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Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour l'étude des interactions ARN-protéine: L'IRE / IRP Exemple

Published: December 3, 2014 doi: 10.3791/52230
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Department of Medicine, McGill University

Summary

Nous présentons ici un protocole d'analyser les interactions ARN / protéines. L'essai de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) est basé sur la migration différentielle des complexes ARN / ARN et de protéine libre pendant l'électrophorèse sur gel natif. En utilisant une sonde d'ARN radiomarqué, complexes / protéine ARN peuvent être visualisés par autoradiographie.

Abstract

Interactions ARN / protéines sont essentielles pour voies de régulation post-transcriptionnel. Parmi les protéines liant l'ARN cytosoliques les mieux caractérisés sont des protéines régulatrices du fer, et IRP1 IRP2. Ils se lient à repasser éléments sensibles (IRES) dans les régions non traduites (UTR) de plusieurs ARNm cibles, contrôlant ainsi la traduction ou la stabilité des ARNm. Interactions IRE / IRP ont été largement étudiés par l'EMSA. Ici, nous décrivons le protocole EMSA pour analyser l'activité IRE contraignant de IRP1 et IRP2, qui peut être généralisée à évaluer l'activité d'autres protéines liant l'ARN ainsi. Un lysat de protéine brute contenant une protéine de liaison à l'ARN, ou une préparation purifiée de cette protéine, est incubé avec un excès de 32 sonde d'ARN marquée au P, ce qui permet la formation du complexe. L'héparine est ajoutée à empêcher protéine non spécifique de liaison à la sonde. Ensuite, le mélange est analysé par électrophorèse non dénaturante sur un gel de Polyacrylamide. La sonde libremigre rapide, tandis que l'ARN / protéines expositions complexes de mobilité retardée; par conséquent, la procédure est aussi appelé «retard de gel" ou le dosage "de bandshift". Après achèvement de l'électrophorèse, le gel est séché et complexes ARN / protéine, ainsi que la sonde libre, sont détectés par autoradiographie. L'objectif global du protocole est de détecter et de quantifier IRE / IRP et d'autres interactions ARN / protéines. En outre, l'EMSA peut également être utilisé pour déterminer la spécificité, l'affinité de liaison, et la stoechiométrie de l'interaction ARN / protéine à l'étude.

Introduction

L'EMSA a été initialement développé pour étudier l'association de protéines de liaison à l'ADN avec des séquences d'ADN cible 1,2. Le principe est similaire pour les interactions ARN / protéine 3, qui est l'objet de cet article. En bref, l'ARN est chargé négativement et migrer vers l'anode pendant l'électrophorèse non dénaturant dans polyacrylamide (ou gels agarose). La migration dans le gel dépend de la taille de l'ARN, qui est proportionnelle à la charge. La liaison d'une protéine spécifique à l'ARN modifie sa mobilité, et les complexes migre plus lentement par rapport à l'ARN libre. Ceci est principalement dû à une augmentation de la masse moléculaire, mais aussi à des altérations de la charge et éventuellement conformation. Utilisant un ARN marqué comme sonde permet un contrôle facile de la «retard de gel" ou "bandshift". L'utilisation de 32 sondes d'ARN P marqué est très répandue et offre une sensibilité élevée. La migration des ARN / complexes de protéines et d'ARN libre sont détectéspar autoradiographie. Inconvénients sont la demi-vie courte de 32 P (14,29 jours), la détérioration progressive de la qualité de la sonde due à la radiolyse, l'exigence d'une licence de la radioactivité et de l'infrastructure pour les travaux de la radioactivité, et de biosécurité préoccupations potentielles. Par conséquent, les méthodes non isotopiques alternatives pour marquage de la sonde d'ARN ont été développés, par exemple avec de la biotine ou des fluorophores, qui permettent une détection par imagerie de fluorescence ou de chimioluminescence 4,5. Les limitations de ces procédés sont le coût plus élevé et souvent une sensibilité réduite par rapport à marquage isotopique et le potentiel de marqueurs non isotopiques pour interférer avec l'interaction ARN / protéine. Les non-dénaturantes des gels de Polyacrylamide sont appropriés pour la plupart des applications EMSA et sont couramment utilisés. À l'occasion, des gels d'agarose peuvent représenter une alternative pour l'analyse de grands complexes.

