Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Manipolazione del Cotton Rat in studi per la valutazione pre-clinica di oncolitici virus

doi: 10.3791/52232 Published: November 24, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Virus oncolitici (OV) replicano selettivamente nelle cellule tumorali sfruttando differenze biochimiche tra cellule normali e tumorali 1,2. Ci sono due tipi di VU: quelli che non necessitano di una mutazione per raggiungere oncolisi selettivo, denominato naturalmente allo wild-type virus e quelli che devono essere progettati per ottenere oncolisi selettiva. La collezione di mutazioni all'interno di un determinato tipo di tumore determina la natura del vantaggio di crescita selettiva su cellule normali per OV 2. La sicurezza e vantaggio di utilizzare VU è stata dimostrata in studi clinici 3-7. Nonostante i progressi nel campo della viroterapia oncolytic esistono spazi vuoti tra i risultati pre-clinici e clinici, suggerendo che i modelli migliori sono necessari per valutare l'efficacia antitumorale di VU.

Bovine herpesvirus 1 (BHV-1) è un membro della famiglia Herpesviridae, e Alphaherpesviridae sottofamiglia. BHV-1 initiAtes bovina complesso malattie respiratorie nei bovini, manifestando in una grande varietà di sintomi che assomiglia ad un brutto raffreddore 8,9. BHV-1 si lega fissaggio e ingresso recettori utilizzati da HSV-1, come eparan solfato e nectin-1 10. Tuttavia, si lega CD155 nel luogo di nectin-2 10. BHV-1 ha una gamma di ospiti molto ristretta tale che sia in grado di entrare e avviare la replica in cellule murine normali e trasformate 3,4,10 efficiente. Questo rende l'uso di modelli murini convenzionali problematico. La capacità di oncolytic BHV-1 è stata dimostrata in vitro 11,12. BHV-1 ha dimostrato di avviare la replica e uccidere le cellule tumorali umane da una varietà di origini istologici, comprese le cellule del cancro al seno e il cancro al seno avvio cellule 11,12. Tuttavia, la capacità antitumorale di BHV-1 deve essere valutata in vivo nel contesto di un ospite immunocompetente.

Adenovirus umano (Ad), per il qualeci sono 57 sierotipi identificati, più comunemente provoca malattie respiratorie negli esseri umani. Ad vettori oncolitici sono stati valutati per la loro efficacia antitumorale con diversi avanzare in studi clinici 13-15. Nonostante i dati pre-clinici promettenti, i risultati clinici sono stati inferiori alle aspettative. Modelli xenotrapianto di tumori umani sono in genere utilizzati per studiare l'efficacia antitumorale di vettori Ad, anche se esibiscono attenuate le risposte immunitarie al virus 16,17. Inoltre, i modelli murini singenici sono non-permissive all'infezione annuncio, rendendo la valutazione della risposta immunitaria con questi modelli impraticabile 17,18.

Il sistema immunitario dell'ospite è stato identificato come il meccanismo più influente attraverso il quale VU suscitano tumorali morte cellulare 19. Risposte antitumorali tra tolleranti e l'antigene associato al tumore non-tolleranti (TAA) modelli differiscono e possono influenzare notevolmente il successo della terapia OV. L'HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 nel 1814 20) 20,21 suscitato regressione del tumore nel 80% dei topi portatori di tumore in un murino antigene Polyoma Medio T modello di cancro mammario 22. Tuttavia, in HER-2 modelli / neu, l'efficacia antitumorale di KM100 variava tra il 20% completa regressione nei topi singenici e tumore stasi transgenici, topi HER2-tolleranti. Insieme, questi dati evidenziano l'importanza di valutare pienamente VU utilizzando modelli animali che meglio ricapitolano il paesaggio immunitario umano per comprendere appieno le caratteristiche che determinano il successo terapeutico.

