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Medicine

Die Handhabung der Baumwolle Ratte in Studien für die präklinische Bewertung onkolytischer Viren

doi: 10.3791/52232 Published: November 24, 2014

Introduction

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Onkolytischer Viren (OV) selektiv in Tumorzellen zu replizieren, indem biochemische Unterschiede zwischen normalen und Tumorzellen 1,2. Es gibt zwei Arten von OVs: solche, die keine Mutation an selektiven Onkolyse zu erreichen, die als natürlich vorkommende Wildtyp-Viren und solche, die dazu entworfen sind, um eine selektive Onkolyse erzielen. Die Sammlung von Mutationen in einem bestimmten Tumortyp bestimmt die Art der selektiven Wachstumsvorteil gegenüber normalen Zellen für eine OV 2. Die Sicherheit und der Vorteil der Verwendung OVs wurde in klinischen Studien 3-7 gezeigt. Trotz Fortschritten auf dem Gebiet der onkolytischen Virotherapie existieren Lücken zwischen präklinischen und klinischen Ergebnissen, was darauf hindeutet, dass eine bessere Modelle werden benötigt, um die Antitumor-Wirksamkeit von OVs bewerten.

Bovine Herpesvirus Typ 1 (BHV-1) ist ein Mitglied der Familie Herpesviridae und Alphaherpesviridae Subfamilie. BHV-1 initiates Atemwegserkrankungen beim Rind Komplex bei Rindern, manifestiert sich in einer Vielzahl von Symptomen ähnlich einer Erkältung 8,9. BHV-1 bindet durch HSV-1 verwendet Befestigung und Eintrittsrezeptoren, wie Heparansulfat und Nectin-1 10. Jedoch bindet CD155 an die Stelle der Nectin-2 10. BHV-1 hat einen sehr engen Wirtsbereich, so dass er nicht in der Lage, effizient ein und initiiert die Replikation in normalen und transformierten Mäusezellen 3,4,10 ist. Dies macht den Einsatz von herkömmlichen murinen Modellen problematisch. Onkolytisches Kapazität von BHV-1 wurde in vitro 11,12 nachgewiesen. BHV-1 wurde gezeigt, dass die Replikation in einer Vielzahl von histologischen Ursprungs, einschließlich Brustkrebszellen und Brustkrebszellen initiieren 11,12 initiieren und zu töten menschlichen Tumorzellen. Jedoch muss die Antitumor Kapazität von BHV-1 in vivo im Kontext eines immunkompetenten Wirts ausgewertet werden.

Menschliche Adenovirus (Ad), für welcheEs gibt 57 identifizierte Serotypen, am häufigsten verursacht Atemwegserkrankungen beim Menschen. Onkolytischen Ad-Vektoren wurden für ihre Antitumorwirksamkeit mit mehreren fort in klinischen Studien 13 bis 15 bewertet worden. Trotz vielversprechender präklinischer Daten haben klinische Ergebnisse hinter den Erwartungen zurück. Menschliche Tumor Xenotransplantatmodellen werden typischerweise verwendet, um die Antitumor-Wirksamkeit von Ad Vektoren zu untersuchen, obwohl zeigen sie abgeschwächt Immunreaktionen auf den Virus 16,17. Darüber hinaus sind syngenen Mausmodell nicht-permissiven zur Ad-Infektion, so dass die Auswertung der Wirtsimmunreaktionen mit diesen Modellen unpraktisch 17,18.

Der Host-Immunsystem als der einflussreichste Mechanismus, durch den OVs entlocken Tumorzelltod 19 identifiziert. Antitumor-Antworten zwischen tolerierten und nicht-tolerierten Tumor-assoziiertes Antigen (TAA) Modelle unterscheiden und kann stark Einfluss auf den Erfolg der OV-Therapie. Das HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 1814 20) 20,21 ausgelöst Tumorrückgang bei 80% der tumortragenden Mäusen in einem murinen Polyoma Mittel T-Antigen Brustkrebsmodell 22. Doch in HER-2 / neu-Modelle, die Antitumor-Wirksamkeit von KM100 variiert zwischen 20% vollständige Regression in syngenen Mäusen und Tumor Stase in transgenen, HER2-toleranten Mäusen. Zusammen stellen diese Daten unterstreichen die Bedeutung einer vollständigen Auswertung OVs anhand von Tiermodellen, die am besten zu rekapitulieren das menschliche Immunsystem Landschaft zu verstehen, welche Funktionen bestimmen den Therapieerfolg.