Le principal avantage de l'EMSA est qu'il combine la simplicité, la sensibilité et la robustesse 4 </ Sup>. Le test peut être réalisé en quelques heures et ne nécessite pas une instrumentation sophistiquée. Les interactions ARN / protéine peut être détectée par l'EMSA à des concentrations aussi faibles que 0,1 nm ou moins, et dans une large gamme de conditions de liaison (pH 4,0 à 9,5, monovalent concentration en sel de 1 à 300 mM, et la température de 0 à 60 ° C).

ARN / protéines formation du complexe peut également être étudié par le test de filtre contraignant. Ce est une procédure simple, rapide et peu coûteux basé sur la conservation de complexes ARN / protéines dans un filtre de nitrocellulose, tandis qu'une sonde d'ARN libre passe par six. Par rapport à l'EMSA, elle est limitée dans les cas où la sonde d'ARN contient de multiples sites de liaison, ou l'extrait brut contient plus d'une des protéines liant l'ARN qui se lient à la sonde sur le même site. Alors que de multiples interactions ARN / protéines seront échapper à la détection par le test de filtre contraignantes, elles peuvent être facilement visualisés par l'EMSA. Dans certains cas, la visualisation est veillen possible lorsque deux complexes ARN / protéines co-émigrer (par exemple, IRP1 humaine / IRE et IRP2 / complexes IRE), en ajoutant un anticorps dirigé contre l'une des protéines liant l'ARN à la réaction EMSA, ce qui donne encore un retard sur le gel ( "supershift") 7.

L'EMSA a été largement utilisé pour étudier IRP1 et IRP2, qui sont des régulateurs post-transcriptionnel du métabolisme du fer 8-10. Ils fonctionnent en se liant à IRE, structures en épingle à cheveux phylogénétiquement conservés dans les UTR de plusieurs ARNm 11. IRE ont été découverts dans les ARNm codant la ferritine 12 et récepteur de la transferrine 1 (TfR1) 13, les protéines de stockage du fer et de l'absorption, respectivement. Plus tard, IRE ont été trouvés dans érythroïde spécifique aminolévulinate synthase (ALAS2) 14, aconitase mitochondriale 15, 16 ferroportine, divalent transporteur de métaux 1 (DMT1) 17, l'hypoxie inducible factor 2 18, et d'autres ARNm 19-21. Le H- prototype et ARNm L-ferritine contiennent une IRE dans leur 5 'UTR, tandis que TfR1 ARNm contient plusieurs IRE à son extrémité 3' UTR. Interactions IRE / IRP spécifiquement inhiber la traduction de l'ARNm de la ferritine en bloquant stériquement son association des sous-unités 43S ribosomique; en outre, ils stabilisent TfR1 ARNm contre clivage endonucléolytique. IRP1 et la part de IRP2 vaste similarité de séquence et de présenter une activité élevée de IRE-contraignant dans les cellules de fer-affamés. Dans les cellules de fer-remplie, IRP1 assemble un cluster Fe-S cubane qu'il convertit en aconitase cytosolique au détriment de son activité IRE contraignant, tandis que IRP2 subit une dégradation par le protéasome. Ainsi, les interactions IRE / IRP dépendent du statut en fer cellulaire, mais sont également régies par d'autres signaux, tels que H 2 O 2, l'oxyde nitrique (NO) ou hypoxie. Ici, nous décrivons le protocole pour évaluer l'activité IRE liaison à partir d'extraits cellulaires bruts et de tissus par EMSA. Nous avons utilisé une sonde IRE marqué au 32P H-ferritine qui a été généré par transcription in vitro à partir d'une matrice d'ADN plasmidique (de I-12.CAT), où la séquence IRE a été initialement introduit dans l'orientation sens en aval du site de l'ARN polymerase T7 par clonage des oligonucleotides synthétiques annelés 22.