Il ratto di cotone (Sigmodon hispidus), indigeni del Nord e Sud America, è più comunemente usato come modello di infezione da virus respiratorio sinciziale (come rivisto in 5). Ratti di cotone sono utilizzati anche in-BHV-1 contro la ricerca di vaccinazione come ricapitolano la patologia associata a malattia respiratoria bovina complessa 6,23. Inoltre, BHV-1 infezione di ratti di cotoneè immunogenico, inducendo mucosa sostenuta e risposte immunitarie sistemiche 6,23-25. Le linee cellulari sono stati derivati ​​da fibrosarcoma spontanea e osteosarcomi della ghiandola mammaria (LCRT) e ossa (CCRT e VCRT), rispettivamente, 26. Cotone ratti sono stati utilizzati per valutare l'efficacia in vivo di vettori Ad oncolytic come sono suscettibili all'infezione annuncio ed esporre patologia simile all'uomo 27-29. L'uso di modelli immunocompromessi per la valutazione pre-clinica di VU non sono solo meno indicativo di risposte cliniche alla terapia ma non tengono conto del ruolo del sistema immunitario in viroterapia oncolitica 30,31. Pertanto, la singenici e modelli tumorali cotone ratto-tolleranti di carcinoma mammario e osteosarcoma sono modelli pertinenti a cui valutare l'efficacia pre-clinica di VU, quali BHV-1 e Ad che non può essere studiata utilizzando modelli murini convenzionali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOTA: I protocolli utilizzati sono stati approvati dal nostro istituzionale Animal Research Ethics Consiglio della McMaster University in base al Canadian sugli orientamenti per la cura degli animali. Gli esperimenti sono stati condotti presso l'impianto di McMaster University Central Animal.

1. Le celle Culturing LCRT

  1. Cellule Culture LCRT in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina. Mantenere le cellule in T-150 fiasche di coltura tissutale a 37 ° C e 5% di CO 2. Passaggio cellule quando formano un monostrato 90% confluenti (ogni 2-3 giorni, Figura 1).
  2. Pre-caldo 1x tampone fosfato salino (PBS), 1x tripsina e medie in un bagno d'acqua a 37 ° per 10 minuti prima di dividere le celle.
  3. Aspirare il terreno dal pallone e lavare le cellule con 5 ml di 1x PBS.
  4. Dopo il risciacquo, aspirare PBS e incubarecellule con 2 ml di tripsina 1x fino cellule dissociano dal pallone (~ 2 min).
  5. Risospendere le cellule in 8 ml di mezzo (per un totale di sospensione cellulare 10 ml) e delicatamente pipettare su e giù per rompere grumi di cellule.
  6. Mantenere cellule in un pallone T-150 mediante inseminazione di 1 ml di sospensione cellulare in 24 ml di mezzo (per un totale di 25 ml per T-150) e pallone roccia delicatamente da lato a lato. Mantenere le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2 fino al prossimo divisione.

2. Valutare la replicazione del virus e citotossicità in cellule LCRT

  1. Replica Virus
    NOTA: costrutti virus che esprimono un tag fluorescenti, come la proteina verde fluorescente (GFP), sotto il controllo di promotori virali endogeni facilitano la visualizzazione di infezione da virus e diffondere con lettori di piastre a fluorescenza.
    1. Seed cellule LCRT in piastre di coltura, lasciando un bene per il conteggio. Cellule semi tale che essi saranno 80-90% confluenti un giorno in più. Utilizzare una concentrazione di 10 5 cells / ml (100 ml per pozzetto) per produrre la confluenza desiderato un giorno in più in 96 pozzetti piastre a fondo piatto.
    2. Il giorno dopo, pre-caldo 1x PBS, 1x tripsina, terreno completo e privo di siero in un bagno d'acqua a 37 ° per 10 minuti prima di iniziare l'esperimento.
    3. Aspirare il terreno dalle conteggio ben e risciacquo cellule con 5 ml di PBS 1x di oscillazione sopra la superficie del pozzetto.
    4. Dopo il risciacquo, le cellule aspirare PBS e incubare con 2 ml di tripsina 1x fino cellule si dissociano dal pallone (~ 2 min).
    5. Risospendere le cellule in volume appropriato di terreno completo per produrre una densità cellulare nell'intervallo numerabile utilizzando un emocitometro. Per assicurare una conta cellulare accurata, mescolare la sospensione cellulare prima inoculando l'emocitometro pipettando su e giù.
    6. Determinare il volume del virus azione necessaria per l'infezione alla molteplicità desiderata di infezione (MOI).
      Richiesto Paque Forming Unit (pfu) = numero di cellule placcato * MOI(Pfu / cell)
      Volume del virus magazzino required = richiesto pfu / virus magazzino titolo (pfu / ml)
    7. Preparare inoculo virus in terreno privo di siero in tubi. Mescolare accuratamente con il vortex o pipettare prima di aggiungere inoculo alle cellule.
    8. Infettare le cellule per 1 ora a 37 ° C, dopo di che applicare una sovrapposizione di DMEM + 1% FBS manutenzione.
    9. Piastre di scansione uno e due giorni dopo l'infezione (pi) di visualizzare GFP fluorescenza.
  2. Virus citotossicità
    NOTA: Eseguire il test di citotossicità resazurina in condizioni di scarsa illuminazione, come il composto è fotosensibile. Solo Un mezzo ben contenente dovrebbe essere inclusa per correggere fluorescenza di fondo.
    1. Preparare una soluzione al 5% (v / v) di resazurina in PBS 1x. Mescolare la soluzione pipettando.
    2. Medio Aspirare dalle cellule e applicare la soluzione resazurina 5%. Includere un mezzo ben contenente solo per correggere per fluorescenza di fondo.
    3. Incubare le cellule per 30 min a 37 ° C, dopoche leggere la fluorescenza utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza (eccitazione 530 nm, emissione 595 nm).
    4. Analizzare i dati relativi ai controlli non infetti correzione per fluorescenza di fondo.