Die Baumwollratte (Sigmodon hispidus), heimisch in Nord- und Südamerika, wird am häufigsten als ein Modell der RS-Virus-Infektion (wie in 5 überprüft). Baumwollratten sind auch in anti-BHV-1-Impfung Forschung verwendet, da sie die Pathologie, die mit Atemwegserkrankungen beim Rind komplexen 6,23 verbunden rekapitulieren. Weiterhin BHV-1-Infektion von Baumwollrattenimmunogen und induziert anhalt Schleimhaut und systemische Immunreaktionen 6,23-25. Zelllinien wurden aus spontanen Fibrosarkom und Osteosarkom der Brustdrüse (LCRT) und Knochen (CCRT und VCRT) bzw. 26 abgeleitet. Baumwollratten wurden verwendet, um die in vivo Wirksamkeit von onkolytischen Ad Vektoren zu bewerten, da sie anfällig für Ad-Infektion sind und eine ähnliche Pathologie an Menschen 27-29. Die Verwendung von immun Modelle für die präklinische Bewertung OVS sind nicht nur weniger anzeigt klinische Ansprechen auf die Therapie, aber sie berücksichtigen nicht die Rolle des Immunsystems bei onkolytischen Virotherapie 30,31 statt. Daher ist die syngene Tumor tolerisiert Baumwollrattenmodell des Mammakarzinoms und Osteosarkom relevant sind Modelle, in denen die präklinische Wirksamkeit OVs wie BHV-1 und Ad die unter Verwendung herkömmlicher Mausmodellen nicht untersucht werden können, zu bewerten.

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Protocol

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HINWEIS: Die verwendeten Protokolle sind von unseren institutionellen Tierforschung Ethikrat an der McMaster University nach Canadian Council on Animal Care-Richtlinien zugelassen. Die Experimente wurden an der McMaster Universität Zentrale Tierlabor durchgeführt.

1. Die Kultivierung LCRT Cells

  1. Kultur LCRT Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt. Pflegen Zellen in T-150 Gewebekulturkolben bei 37 ° C und 5% CO 2. Passage-Zellen, wenn sie sich bilden, eine 90% konfluente Monoschicht (alle 2-3 Tage, Abbildung 1).
  2. Vorwärmen 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 1x Trypsin und Medium in ein 37 ° C Wasserbad für 10 min vor dem Splitten der Zellen.
  3. Aspirat Medium aus dem Kolben und spülen Zellen mit 5 ml 1x PBS.
  4. Nach dem Abspülen absaugen PBS und InkubationZellen mit 2 ml 1X Trypsin bis Zellen dissoziiert aus dem Kolben (~ 2 min).
  5. Zellen in 8 ml Medium (für insgesamt 10 ml Zellsuspension) und sanft Pipette auf und ab zu brechen Zellklumpen.
  6. Pflegen Zellen in einem T-150-Kolben durch Impfen 1 ml Zellsuspension in 24 ml Medium (mit insgesamt 25 ml pro T-150) und Rock Kolben sanft von einer Seite zur anderen. Pflegen Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zum nächsten Split.

