 - / - ratones, alimentados durante una semana con un estándar o una dieta enriquecida con hierro (Figura 2). El IRP1 - / - y IRP2 - / - ratones fueron amablemente proporcionados por el Dr. MW Hentze (EMBL, Heidelberg). En extractos de hígado de tipo salvaje, IRP1 representó la principal fracción de actividad IRE vinculante y complejos / IRP2 IRE eran apenasvisibles (líneas 1, 2), de acuerdo con las observaciones anteriores 26. IRP2 exhibió actividad de unión a IRE potente en extractos de hígado de IRP1 - / - ratones (carriles 3, 4). En estas condiciones, no se observaron complejos IRE / IRP1. Del mismo modo, no se formaron complejos IRE / IRP2 en extractos de hígado de IRP2 - / - ratones (carriles 5, 6). La alimentación de los ratones con una dieta alta en hierro disminución de la actividad de unión a IRE hepática de ambos IRP1 y IRP2; Este efecto fue más dramático en IRP2 (carriles 7-12). Tenga en cuenta que después de un tratamiento de tipo salvaje o IRP2 - / - extractos de hígado con 2-ME, la actividad de unión a IRE de IRP1 se mejoró a un punto en el que cambió casi todos sonda IRE (esto se observa claramente en la exposición más corto de los autorradiogramas en el panel de la izquierda).

Por último, se evaluó la actividad IRE vinculante en hígados y bazos de tipo salvaje y hjv - / - ratones (Figura 3). El hjv - / - ratones fueron amablemente proporcionados por el doctor NC Andrews (Universidad de Duke, Carolina del Norte). Estos animales representan un modelode la hemocromatosis hereditaria 27, una enfermedad de sobrecarga de hierro sistémica, donde el exceso de hierro se acumula en las células del parénquima, mientras que los macrófagos reticuloendoteliales permanecen deficiencia de hierro 28. Como era de esperar, los hígados de hjv - / - ratones (con hepatocitos cargadas de hierro) mostraron una disminución de la actividad de unión a IRE en comparación con el tipo salvaje (carriles 1-4). Por el contrario, la actividad de unión a IRE fue mayor en los bazos de hjv - / - ratones (que contienen macrófagos deficientes en hierro; carriles 5-8). De nuevo aquí, el tratamiento 2-ME promovió cambio casi completa de la sonda IRE en extractos de hígado (véase la exposición más corto de los autorradiogramas en el panel de la izquierda).

Tabla 1. tampón de lisis citoplasmática.

1% Triton X100
25 mM Tris-HCl, pH 7,4
40 mM KCl
  1. La solución debeser esterilizado en autoclave y se almacenó a RT.
  2. Inhibidores de la proteasa, tal como 10 mg / ml de leupeptina y 0,1 mM de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) se pueden añadir antes de su uso.
  3. La adición de dithiotheritol fresco 1 mM se recomienda para la detección de la actividad IRP2.

Tabla 2. Las soluciones madre para vitro reacción de transcripción in.

1 g / l plantilla de plásmido linealizado
5x tampón de transcripción (suministrado con ARN polimerasa de T7)
Mezcla de 20 mM de ATP, CTP y GTP
3000 Ci / mmol [α-32P] -UTP
Ditiotreitol 100 mM
10 U inhibidor de RNasa / l
20 U / l T7 RNA polimerasa


<strong> Tabla 3. Las soluciones madre para no desnaturalización electroforesis en gel de poliacrilamida.

40% de acrilamida: bisacrilamida (37,5: 1)
5x TBE (Tris / borato / EDTA)

Para hacer 1 L de 5x TBE, usar 54 g de base Tris, 27,5 g de ácido bórico, y 20 ml de 0,5 M EDTA (pH 8,0).