3. Housing and Handling

  1. Housing e dieta
    1. Ratti Cotton House individualmente a diminuire in-combattimenti in policarbonato gabbie ratto contenenti biancheria da letto di roditori (1/8 "assestamento pannocchia), un tratto di non più di 8 pollici e nestlets come arricchimento tubi in PVC (Figura 2).
    2. Usare un cestello in acciaio a protezione diretta a sedersi overtop della gabbia e contenere cibo roditori e una bottiglia d'acqua.
      NOTA: Questa configurazione gabbia consentirà cattura sicuro e facile degli animali, con il posizionamento del tubo arricchimento contro l'estremità dell'essere gabbia della massima importanza.
  2. Trattamento
    1. Maniglia ratti cotone al mattino, prima di giro da parte dei tecnici degli impianti animale per evitare emozionante primauna procedura.
    2. Durante tutte le procedure, indossare guanti di pelle di spessore per la protezione.
    3. Come gli animali rimangono essenzialmente nei tubi di arricchimento, utilizzarli per trasferire i ratti in una nuova gabbia durante la pulizia di routine. In alternativa, aprire un po 'la gabbia per consentire al gestore di raggiungere la loro mano, l'animale può essere trattenuta scruffing pelle appena sopra le spalle e spingendo verso il basso. Prestare attenzione a non usare forza eccessiva, come l'animale può mordere la lingua.
    4. Siate pazienti e utilizzare una mano ferma, come gli animali hanno una forte risposta di volo o di lotta e cercheranno di evitare la cattura da correre e saltare fuori dalla gabbia. È importante sottolineare che, non maneggiare gli animali per la coda, come si verificherà degloving.
    5. Trappola gli animali nel loro arricchimenti tubi sopra manipolazione diretta. Questo diminuisce drasticamente lesioni e fuga.