2. Beurteilung der Virusreplikation und Zytotoxizität in LCRT Cells

  1. Virus-Replikation
    HINWEIS: Virus-Konstrukte ein Fluoreszenz-Tag zum Ausdruck, wie das grün fluoreszierende Protein (GFP), unter der Kontrolle der endogenen viralen Promotoren zu erleichtern Visualisierung von Virus-Infektion und verbreitet mit Fluoreszenz-Plattenleser.
    1. Seed LCRT Zellen in Kulturschalen, so dass ein gut für die Zählung. Samenzellen, dass sie 80-90% konfluent einen Tag mehr sein. Verwenden Sie eine Konzentration von 10 5 cells / ml (100 ul pro Vertiefung), um die gewünschte Konfluenz einen Tag später in 96-Well-Flachbodenplatten zu produzieren.
    2. Am nächsten Tag, vorwärmen 1x PBS, 1x Trypsin, vollständig und serumfreien Medium in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten vor dem Start des Experiments.
    3. Saugen Sie das Medium aus den Zählen gut und spülen Zellen mit 5 ml 1x PBS durch Schwenken über die Oberfläche des Brunnens.
    4. Nach dem Abspülen absaugen PBS und Inkubation Zellen mit 2 ml 1x Trypsin, bis die Zellen distanzieren sich ausdrücklich von den Kolben (~ 2 min).
    5. Die Zellen in dem entsprechenden Volumen von komplettem Medium auf eine Zelldichte innerhalb des Bereichs zählbaren Ausbeute unter Verwendung eines Hämocytometers. Um eine genaue Zellzahl zu gewährleisten, gründliche Durchmischung der Zellsuspension vor dem Impfen der Zählkammer durch Auf- und Abpipettieren.
    6. Bestimmen das Volumen der Virusbestand für die Infektion in der gewünschten Multiplizität der Infektion (MOI) erforderlich.
      Erforderliche Paque bildenden Einheiten (pfu) = Anzahl der plattierten Zellen * MOI(Pfu / Zelle)
      Volumen der Virusstamm erforderlich = Pflicht pfu / Virus-Stamm Titer (pfu / ml)
    7. Bereiten Virusinokulum in serumfreiem Medium in Röhrchen. Gründlich mischen durch Vortexen oder Pipettieren bevor Inokulum zu den Zellen.
    8. Infizieren Zellen für 1 h bei 37 ° C, wonach Anwendung eines Wartungs Overlay DMEM + 1% FBS.
    9. Scan-Platten ein und zwei Tage nach der Infektion (pi) auf GFP-Fluoreszenz sichtbar zu machen.
  2. Virus Zytotoxizität
    HINWEIS: Führen Sie die Resazurin Zytotoxizitätsassay bei schlechten Lichtverhältnissen, wie die Verbindung lichtempfindlich ist. Nur ein gut enthaltenden Medium sollte einbezogen werden, um für die Hintergrundfluoreszenz zu korrigieren.
    1. Eine 5% ige (v / v) Lösung von Resazurin in 1x PBS. Mischen Sie die Lösung mit einer Pipette.
    2. Absaugen Medium von Zellen, und ziehen Sie die 5% Resazurin-Lösung. Fügen Sie ein gut haltigen Medium nur für Hintergrundfluoreszenz zu korrigieren.
    3. Inkubieren Zellen für 30 min bei 37 ° C, nach demdie lesen Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät (Anregung 530 nm, Emission 595 nm).
    4. Analysieren Daten relativ zu infizierten Kontrollen Korrektur Hintergrundfluoreszenz.

3. Gehäuse und Handhabung

  1. Gehäuse und Diät
    1. Haus Baumwollratten einzeln in Bekämpfung in Polycarbonat Ratten Käfige Nager Betten (1/8 "Maiskolben Betten), einen Teil der PVC-Schlauch nicht mehr als 8 Zoll und nestlets als Bereicherung (Abbildung 2), die zu verringern.
    2. Verwenden Sie einen sicherungsfähigen Stahlkorb zu überragen des Käfigs zu sitzen und enthalten Nagerfutter und eine Flasche Wasser.
      HINWEIS: Dieser Käfig Setup für einfache und sichere Erfassung der Tiere zu ermöglichen, mit der Platzierung der Anreicherung Rohr gegen das Ende des Käfigs Befinden von größter Bedeutung.
  2. Handhabung
    1. Griff Baumwollratten am Morgen, vor dem Runden von Tieranlage Techniker vor vermeiden spannende ihneneine Prozedur.
    2. Bei allen Verfahren, tragen dicke Lederhandschuhe für den Schutz.
    3. Da die Tiere vor allem in den Anreicherungsrohre bleiben, nutzen sie, um die Ratten während der routinemäßigen Reinigung in einen neuen Käfig übertragen. Alternativ öffnen Sie den Käfig leicht, damit der Handler, um ihre Hand in zu erreichen, kann das Tier dann durch scruffing die Haut direkt über den Schultern und schob sich zurückgehalten werden. Sorgfältig keine übermäßige Kraft verwenden, wie das Tier die Zunge beißen.
    4. Seien Sie geduldig und verwenden Sie eine ruhige Hand, wie die Tiere haben eine starke Flug-oder-Kampf-Reaktion und werden versuchen, Gefangennahme durch Laufen und Springen aus dem Käfig zu vermeiden. Wichtig ist, dass keine Tiere behandeln Sie am Schwanz als degloving auftreten.
    5. Fangen die Tiere in ihrer Anreicherungen Rohre über direktes Handling. Diese drastisch ab Verletzungen und Flucht.