Figura 1
Figura 1. Hierro regulación dependiente de las actividades IRE vinculante en macrófagos RAW264.7. 10 7 células fueron o bien O no tratada o tratada izquierda / N con 100 hemina M o deferoxamina. Lisados ​​citoplasmáticos se prepararon y analizaron por EMSA con una sonda IRE marcado con 32P en ausencia (arriba) o la presencia de 2% 2-ME (abajo). Las posiciones de IRE / IRP1 y complejos IRE / IRP2, y de la sonda libre IRE se indican mediante flechas. La estrella indica una banda no específica. Exposiciones más cortas y más largas de los autorradiogramas se muestran en los paneles izquierdo y derecho, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Análisis de las actividades de unión a IRE en los hígados de tipo salvaje (wt), IRP1 - / - y IRP2 - / -. Ratones 5 semanas de edad ratones (n = 2 para cada genotipo), todo en C57BL / 6 de fondo 29, se colocaron en un estándar o una dieta alta en hierro (que contiene 2% de hierro carbonilo). Después de una semana se sacrificaron los animales. Extractos de proteínas hepáticas fueron preparadas y analizadas por EMSA con una sonda IRE marcado con 32Pen ausencia (parte superior) o presencia de 2% de 2-ME (parte inferior). Las posiciones de IRE / IRP1 y complejos IRE / IRP2, y de la sonda libre IRE se indican mediante flechas. La estrella indica una banda no específica. Exposiciones más cortas y más largas de los autorradiogramas se muestran en los paneles izquierdo y derecho, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Análisis de las actividades en los hígados y bazos de tipo salvaje (wt) y hjv IRE vinculante - / - ratones. 10 semanas de edad ratones (n = 2 para cada genotipo), todo en C57BL / 6 de fondo 30, fueron sacrificados. Insuficiencia hepática y extractos de proteínas bazo se prepararon y analizaron por EMSA con una sonda IRE marcado con 32P en ausencia (arriba) o la presencia de2% 2-ME (abajo). Las posiciones de IRE / IRP1 y complejos IRE / IRP2, y de la sonda libre IRE se indican mediante flechas. La estrella indica una banda no específica. Exposiciones más cortas y más largas de los autorradiogramas se muestran en los paneles izquierdo y derecho, respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este documento, se describe un protocolo que se ha desarrollado para estudiar las actividades IRE-unión de IRP1 y IRP2, y mostramos datos representativos. Mediante el uso de diferentes sondas, este protocolo también se puede ajustar para el estudio de otras proteínas de unión al ARN. Un paso crítico es el tamaño de la sonda. El uso de sondas largas, que es común cuando el sitio de unión exacto es desconocido, puede dar lugar a complejos de ARN / proteína que no migran de manera diferente que el ARN libre. En este caso, es aconsejable para eliminar el ARN no unido mediante tratamiento con RNasa T1 (paso 6.6). La calidad de la sonda es también muy importante. Los mejores resultados se obtuvieron con ARN radiomarcado recién preparado. Purificación en gel 10 no es necesaria, pero puede mejorar la apariencia de la EMSA si la reacción de transcripción in vitro para la preparación de la sonda produce productos de terminación prematuros (y si no se incluye ninguna etapa de digestión RNasa T1). Ejecución de la electroforesis en gel nativo m demasiado rápidoay provocar el sobrecalentamiento, lo que podría conducir a la disociación de los complejos de proteínas / ARN y el resultado en las bandas difusas.

Los resultados cuantitativos se pueden obtener mediante el análisis de la intensidad de las bandas retrasados ​​con phosphorimaging. Cuantificaciones son válidas sólo cuando la sonda de ARN está presente en exceso y no es limitante para el ARN vinculante. La afinidad de la interacción de ARN / proteína, representada por la constante de disociación K d que está vinculada a la energía libre? G o, se puede evaluar en condiciones de equilibrio por valoración de la actividad de unión al ARN con cantidades decrecientes de sonda radiomarcada 3. La interacción IRE / IRP1 ha sido ampliamente caracterizado fisicoquímicamente 9,31. Titulación EMSA experimentos con diferentes cantidades de una proteína de unión al ARN se pueden realizar para calcular estequiometría 3. La especificidad de la unión puede ser fácilmente validado por experimentos de competición con el exceso de etiqueta borrador "frío"etitor RNAs 3. Sólo competidores específicos deberían reducir la intensidad de la banda radiactiva retardado. La especificidad también se puede controlar mediante la inclusión de un anticuerpo contra la proteína de unión al ARN en la reacción de EMSA, que dará lugar a una "supershift" 7. Esto también puede ser explotado para determinar la identidad de la proteína de unión al ARN. No "supershift" debe ser observado con anticuerpos no específicos o suero pre-inmune.

En conclusión, la EMSA es un método potente para el análisis de las interacciones ARN / proteína. Es relativamente fácil de realizar y requiere una infraestructura mínima. No es tan simple como el ensayo de unión de filtro, pero producirá los datos más informativos y precisos cuando múltiples proteínas de unión de ARN-interactúan específicamente con la sonda (como IRP1 y IRP2). Cabe señalar que a diferencia de los complejos de murino, humano IRE / IRP1 y IRE / IRP2 co-migran en EMSA. Sin embargo, pueden estar separadas por "supershifts̶1; con anticuerpos específicos 7. La EMSA no es valiosa para el mapeo detallado de las interacciones RNA / proteína; otras técnicas, tales como el ensayo de protección de ARNasa, toeprinting o reticulación 32 son más apropiados. Sin embargo, la EMSA es una excelente opción para descubrir nuevas interacciones RNA / proteína, como ha sido el caso de IRP 8, sino también para corroborar los datos obtenidos con métodos experimentales rendimiento computacional o alta. Además, la EMSA es superior para el análisis de especificidad y propiedades fisicoquímicas de las interacciones ARN / proteína.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

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References

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Bioquímica Número 94 el metabolismo del RNA la traducción del ARNm post-transcripcional regulación génica mRNA estabilidad IRE IRP1 IRP2 el metabolismo del hierro ferritina receptor de transferrina
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Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

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