4. Acquisizione e Anestesia

  1. Cattura
    1. Indossare guanti di pelle di spessore per protezionelitio durante tutte le procedure.
    2. Utilizzare un grande contenitore in plastica trasparente con fori per l'aria ed un coperchio, una camera di induzione anestetica abbastanza grande da contenere il contenitore ed un cono montato sul tubo di uscita del gas (Figura 3).
    3. Lavorano in coppia per rendere la procedura più efficiente e per diminuire il tempo di esposizione degli animali isoflurano, un anestetico per inalazione. Assicurarsi un ricercatore è responsabile per l'apertura e la sostituzione della copertura in acciaio sulla gabbia e il coperchio della camera di induzione (gestore 1 #) e loro socio è responsabile per la cattura dell'animale nel tubo e trasporto alla camera di induzione (gestore # 2).
    4. Posizionare la gabbia su una superficie piana e rimuovere il coperchio esterno. Sollevare il vassoio di alimentazione inox leggermente e lentamente manovrare il tubo arricchimento quindi è parallelo ai lati della gabbia e contro la parte posteriore. Se necessario, utilizzare un oggetto per manovrare il tubo arricchimento senza aprire la gabbia per evitare agitare l'animale (gestirer # 1).
    5. Se l'animale diventa agitato e lascia il tubo, lasciare il tempo sufficiente per l'animale per rilassarsi e ancora una volta stabilirsi nel tubo (handler 1 #).
    6. Lentamente e deliberatamente sollevare il bordo della copertura in acciaio lontano dal tubo arricchimento, mantenendo l'altra estremità a contatto con la gabbia. Fare uno spazio sufficiente per il contenitore di plastica (handler 2 #).
    7. In un movimento rapido e uniforme, spingere il contenitore di plastica overtop del tubo arricchimento. Mantenere il contatto del contenitore con il lato della gabbia, intrappolando l'animale nel tubo. Eseguire i passi 4.1.6 e 4.1.7 il più rapidamente possibile (handler 2 #).
    8. Rimuovere il vassoio di alimentazione in acciaio e dare il coperchio del contenitore di plastica per Handler 2 # (handler 1 #). Scorrere il coperchio di plastica tra il lato della gabbia e il contenitore, memori di appendici dell'animale intrappolato nel processo. Non sigillare il contenitore come questo renderà il prossimo passo più difficile (handler # 2).
  2. Anesthesia
    1. Assicurarsi che il contenitore rimane chiuso e trasportare l'animale alla camera di induzione. Introdurre rapidamente l'animale in camera e rimuovere il coperchio del contenitore in un unico movimento fluido (handler 2 #). Aprire e sostituire immediatamente il coperchio della camera di induzione (handler # 1).
    2. Accendere il flusso di isoflurano alla camera di induzione (5 L / min) e monitorare l'animale segni di letargia, a questo punto rapidamente scorrono l'animale dal tubo e contenitore, rimozione sia dalla camera di induzione per facilitare la circolazione del gas.
    3. Quando il ratto è completamente anestetizzato, spostarlo nella superficie di lavoro e posizionare il naso e la bocca nel cono (Figura 3). Il ratto è completamente anestetizzato quando non risponde ad un pizzico punta forte.
    4. Posizionare vet vaselina pomata oftalmica sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza e abrasioni. Questo è un passo essenziale come i ratti di cotone hanno grandi occhi che possono essere a rischio di infezione in caso di ferite.
    5. <li> monitorare attentamente e mantenere un ritmo di respirazione costante e garantire che il naso dell'animale rimane nel naso cono del raccordo durante tutta la procedura. Regolare il flusso di isoflurano appropriato. La quantità di isoflurano richiesta per anestetizzare ogni animale varierà.
    6. Post-procedura, tornare l'animale a sua gabbia e assicurarsi che riacquista piena mobilità e decubito sternale.

5. Preparazione di cellule LCRT per sottocutaneo Tumor Formazione

NOTA: Un pallone T-150 LCRT (90% di confluenza) produce circa 2 x 10 7 cellule. Basate il numero di T-150 flaconi necessari sul numero totale di cellule necessarie. Seme flaconi supplementari per garantire il numero totale di cellule viene ottenuta e per ospitare cellule perse durante la preparazione e quelli necessari per iniezioni supplementari. Mantenere le cellule in ghiaccio ogniqualvolta possibile prolungare la vitalità cellulare.