4. Erfassung und Anästhesie

  1. Erfassung
    1. Tragen Sie dicke Lederhandschuhe für schützenIon in allen Verfahren.
    2. Verwenden Sie eine große durchsichtigen Kunststoff-Container mit Löchern für Luft und einem Deckel, einer Narkoseeinleitung Kammer groß genug sein, um den Behälter und einen Nasenkegel auf die Gasausgangsschlauch (Bild 3) ausgestattet passen.
    3. Paarweise zusammenarbeiten, damit das Verfahren effizienter und um die Belichtungszeit der Tiere bis zu Isofluran Inhalationsanästhetikum verringern. Achten Sie darauf, ein Forscher ist zum Öffnen und Ersetzen der Stahlabdeckung auf dem Käfig und dem Deckel der Induktionskammer (Handler # 1) verantwortlich und ihre Mitarbeiter ist für die Aufnahme des Tieres in der Röhre und den Transport in die Induktionskammer zuständig (Handler # 2).
    4. Setzen Sie den Käfig auf eine ebene Fläche und entfernen Sie den äußeren Deckel. Heben Sie die Stahleinzugsfach leicht und langsam manövrieren die Anreicherung Rohr so ​​parallel zu den Seiten des Käfigs und gegen die Rückseite ist. Verwenden Sie bei Bedarf ein Objekt, um die Anreicherung Rohr ohne Öffnen des Käfigs zu vermeiden Rühren der Tier manövrieren (GriffR # 1).
    5. Wenn das Tier aufgeregt und verlässt das Rohr, lassen Sie genügend Zeit für das Tier zu entspannen und wieder in das Rohr (Handler # 1) zu begleichen.
    6. Langsam und gezielt heben die Kante des Stahlabdeckung weitesten vom Anreicherungsrohr, wobei das andere Ende in Kontakt mit dem Käfig. Machen Sie einen Raum groß genug für die Kunststoffbehälter (Handler # 2).
    7. In einer glatten, schnellen Bewegung, drücken Sie den Kunststoffbehälter überragen der Anreicherungsrohr. Halten den Kontakt des Behälters mit der Seite des Käfigs, Einfangen des Tieres in der Röhre. Führen Sie die Schritte 4.1.6 und 4.1.7 so schnell wie möglich (Handler # 2).
    8. Entfernen Sie die Stahleinzugsfach und geben dem Kunststoffbehälterdeckel zu Handler # 2 (Handler # 1). Schieben Sie den Kunststoffdeckel von der Seite des Käfigs und dem Behälter, wenn ich denke an Anhängsel der gefangenen Tieres in den Prozess. Den Behälter nicht verschließen, da dies der nächste Schritt zu erschweren (Handler # 2).
  2. Anesthesia
    1. Sicherstellen, dass der Behälter bleibt geschlossen und zum Transport des Tieres in die Induktionskammer. Legen Sie schnell das Tier in der Kammer und entfernen Sie den Behälterdeckel in einer flüssigen Bewegung (Handler # 2). Öffnen und die Induktion Kammerdeckel sofort zu ersetzen (Handler # 1).
    2. Schalten auf den Fluss von Isofluran mit der Induktionskammer (5 l / min) und zu überwachen, das Tier Anzeichen von Lethargie, an welchem ​​Punkt schnell gleiten das Tier aus dem Rohr und dem Behälter, Entfernen sowohl von der Induktionskammer zur Gaszirkulation ermöglichen.
    3. Wenn die Ratten vollständig betäubt wird, bewegen sie auf die Arbeitsfläche und legen Sie die Nase und den Mund in den Nasenkegel (Abbildung 3). Die Ratte ist vollständig betäubt, wenn sie nicht mehr auf einem kräftigen Zehen Prise ist.
    4. Zeigen Tierarzt Vaseline Augensalbe auf die Augen des Tieres bis zur Trockenheit und Schürfwunden zu verhindern. Dies ist ein wesentlicher Schritt, wie Baumwollratten haben große Augen, die für Infektionen anfällig sein kann, wenn Verletzung auftritt.
    5. <li> sorgfältig zu überwachen und eine konstante Atemfrequenz und damit der Nase des Tieres in der Nasenkegel während des gesamten Verfahrens Montage bleibt. Die Durchflussmenge von Isofluran angemessen. Die Höhe der Isofluran erforderlich, um zu betäuben jedes Tier variieren.
    6. Post-Verfahren, bringen Sie das Tier in seinen Käfig und sicherzustellen, dass er die volle Mobilität und Brustlage gewinnt.