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Protocol

Les procédures expérimentales sur des souris ont été approuvés par le Comité de l'Université McGill (protocole 4966) de protection des animaux.

1. Préparation d'extraits de protéine à partir de cellules cultivées

  1. Laver les cellules en culture à deux reprises avec 10 ml de phosphate refroidie à la glace une solution saline tamponnée (PBS).
  2. Grattez cellules adhérentes soit avec une spatule en caoutchouc ou d'un grattoir à cellules en plastique dans 1 ml de PBS, le transfert suspension glacée dans un tube de 1,5 ml.
  3. Centrifugeuse à 5 min à 700 xg, à 4 ° C. Aspirer PBS.
  4. Ajouter 100 pi de tampon de lyse cytoplasmique glacée (Tableau 1) par 10 7 cellules, et la pipette de haut en bas.
  5. Incuber sur de la glace pendant 20 min.
  6. Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à 4 ° C.
  7. Jeter culot. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml et garder sur la glace.
  8. Determine concentration de protéine (généralement de 1 à 10 ug / ul) en utilisant le 23 dosage de Bradford.
  9. Aliquoter et cellulaires magasin extraits à -80 ° C jusqu'à utilisation.

2. Préparation d'extraits de protéine à partir de foie et la rate de souris

  1. Euthanasier une souris avec inhalation de CO 2.
  2. Placez l'animal euthanasié sur un tapis propre sur une planche de dissection. Ouvrez l'abdomen avec des ciseaux.
  3. Disséquer le foie et la rate à l'aide des ciseaux et des pinces, et rincer chaque tissu dans du PBS environ 50 ml de glace-froid.
  4. Tissus en petits morceaux immédiatement couper avec un scalpel (par exemple: environ 1-2 mm 3).
  5. Sans délai, mettre des morceaux de tissus dans une nouvelle cryotube puis enclenchez les congeler dans l'azote liquide. Magasin enfichable aliquotes congelées de tissus à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  6. Homogénéiser une seule pièce de tissu congelé (environ 1-2 mm 3) 0,25 au 0,5 ml deglacé tampon de lyse cytoplasmique (tableau 1) avec un homogénéisateur de tissu pendant 10 sec.
  7. Transfert homogénat à 1,5 ml microtube et le froid sur la glace pendant 20 min.
  8. Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à 4 ° C.
  9. Jeter culot et le transfert surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Garder sur la glace.
  10. Déterminer la concentration en protéine (généralement de 1 à 10 ug / ul) en utilisant le 23 dosage de Bradford.
  11. Aliquoter et cellulaires magasin extraits à -80 ° C jusqu'à utilisation.

3. Préparation de Radiolabeled IRE-sonde

  1. Linéariser le plasmide contenant IRE I-12.CAT 22 par incubation à 37 ° C pendant 1 heure avec l'endonucléase de restriction XbaI (1 U par pg de plasmide), qui clive en aval de la séquence IRE. Le plasmide linéarisé est utilisé comme matrice pour la transcription in vitro.
  2. Mettre en place unn in vitro réaction de transcription dans un volume total de 20 ul. Utiliser les solutions mères indiqués dans le tableau 2 et ajouter: 1 ul de modèles de plasmide linéarisé, un tampon de transcription 4 pi; 1 pl de mélange ATP / CTP / GTP mélange, 10 ul de [α- 32 P] -UTP, 2 pl de dithiothréitol, un inhibiteur de RNase et 1 pi 1 pi d'ARN polymerase de T7. Mélanger en pipetant.
  3. Incuber à 40 ° C pendant 1 h 24.