  1. Per raccogliere le cellule, a medio aspirato dal un fiascod cellule Sciacquare con 5 ml di 1x PBS.
  2. Aspirare PBS e incubare cellule con 2 ml di 1x tripsina fino cellule si dissociano dal pallone (~ 2 min).
  3. Risospendere le cellule in 8 ml di mezzo (per un totale di sospensione cellulare 10 ml) e delicatamente pipettare su e giù per rompere grumi di cellule. Continuare a raccogliere le cellule da palloni supplementari.
  4. Piscina tutto sospensioni cellulari in un tubo conico, circa 4 T-150s per tubo da 50 ml.
  5. Centrifugare la provetta a 160 x g per 10 min a 4 ° C.
  6. Aspirare medio e risospendere il pellet cellulare in volume appropriato di PBS (10 ml PBS per T-150) per produrre una densità cellulare all'interno della gamma numerabile utilizzando un emocitometro. Per assicurare una conta cellulare accurata, mescolare la sospensione cellulare prima di caricare l'emocitometro pipettando su e giù.
  7. Calcolare il numero totale di cellule:
    Numero totale delle cellule raccolte = conta delle cellule (cellule / ml) x risospensione volume (ml)
  8. Determinareil volume di sospensione cellulare richiesto per tutte le iniezioni. Effettuare 2-3 dosi extra per esperimento. Un totale di 5 x 10 5 cellule LCRT iniettate sottocute formerà tumori palpabili entro 3-4 giorni.
    Numero totale di celle richieste = 5 x 10 5 cellule x numero totale di dosi
    Sospensione cellulare Volume richiesto (ml) = (cellule totali richiesti * somma dei volumi di iniezione) / (numero totale di cellule raccolte)
  9. Dispensare il volume richiesto di sospensione cellulare in un tubo conico contenente PBS e mescolare accuratamente. Aliquota iniezioni singole (100 microlitri) in provette Eppendorf. Mantenere i tubi in ghiaccio durante la procedura di iniezione.

6. Iniezioni

NOTA: Eseguire le procedure con due ricercatori, uno per eseguire le iniezioni, mentre gli altri monitor frequenza respiratoria dell'animale e la condizione generale, mentre sotto anestesia. Utilizzare siringhe da insulina (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) per tutte le iniezioni e un nuovo ago perogni animale.

  1. Iniezioni sottocutanee
    1. Cattura e anestetizzare l'animale (sezione 4).
    2. Shave il sito di iniezione con tagliaunghie. Cotton rat pelliccia è spessa e richiede un trimmer acuto per ottenere una superficie liscia per preparazioni iniettabili. Pulire il sito di iniezione con il 70% di etanolo con un batuffolo di cotone e lasciarlo evaporare completamente prima di procedere.
    3. Siringhe di carico (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) con le cellule redazione lentamente e costantemente. Se le bolle sono flick evidenti la siringa con una certa forza. Una volta che le bolle sono premendo lo stantuffo alto finché il liquido è nella parte superiore dell'ago.
    4. Sollevare la pelle al sito di iniezione (denominato tenting pelle) e inserire l'ago smusso verso l'alto. Assicurarsi che l'ago si muove liberamente sotto la pelle per evitare l'iniezione intramuscolare.
    5. Espellere il contenuto della siringa in modo uniforme e lentamente. Estrarre il lato smusso ago verso il basso.
  2. Iniezioni intratumorale
    1. Scattare unad anestetizzare l'animale (sezione 4).
    2. Pulire il sito di iniezione con il 70% di etanolo con un batuffolo di cotone e lasciarlo evaporare completamente prima di procedere.
    3. Siringhe di carico (29 G 1/2 x ', 0,3 ml) con l'inoculo del virus elaborando lentamente e costantemente tenendo l'ago in posizione verticale. Se le bolle sono flick evidenti la siringa con una certa forza. Una volta che le bolle sono premendo poi pistone sino all'inizio del liquido è in cima dell'ago.
    4. Inserire il lato dell'ago fino smusso nel tumore ed espellere il contenuto della siringa in modo uniforme e lentamente mentre si muove l'ago in un modello a ventaglio, parzialmente estratto l'ago prima di ogni movimento per evitare la lacerazione del tumore. Estrarre il lato smusso ago verso il basso.
      NOTA: i tumori LCRT sottocutanee sono in rapida crescita, raggiungendo circa 100 mm 3 in 5-7 giorni. Inoltre, necrotiche e emorragiche centri spesso formano sulla superficie del tumore entro diversi giorni e richiedono camonitoraggio Reful (Figura 4).
  3. Iniezioni intraperitoneali
    1. Cattura e anestetizzare l'animale (sezione 4).
    2. Pulire il sito di iniezione con il 70% di etanolo con tamponi di cotone e lasciarlo evaporare completamente prima di procedere.
    3. Siringhe di carico (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) con la droga, elaborando lentamente e costantemente. Se le bolle sono flick evidenti la siringa con una certa forza. Una volta che le bolle sono premendo poi pistone sino all'inizio del liquido è in cima dell'ago.
    4. Inserire l'ago nel quadrante in basso a destra dell'addome. Tirare indietro lo stantuffo per garantire che il sangue o feci non sono aspirati, ciò indica errato posizionamento dell'ago. In questo caso, ritirare l'ago e preparare una nuova siringa. Quando l'ago è posizionato correttamente, di espellere il contenuto della siringa in modo uniforme e lentamente.