5. Herstellung von LCRT Cells zur subkutanen Tumorentstehung

ANMERKUNG: Eine T-150-Kolben LCRT (90% Konfluenz) ergibt ca. 2 x 10 7 Zellen. Basieren Sie die Anzahl der T-150-Kolben auf der Gesamtzahl der Zellen erforderlich erforderlich. Saatgut zusätzliche Kolben um die Gesamtzahl von Zellen erforderlich ist, erhalten zu gewährleisten und Zellen während der Herstellung und die für zusätzliche Injektionen benötigt verloren aufzunehmen. Halten Sie Zellen auf Eis, wenn möglich die Lebensfähigkeit der Zellen zu verlängern.

  1. Um Zellen, absaugen Medium aus dem Kolben eine Ernted rinse-Zellen mit 5 ml 1x PBS.
  2. Absaugen PBS und Inkubation Zellen mit 2 ml 1x Trypsin, bis die Zellen distanzieren sich ausdrücklich von den Kolben (~ 2 min).
  3. Zellen in 8 ml Medium (für insgesamt 10 ml Zellsuspension) und sanft Pipette auf und ab zu brechen Zellklumpen. Weiter zu Zellen von zusätzlichen Kolben ernten.
  4. Pool alle Zellsuspensionen in einem konischen Rohr, etwa 4 T-150s pro 50 ml konischen Röhrchen.
  5. Zentrifuge das Rohr bei 160 x g für 10 min bei 4 ° C.
  6. Absaugen Medium und Zellpellet in dem entsprechenden Volumen PBS (10 ml PBS pro T-150), um eine Zelldichte in der abzählbaren Bereich ergeben mit einer Zählkammer. Um eine genaue Zellzahl zu gewährleisten, gründliche Durchmischung der Zellsuspension vor dem Laden der Zählkammer durch Auf- und Abpipettieren.
  7. Berechnen der Gesamtzahl der Zellen:
    Gesamtzahl der Zellen geerntet = Zellzahl (Zellen / ml) x Resuspensionsvolumen (ml)
  8. Bestimmendas Volumen der Zellsuspension für alle Injektionen erforderlich. Stellen 2-3 die Dosis pro Experiment. Insgesamt wurden 5 × 10 5 LCRT Zellen subkutan injiziert wird tastbaren Tumoren innerhalb von 3-4 Tagen zu bilden.
    Gesamtzahl der Zellen benötigt = 5 x 10 5 Zellen x Gesamtzahl der Dosen
    Volumen Zellsuspension benötigt (ml) = (erforderlich * Summe der Einspritzvolumina Gesamtzellen) / (Gesamtzahl der Zellen geerntet)
  9. Pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension in eine konische Röhrchen mit PBS und gründlich mischen. Aliquoten Einzeleinspritzungen (100 ul) in Eppendorf-Röhrchen. Während der Einspritzvorgang Röhrchen auf Eis halten.

6. Injektionen

HINWEIS: Führen Sie die Verfahren mit zwei Forscher, ein, um die Injektionen, während die anderen Monitore Atmungsrate der Tiere und den allgemeinen Zustand, während unter Narkose durchzuführen. Verwenden Insulinspritzen (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) für alle Injektionen und eine neue Nadel fürjedes Tier.