4. Purification de Radiolabeled IRE-sonde

  1. Mettre fin à la réaction de transcription in vitro par addition de 1 pi d'EDTA 0,5 M, pH 8. Mélanger en pipetant de haut en bas.
  2. Ajouter 10 ul de 10 mg / ml d'ARNt, en tant que support pour une meilleure précipitation. Mélanger en pipetant.
  3. Ajouter 82,5 ul de 3 M d'acétate d'ammonium. Mélanger au vortex.
  4. Ajouter 273 ul d'éthanol. Mélanger au vortex.
  5. Laisser reposer à température ambiante pendant 5 min.
  6. Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à température ambiante. Surnageant défausse.
  7. Laver culot avec 100 pi d'éthanol à 70%.
  8. Spin pendant 10 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse à température ambiante. Surnageant défausse.
  9. Air culot sec pendant 10 min.
  10. Resuspendre le culot dans 100 pi de double distillée, préalablement autoclave H 2 O.
  11. Quantifier la radioactivité dans un compteur à scintillation liquide, sonde IRE aliquote de radiomarqué et conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation. Aliquots congelés peuvent être utilisés pour 3 semaines.

5. Préparation d'un gel de Polyacrylamide natif à EMSA

  1. Assemblez le gel (16 x 16 cm) en utilisant 1,5 entretoises mm et peigne.
  2. Pour préparer un gel de Polyacrylamide natif à 6%, utiliser les solutions mères indiqués dans le tableau 3 Mélanger 7,5 ml de 40% d'acrylamide. Bisacrylamide, 5 ml de TBE 5x et 37,5 mlDouble H 2 O. distillée
  3. Ajouter 0,5 ml de 10% persulfate fraîchement préparée d'ammonium (APS) et 25 ul tétraméthyléthylènediamine (TEMED).
  4. Verser immédiatement la solution d'acrylamide au gel et laissez polymériser. Attendez environ 30 min.
  5. Monter l'appareil d'électrophorèse avec le gel, remplir les réservoirs avec 0,5x TBE et se connecter avec l'alimentation.

6. mobilité électrophorétique Maj Assay

  1. Diluer 25 pg d'extrait de protéine à partir de cellules ou de tissus avec cytoplasmique tampon de lyse (tableau 1) dans un volume total de 10 ul en (concentrations de protéine plus faibles peuvent également être utilisés). Garder sur la glace. Si nécessaire, ajouter 1 pl de 1: 4 dilué 2-mercaptoéthanol (2-ME) pour activer IRP1 dormance (concentration finale: 2%) 25.
  2. Diluer la sonde IRE radiomarqué en chambre double H 2 O distillée à 200 000 cpm / ul, dénaturation thermique à 95 °C pendant 1 min, et refroidir à la température ambiante pendant au moins 5 min.
  3. Mettre en place une réaction EMSA en ajoutant 1 pl de la sonde IRE radiomarqué à l'extrait de protéine.
  4. Incuber pendant 20 min à température ambiante.
  5. Ajouter 1 pi de 50 mg / ml d'héparine à la réaction (à inhiber les interactions protéiques non spécifiques avec la sonde 9) et poursuivre l'incubation pendant encore 10 min. Aliquoter la solution mère de l'héparine (50 mg / ml) et conserver à -80 ° C.
  6. Lors de l'utilisation de longues sondes radiomarquées (> 60 nucleotides), ajouter 1 pl de RNase T1 (1 U / ul) et incuber pendant 10 min à température ambiante pour réduire la protéine non spécifique à la liaison à la sonde, et pour permettre une meilleure séparation de l'ARN / protéine complexe au cours de l'électrophorèse.
  7. Ajouter 3 pi de tampon de chargement (80% de glycérol + bleu bromophénol), mélanger et la charge sur le gel de polyacrylamide non dénaturant 6%.
  8. Exécutez le gel pendant 60 min à 130 V (5 V / cm).
  9. Transfert du gel sur un grand papier filtre et sèche.
  10. Exposer à un film et développer autoradiographie. Temps d'exposition peut varier de 1 h (ou moins) jusqu'à O / N.

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Representative Results

Une sonde IRE radiomarqué a été préparé, comme décrit dans les sections 3 et 4 du protocole. La séquence de la sonde était 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; les nucléotides gras représentent un résidu C non apparié et la boucle, qui sont caractéristiques IRE critiques. La radioactivité spécifique de la sonde est de 4,5 x 10 9 cpm / ug d'ARN.

Pour évaluer les effets des perturbations de fer sur l'activité IRE contraignant, macrophages murins RAW264.7 ont pas été traités, ou traités avec hémine (source de fer) ou desferrioxamine (chélateur du fer). Les lysats ont été préparés et analysés par l'EMSA avec la sonde IRE (8000 cpm de protéine / pg). Des données représentatives sont présentées dans la figure 1, à une exposition plus courts et plus longs des autoradiogrammes sur les panneaux gauche et droit, respectivement. Complexes murin IRE / IRP1 et l'IRE / IRP2 présentent la mobilité différente et deux bandes distinctessont visibles sur la voie 1, ce qui correspond à des cellules non traitées. chélation du fer induite profondément les activités IRE-liaison des deux IRP1 et IRP2 (piste 2), tandis que les suppléments de fer diminuée (piste 3). Un prétraitement avec IRP1 2% de 2-ME pleinement activé (panneau inférieur), même dans des extraits de cellules de fer traitées. Cela démontre que les perturbations de fer ne empiètent pas sur la stabilité de IRP1 et sert de contrôle de chargement aussi. En revanche, le prétraitement 2-ME a inhibé l'activité IRE contraignant de IRP2. Les bandes non spécifiques migration rapide ne sont pas affectés par le fer.

Ensuite, nous avons analysé l'activité IRE contraignant dans le foie de type sauvage, IRP1 - / - et IRP2 - / - souris, préalablement nourris pendant une semaine à une norme ou une alimentation enrichie en fer (Figure 2). Le IRP1 - / - et IRP2 - / - souris ont été aimablement fournies par le Dr MW Hentze (EMBL, Heidelberg). Dans des extraits de foie de type sauvage, IRP1 représentait la majeure partie de l'activité IRE contraignant et complexes / de IRP2 IRE étaient guèrevisibles (lignes 1, 2), en accord avec les observations précédentes 26. IRP2 présentait une puissante activité IRE contraignant extraits de foie de IRP1 - / - souris (voies 3, 4). Dans ces conditions, aucun / complexes IRP1 de IRE ont été observés. De même, aucun complexe IRE / IRP2 ont été formés dans des extraits de foie de IRP2 - / - souris (pistes 5, 6). Nourrir des souris avec un régime riche en fer diminution de l'activité IRE-hépatique de liaison à la fois IRP1 et IRP2; cet effet a été plus dramatique sur IRP2 (pistes 7-12). Notez qu'après le traitement de type sauvage ou IRP2 - / - extraits de foie au 2-ME, l'activité IRE contraignant de IRP1 a été renforcée à un point où il se est presque tous sonde IRE (ce est clairement observé dans l'exposition plus courte des autoradiogrammes sur le panneau de gauche).

Enfin, nous avons évalué l'activité IRE contraignant dans le foie et la rate de type sauvage et Hjv - / - souris (Figure 3). Le Hjv - / - souris ont été aimablement fournies par le Dr Andrews NC (Duke University, Caroline du Nord). Ces animaux représentent un modèlede l'hémochromatose héréditaire 27, une maladie de surcharge en fer systémique, où le fer excessive accumule dans les cellules du parenchyme, tandis que les macrophages réticuloendothéliales restent carence en fer 28. Comme prévu, les foies de hjv - / - souris (avec des hépatocytes de fer chargé) exposées diminution de l'activité IRE contraignant par rapport au type sauvage (pistes 1-4). Inversement, l'activité IRE contraignant était plus élevé dans les rates de Hjv souris - / - (contenant des macrophages carencés en fer; voies 5-8). Là encore, le traitement de 2 ME promu changement presque complet de la sonde IRE dans des extraits de foie (voir exposition plus courte des autoradiogrammes sur le panneau de gauche).

Tableau 1. Le tampon de lyse cytoplasmique.

1% de Triton X100
25 mM Tris-HCl, pH 7,4
40 mM KCl
  1. La solution devraità l'autoclave et stockés à température ambiante.
  2. Les inhibiteurs de protéase, tel que 10 pg / ml leupeptine et 0,1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) peut être ajouté avant l'utilisation.
  3. Ajout de frais dithiotheritol 1 mM est recommandé pour la détection de l'activité IRP2.

Tableau 2. Les solutions mères pour in vitro réaction de transcription.

1 pg / pl matrice plasmidique linéarisé
Tampon de transcription 5x (fourni avec l'ARN polymérase T7)
20 mM mélange de l'ATP, CTP et GTP
3000 Ci / mmol [α-32P] -UTP
100 mM de dithiothréitol
/ Inhibiteur de RNase 10 ul U
20 U / ul ARN polymerase T7


<strong> Tableau 3. Les solutions mères pour non dénaturant électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

40% acrylamide: bisacrylamide (37,5: 1)
5x TBE (Tris / borate / EDTA)

Pour faire 1 litre de TBE 5x, utiliser 54 g de base Tris, 27,5 g d'acide borique et 20 ml d'EDTA 0,5 M (pH 8,0).

Figure 1
Figure 1. Fer réglementation dépendant des activités IRE contraignant dans les macrophages RAW264.7. 10 sept cellules étaient soit O non traitées ou traitées gauche / N avec 100 hémine uM ou desferrioxamine. Lysats cytoplasmiques ont été préparés et analysés par l'EMSA avec une sonde IRE marqué au 32P en l'absence (en haut) ou la présence de 2% de 2-ME (en bas). Les positions des IRE / IRP1 et complexes IRE / de IRP2 et de la sonde IRE libre sont indiquées par des flèches. L'étoile indique une bande non spécifique. Expositions courtes et plus longues des autoradiogrammes sont présentés dans les panneaux gauche et droit, respectivement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Analyse des activités IRE contraignant dans le foie de type sauvage (wt), IRP1 - / - et IRP2 - / -. Souris 5 semaines vieille souris (n = 2 pour chaque génotype), le tout dans C57BL / 6 fond 29, ont été placés sur une norme ou un régime riche en fer (contenant 2% de fer carbonyle). Après une semaine, les animaux ont été euthanasiés. Des extraits de protéines hépatiques ont été préparés et analysés par EMSA avec une sonde IRE marqué au 32Pen l'absence (en haut) ou en présence de 2% de 2-ME (en bas). Les positions des IRE / IRP1 et complexes IRE / de IRP2 et de la sonde IRE libre sont indiquées par des flèches. L'étoile indique une bande non spécifique. Expositions courtes et plus longues des autoradiogrammes sont présentés dans les panneaux gauche et droit, respectivement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Analyse des activités dans le foie et la rate de type sauvage (wt) et hjv IRE contraignant - / -. Souris 10 semaines vieille souris (n = 2 pour chaque génotype), le tout dans C57BL / 6 fond 30, ont été euthanasiés. Hépatiques et spléniques des extraits protéiques ont été préparés et analysés par EMSA avec une sonde IRE marqué au 32P en l'absence (en haut) ou en présence de2% de 2-ME (en bas). Les positions des IRE / IRP1 et complexes IRE / de IRP2 et de la sonde IRE libre sont indiquées par des flèches. L'étoile indique une bande non spécifique. Expositions courtes et plus longues des autoradiogrammes sont présentés dans les panneaux gauche et droit, respectivement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Ici, nous décrivons un protocole qui a été mis au point pour étudier les activités IRE contraignants de IRP1 et IRP2, et nous montrons des données représentatives. En utilisant différentes sondes, ce protocole peut également être ajustée pour l'étude d'autres protéines liant l'ARN. Une étape critique est la taille de la sonde. L'utilisation de sondes longues, ce qui est fréquent lorsque le site de liaison exacte est inconnue, peut entraîner des complexes ARN / protéine qui ne migrent pas différente de celle de l'ARN libre. Dans ce cas, il est conseillé pour éliminer l'ARN non lié par un traitement avec RNAse T1 (étape 6.6). La qualité de la sonde est également très important. Les meilleurs résultats sont obtenus avec l'ARN radiomarqué fraîchement préparé. Gel purification 10 ne est pas nécessaire, mais peut améliorer l'apparence de l'EMSA si la réaction de transcription in vitro pour la préparation de la sonde donne des produits de terminaison prématuré (et si aucune étape de digestion RNAse T1 est inclus). Exécution de l'électrophorèse sur gel natif m trop rapideay entraîner une surchauffe, ce qui pourrait conduire à la dissociation des complexes / de protéines d'ARN et d'entraîner dans les bandes floues.

Des résultats quantitatifs peuvent être obtenus par l'analyse de l'intensité des bandes avec phosphorimaging retardés. Quantifications ne sont valables que lorsque la sonde d'ARN est présent en excès et ne est pas limitatif pour la liaison ARN. L'affinité de l'interaction ARN / protéine, représentée par la constante de dissociation Kd qui est lié à l'énergie libre Ag O, peut être évaluée dans des conditions d'équilibre par titrage de l'activité de liaison à l'ARN avec des quantités décroissantes de sonde radiomarquée 3. L'interaction IRE / IRP1 a été largement caractérisé physico 9,31. Titrage expériences EMSA avec des quantités variables d'une protéine de liaison à l'ARN peuvent être effectuées pour calculer stoechiométrie 3. La spécificité de liaison peut être facilement validé par des expériences de compétition avec un excès d'échantillon non marqué "froid"etitor ARN 3. Seulement concurrents spécifiques devraient réduire l'intensité de la bande radioactive retardée. La spécificité peut également être contrôlée en incluant un anticorps dirigé contre la protéine de liaison à l'ARN dans la réaction EMSA, qui donnera un "supershift" 7. Ceci peut également être exploité pour déterminer l'identité de la protéine de liaison à l'ARN. N "supershift" doit être observée avec des anticorps non spécifiques ou du sérum pré-immun.

En conclusion, l'EMSA est une méthode puissante pour l'analyse des interactions ARN / protéine. Il est relativement facile à réaliser et nécessite une infrastructure minimale. Il ne est pas aussi simple que le test de filtre contraignant, mais d'obtenir des données plus informatifs et précis lorsque plusieurs protéines liant l'ARN interagissent spécifiquement avec la sonde (comme IRP1 et IRP2). Il convient de noter que les complexes contrairement murin, IRE humaine / IRP1 et l'IRE / IRP2 co-migrent de l'EMSA. Cependant, ils peuvent être séparés par "supershifts̶1; 7 avec des anticorps spécifiques. L'EMSA ne est pas utile pour la cartographie détaillée des interactions ARN / protéines; d'autres techniques, telles que l'essai de protection de RNase, toeprinting ou de reticulation 32 sont plus appropriés. Néanmoins, l'EMSA est un excellent choix pour la découverte de nouvelles interactions ARN / protéines, comme cela a été le cas avec les IRP 8, mais aussi pour corroborer les données obtenues avec un débit de calcul ou élevé approches expérimentales. En outre, l'EMSA est supérieur pour analyser la spécificité et de propriétés physico-chimiques des interactions ARN / protéines.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

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References

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Biochimie Numéro 94 métabolisme de l'ARN traduction de l'ARNm la régulation génique post-transcriptionnelle la stabilité de l'ARNm IRE IRP1 IRP2 le métabolisme du fer ferritine récepteur de la transferrine
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Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

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