7. Tumore escissione e Necropsy

  1. Raccogliere e pulire alstrumenti l con etanolo al 70% prima dell'eutanasia dell'animale.
  2. Euthanize l'animale con il metodo desiderato, si raccomanda CO 2 inalazione (2 L / min per 5-10 min). Esaminare l'animale per eventuali anomalie nella condizione fisica.
  3. Posto l'animale in decubito dorsale su una tavola di dissezione e pulire l'animale con il 70% di etanolo.
  4. Utilizzare le pinzette per sollevare la pelle al basso addome. Tagliare la pelle ei muscoli con le forbici e fare un'incisione mediale corre lungo dell'animale (ano al mento).
  5. Tagliare la gabbia toracica facendo due tagli, uno lateralmente sul lato della gabbia toracica e uno attraverso lo sterno per esporre cuore e polmoni. Esaminare i lobi dei polmoni per eventuali metastasi 27,29.
  6. Esaminare tutti gli organi per le anomalie e registrare eventuali cambiamenti di colore, la dimensione e la consistenza. Se necessario, gli organi incidere con un bisturi per esaminare tessuti interni. In particolare, esamina il fegato, i reni, la milza e il tratto gastrointestinale.
  7. Controllare i linfonodi per metastasi e l'allargamento 27,29.
  8. Per raccogliere il tumore, fare incisioni fianchi sopra e sotto il tumore in modo che la pelle può essere tirato via dal corpo con le pinzette. Tenendo saldamente la pelle con una pinzetta, utilizzare un bisturi per rimuovere accuratamente il tumore tagliando tra tumore e derma (Figura 5).
  9. Posizionare immediatamente il tumore in un contenitore etichettato del 10% formalina tamponata neutra.
  10. A seconda delle dimensioni del tumore, consentire 1-2 giorni (≤ 2 mm piccole) o 5-6 giorni (> 2 mm grandi) di fissaggio prima di preparare sezioni per l'analisi istologica (figura 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A causa della natura estremamente eccitabile di ratti cotone, essendo a conoscenza e utilizzando procedure ottimizzate per ridurre lo stress degli animali faciliterà nel loro uso come modello animale preclinico. L'uso di tecniche di manipolazione anche minimizzare i rischi per il ricercatore.

Quando si utilizzano topi cotone è indispensabile per mantenere la calma. I ratti sono altamente eccitabile e tenteranno di sfuggire alla loro gabbia. L'uso di un tubo di arricchimento e nestlets minimizzeranno tentativi di fuga. Figura 2 mostra la configurazione ottimale gabbia per aiutare nella cattura di ratti cotone, compresi il collocamento del tubo arricchimento. Inoltre, lavorare in una piccola stanza, se possibile, per aiutare nella riconquista. In caso di fuga, attendere che l'animale di calmarsi e di rimanere fermo, poi coprire con il contenitore di cattura chiara o coprire con le mani guantate, facendo attenzione a non usare una forza eccessiva.

A differenza di un topo, ratto cotone ha un muso allungato which richiede un naso diverso raccordo di consegnare il gas anestetico. Figura 3 illustra un cono progettato per adattarsi correttamente un ratto di cotone e di massimizzare la consegna di isoflurano. Utilizzando una membrana di gomma come un raccordo può causare traumi al naso del ratto.

Se possibile ottenere animali di scarto (quelli non necessari da altri ricercatori, i ratti di cotone o altro) per praticare tecniche di iniezione prima di loro tentando sui ratti. Questo permetterà ai ricercatori di acquisire familiarità con aghi e come gestirli in modo sicuro. Siringhe dell'insulina sono suggeriti per le iniezioni nei ratti di cotone come la loro pelle è spessa e resistente rispetto ad un mouse. Tuttavia, un ago più grande (21 G x 1 ') può essere utilizzato per l'iniezione di cellule tumorali per evitare la perdita di vitalità cellulare dovuta al taglio delle cellule durante l'iniezione. Misure di sicurezza devono essere seguite, come ad esempio non ricapitolando aghi e il corretto smaltimento in un apposito contenitore.