  1. Subkutane Injektionen
    1. Zu erfassen und zu betäuben das Tier (Abschnitt 4).
    2. Rasieren Sie die Injektionsstelle mit Klipper. Baumwollratten Fell ist dick und erfordert eine scharfe Schneid um eine glatte Oberfläche für Injektionszwecke zu erhalten. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol mit einem Wattestäbchen und lassen Sie es vollständig, bevor Sie fortfahren verdampfen.
    3. Last Spritzen (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) mit den Zellen durch die Erstellung von langsam und stetig. Wenn Blasen liegen auf der Hand Flick die Spritze mit etwas Kraft. Sobald die Blasen an der Spitze drücken Sie den Kolben, bis die Flüssigkeit ist an der Spitze der Nadel.
    4. Heben Sie die Haut an der Injektionsstelle (wie Haut Zelten bezeichnet), und führen Sie die Nadel Kegel Seite nach oben. Achten Sie darauf, die Nadel bewegt sich frei unter der Haut zu vermeiden, die Injektion intramuskulär.
    5. Vertreibung der Inhalt der Spritze langsam und gleichmäßig. Ziehen Sie die Nadel Kegelseite nach unten.
  2. Intratumorale Injektionen
    1. Erfassen Sie eind betäuben das Tier (Abschnitt 4).
    2. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol mit einem Wattestäbchen und lassen Sie es vollständig, bevor Sie fortfahren verdampfen.
    3. Last Spritzen (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) mit dem Virus Inoculum durch die Erstellung von langsam und stetig, während die Nadel in einer aufrechten Position halten. Wenn Blasen liegen auf der Hand Flick die Spritze mit etwas Kraft. Sobald die Blasen an der Spitze Push dann Kolben, bis die Flüssigkeit an der Spitze der Nadel.
    4. Führen Sie die Nadel Kegelseite nach oben in den Tumor und die Inhalte der Spritze auszustoßen langsam und gleichmäßig während der Bewegung der Nadel in einem fächerförmigen Muster, teilweise Zurückziehen der Nadel vor jeder Bewegung Platzwunde des Tumors zu verhindern. Ziehen Sie die Nadel Kegelseite nach unten.
      HINWEIS: Die subkutane LCRT Tumoren schnell wachsenden und erreichte etwa 100 mm 3 in 5-7 Tagen sind. Weiterhin bilden nekrotischen und hämorrhagische Zentren oft auf der Oberfläche des Tumors innerhalb von mehreren Tagen und erfordern caReful Überwachung (Abbildung 4).
  3. Intraperitoneale Injektionen
    1. Zu erfassen und zu betäuben das Tier (Abschnitt 4).
    2. Reinigen Sie die Injektionsstelle mit 70% Ethanol mit Wattestäbchen und lassen Sie es vollständig, bevor Sie fortfahren verdampfen.
    3. Last Spritzen (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) mit dem Medikament durch die Erstellung von langsam und stetig. Wenn Blasen liegen auf der Hand Flick die Spritze mit etwas Kraft. Sobald die Blasen an der Spitze Push dann Kolben, bis die Flüssigkeit an der Spitze der Nadel.
    4. Führen Sie die Nadel in den rechten unteren Quadranten des Bauches. Ziehen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass Blut oder Kot wird nicht angesaugt ist, zeigt dies eine falsche Platzierung der Nadel. Wenn dies der Fall ist, ziehen Sie die Nadel und bereiten eine neue Spritze. Wenn die Nadel richtig eingesetzt, Inhalt der Spritze auszustoßen gleichmäßig und langsam.

7. Tumorentfernung und Necropsy

  1. Sammeln und Reinigen all Werkzeuge mit 70% igem Ethanol vor der Euthanasie der Tiere.
  2. Euthanize das Tier durch das gewünschte Verfahren wird CO 2 Inhalation (2 l / min 5-10 min) empfohlen. Untersuchen Sie das Tier für alle Anomalien in Körperkondition.
  3. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einer Dissektion Bord und reinigen Sie das Tier mit 70% Ethanol.
  4. Verwenden einer Pinzette, um die Haut am Unterbauch zu heben. Schnitt durch die Haut und Muskeln mit einer Schere und eine mediale Inzision entlang der Länge des Tieres (Anus bis zum Kinn).
  5. Schneiden Sie den Brustkorb, indem zwei Schnitte, eine seitlich an der Seite des Brustkorbs und eine über dem Brustbein, um das Herz und die Lunge aus. Untersuchen Sie die Lungenlappen für Metastasen 27,29.
  6. Überprüfen Sie alle Organe auf Anomalien untersuchen und etwaige Änderungen in Farbe, Größe und Konsistenz. Falls erforderlich, einschneiden die Organe mit einem Skalpell zu inneren Geweben zu untersuchen. Insbesondere prüft die Leber, Nieren, Milz und Magen-Darm-Traktes.
  7. Überprüfen Sie die Lymphknoten Metastasen und Erweiterung 27,29.
  8. Um den Tumor zu sammeln, müssen Flanke Einschnitte oberhalb und unterhalb des Tumors, so dass sich die Haut vom Körper mit einer Pinzette herausgezogen werden. Während Festhalten der Haut mit einer Pinzette, mit einem Skalpell vorsichtig den Tumor, indem zwischen dem Tumor und Dermis (Abbildung 5).
  9. Sofort setzen Sie den Tumor in einem beschrifteten Behälter von 10% neutral gepuffertem Formalin.
  10. Abhängig von der Größe des Tumors, 1-2 Tage (≤ 2 mm, klein) oder 5-6 Tage (> 2 mm, groß) zur Befestigung vor Vorbereitungsabschnitte für die histologische Analyse (Abbildung 6).

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Representative Results

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Durch die extrem erregbarer Natur der Baumwollratten, da kennen und Verwendung von Verfahren optimiert, um die Belastung der Tiere zu reduzieren wird bei der Nutzung als präklinischen Tiermodell zu erleichtern. Verwendung der richtigen Handhabungstechniken minimiert auch die Gefahr für die Forscher.

Bei der Verwendung von Baumwollratten ist es unerlässlich, ruhig zu bleiben. Die Ratten wurden leicht erregbar und versucht, ihren Käfig entkommen. Verwendung eines Anreicherungsrohr und nestlets werden Fluchtversuche zu minimieren. Abbildung 2 zeigt die optimale Käfig Setup in Erfassung von Baumwollratten, einschließlich Platzierung der Anreicherungsrohr zu unterstützen. Darüber hinaus arbeiten in einem kleinen Raum, wenn möglich, in der Rückeroberung zu unterstützen. Wenn Flucht auftritt, warten Sie, bis das Tier zu beruhigen und stationär bleiben, dann bedecken Sie es mit der klaren Erfassung Behälter oder Deckel mit Handschuhen, man aufpassen, nicht zu viel Kraft zu verwenden.

Im Gegensatz zu einer Maus hat die Baumwollratte eine längliche Schnauze which erfordert eine andere Nase passend, um die Narkosegas zu liefern. Abbildung 3 zeigt einen Nasenkegel entwickelt, um richtig fit ein Baumwollratten und maximieren Lieferung von Isofluran. Verwendung einer Gummimembran als eine Armatur in Trauma an der Nase der Ratte führen.

Wenn möglich Verwerfen Tiere zu erhalten (die nicht von anderen Forschern, Baumwollratten oder anderweitig erforderlich) zur Injektionstechniken, bevor Sie versuchen sie auf die Ratten zu üben. Dies ermöglicht es dem Forscher, die Vertrautheit mit Nadeln und wie man sicher mit ihnen umgehen zu gewinnen. Insulinspritzen sind für Injektionszwecke in Baumwollratten vorgeschlagen, wie ihre Haut ist dick und hart im Vergleich zu einer Maus. Jedoch kann eine grßere Nadel (21 G x 1 ') für die Injektion von Tumorzellen durch Zell Scherung während der Injektion verwendet werden, um den Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen zu vermeiden. Vorsichtsmaßnahmen sollten befolgt werden, wie zum Beispiel nicht die Runderneuerung von Nadeln und ordnungsgemäße Entsorgung in einen Behälter für scharfe Gegenstände.

Der Spritztion von lebensfähigen Tumorzellen ist für eine gute Tumorbildung. 1A zeigt eine gesunde Monoschicht LCRT Zellen die für die Injektion in Baumwollratten hergestellt werden können. Im Vergleich 1B zeigt LCRT Zellen, die eine geringe Lebensfähigkeit und sollte nicht für Injektionszwecke verwendet werden. Es ist wichtig, Tumorzelllebensfähigkeit zu überprüfen, indem ein Verfahren, wie Trypan-Blau-Färbung, wenn die Zellzählung für Injektionszwecke.

Die von LCRT Zellen gebildet Tumoren schnell wachsen und nekrotische Zentren bilden oft (4A). Als solche sollten die Tumorbildung sorgfältig überwacht werden, um Geschwüre (4B) zu vermeiden. Wenn Geschwüre tritt das Tier geopfert werden, um eine Infektion und möglichen Tod durch Sepsis zu vermeiden.

Die Wirkungen der Antitumor-Behandlungen werden häufig am besten durch histologische Analyse untersucht. Dies erfordert Entfernung des Tumors post mortem. Die Aufrechterhaltung Tumorgewebe Integrität wird result in einer Probe, die eine genauere Darstellung des Tumors in vivo ist. Figur 5 zeigt ein Verfahren, durch das Herausschneiden des Tumors wird sorgfältig vom umgebenden Gewebe mit einem Skalpell und Pinzette abgetrennt. Entfernung des Tumors, indem Sie sie mit Gewalt aus dem umgebenden Gewebe mit einer Pinzette kann den Tumor brechen oder stören Tumorgewebe Integrität beeinträchtigen richtige histologische Analyse. Die dichte und hoch vaskularisierte Struktur des Tumors, wie in Figur 6 zu sehen ist, wird durch diese Exzision Technik gehalten. Dies ist bei der Analyse von Behandlungen, Tumorvaskulatur beeinflussen wichtig, wie es der Fall bei vielen OVs.

Figur 1
Abb. 1: Hellfeldmikroskopie Bild LCRT Zellen (A) Phänotyp des gesunden (~ 90% lebensfähig) LCRT Zellen bereit für die Vorbereitung für die Injektion in Baumwollratten. (B) Neben Phänotyp LCRT Zellen nicht fit für die Injektion. Abgerundete Zellen sind tot oder sterbend (durch einen Pfeil gekennzeichnet). Bilder wurden bei 10-facher Vergrößerung aufgenommenen; Balken = 1 mm.

Abbildung 2
Abbildung 2: Beispiel der Käfig-Setup für eine einfache Erfassung von Baumwollratten Optimale Platzierung der Anreicherungsrohr gegen das Ende des Käfigs und die Einbeziehung der nestlets in der Tiererfassung..

Figur 3
Abb. 3: Anästhesie Bugnase passend für die Lieferung von Isofluran betäubt Baumwollratten Hergestellt Bugnase passt längliche Schnauze Baumwollratten, um genaue Lieferung von Gas, ohne Isofluran Trauma Nase zu gewährleisten.

"4" Abb. 4: Nekrotisches Gewebe auf einer subkutanen Tumor LCRT (A) Frühe Stadien der Nekrose von Tumorgewebe. Das Tier sollte sorgfältig überwacht werden, um das Fortschreiten zu (B) vollständig geöffnet Geschwüre zu verhindern. Das Tier sollte geopfert, wenn Tumor ulzeriert wie Infektionen und Sepsis können die Folge sein.

Abbildung 5
Fig. 5: Exzision einer subkutanen LCRT Tumor für die Histologie Die subkutane Tumor auf die Flanke eines Baumwollratte wird vorsichtig von der Haut entfernt werden unter Verwendung eines Skalpells auf Tumorgewebeintegrität aufrechtzuerhalten, wodurch eine bessere Darstellung der Tumor-Architektur für die histologische Analyse.

Figur 6 Fig. 6: Die histologische Gewebeschnitt aus einem subkutanen Tumor LCRT Die Morphologie LCRT Tumorgewebe untersucht unter Verwendung von in Paraffin eingebetteten Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt. Das Bild wurde bei 20-facher Vergrößerung erfasst; Balken = 1 mm.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

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References

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Die Handhabung der Baumwolle Ratte in Studien für die präklinische Bewertung onkolytischer Viren
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Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

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