L''iniezionezione di cellule tumorali vitali è importante per una corretta formazione del tumore. La figura 1A mostra un monostrato di cellule sane LCRT che possono essere preparati per iniezione in ratti cotone. In confronto Figura 1B mostra cellule LCRT che hanno bassa redditività e non devono essere usati per preparazioni iniettabili. È importante verificare vitalità cellulare tumorale utilizzando un metodo come Trypan blu colorazione quando il conteggio delle cellule per preparazioni iniettabili.

I tumori formati da cellule LCRT sono in rapida crescita e centri necrotiche spesso formano (Figura 4A). Come tale, formazione di tumori devono essere monitorati attentamente per evitare ulcerazioni (Figura 4B). Se si verifica ulcerazioni l'animale deve essere sacrificato per evitare l'infezione e la possibile morte per sepsi.

Gli effetti di trattamenti anti-tumorali sono spesso meglio esaminate attraverso l'analisi istologica. Ciò richiede l'asportazione del post mortem tumore. Mantenere l'integrità del tessuto tumorale sarà result in un campione che è una rappresentazione più accurata del tumore in vivo. La Figura 5 mostra una tecnica di escissione con cui il tumore è accuratamente separati dal tessuto circostante con un bisturi e pinzette. Rimozione del tumore tirandolo con la forza dal tessuto circostante utilizzando pinzette possono rompersi il tumore o distruggere l'integrità del tessuto tumorale, impatto corretta analisi istologica. La struttura densa e altamente vascolarizzato del tumore, come si vede in figura 6, è mantenuto da questa tecnica di escissione. Questo è importante in analisi di trattamenti che incidono vascolare del tumore, come è il caso di molti VU.

Figura 1
Figura 1:. Luminoso-campo immagine al microscopio di cellule LCRT (A) fenotipo di una sana (~ 90%), le cellule vitali LCRT pronti per la preparazione per l'iniezione in topi di cotone. (B) fenotipo indesiderabili di cellule LCRT non adatta per l'iniezione. Cellule arrotondate sono morti o moribondi (indicato da una freccia). Le immagini sono state catturate a 10X di ingrandimento; barra della scala = 1 mm.

Figura 2
Figura 2: Esempio di configurazione gabbia per facilità di cattura di ratti cotone posizionamento ottimale di arricchimento tubo contro l'estremità della gabbia e inclusione di nestlets aiuti in cattura animali..

Figura 3
Figura 3:. Anestesia ogiva adatta per la consegna di isoflurano a ratti anestetizzati cotone Prodotto ogiva adatta muso allungato di cotone topo per garantire la consegna precisa di gas isoflurano senza traumi al naso.

"Figura Figura 4:. Il tessuto necrotico su un tumore LCRT sottocutanea (A) Prime fasi di necrosi del tessuto tumorale. L'animale deve essere monitorato attentamente per evitare la progressione a (B) ulcera completamente aperta. L'animale deve essere sacrificato se ulcera tumorali come infezioni e sepsi può provocare.

Figura 5
Figura 5:. Escissione di un tumore LCRT sottocutanea per istologia Il tumore sottocutaneo sul fianco di un ratto cotone viene accuratamente rimosso dalla pelle con un bisturi per mantenere l'integrità del tessuto tumorale, fornendo così una migliore rappresentazione dell'architettura tumorale per l'analisi istologica.

Figura 6 Figura 6:. Sezione tissutale istologica di un tumore LCRT sottocutaneo La morfologia del tessuto tumorale LCRT esaminato utilizzando sezioni in paraffina colorate con ematossilina e eosina (H & E). L'immagine è stata catturata a 20X di ingrandimento; barra della scala = 1 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7, (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254, (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78, (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63, (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11, (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8, (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26, (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66, (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20, (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88, (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14, (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62, (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12, (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110, (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30, (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74, (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76, (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12, (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78, (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17, (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222, (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13, (1), 123 (2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16, (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369, (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22, (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19, (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).
Manipolazione del Cotton Rat in studi per la valutazione pre-clinica di oncolitici virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter