Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Håndtering av Cotton Rat i studier for de prekliniske Evaluering av Onkolytiske virus

doi: 10.3791/52232 Published: November 24, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Onkolytiske virus (OV) selektivt å replikere i tumorceller ved å utnytte biokjemiske forskjeller mellom normale og tumorceller 1,2. Det er to typer av OVS: de som ikke krever en mutasjon for å oppnå selektiv oncolysis, referert til som naturlig forekommende vill-type virus og de som må være konstruert for å oppnå selektiv oncolysis. Samlingen av mutasjoner innenfor et gitt tumortype bestemmer arten av den selektive vekst fordel i forhold til normale celler til et OV-2. Den sikkerhet og nytte av hjelp OVS har blitt vist i kliniske studier 3-7. Til tross for fremskritt innen onkolytisk virotherapy det finnes gap mellom pre-kliniske og kliniske resultater, noe som tyder på at bedre modeller for å evaluere antitumor effekt av OVS.

Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) er et medlem av Herpesvirus familien, og Alphaherpesviridae underfamilie. BHV-1 tt ig ngater luftveiene hos storfe kompleks i storfe, manifestere i et bredt spekter av symptomer som ligner en dårlig kald 8,9. BHV-1 binder feste- og inngangs reseptorer som brukes av HSV-1, slik som heparansulfat og nectin-1 10. Men binder det CD155 i stedet for nectin-2 10. BHV-1 har et meget snevert vertsområde, slik at det er i stand til effektivt å legge inn og initiere replikasjon i normale og transformerte museceller 3,4,10. Dette gjør bruk av konvensjonelle murine modeller problematisk. Den onkolytisk kapasitet på BHV-1 har blitt vist in vitro 11,12. BHV-1 har blitt vist å initiere replikasjon i og drepe humane tumorceller fra en rekke histologiske opprinnelse, inkludert brystkreft celler og brystkreft initiere celler 11,12. Imidlertid må antitumor kapasitet på BHV-1 bli evaluert in vivo i forbindelse med en immunkompetente vert.

Menneskelig Adenovirus (Ad), somDet er 57 identifisert serotyper, oftest forårsaker respiratorisk sykdom hos mennesker. Onkolytiske Ad vektorer har blitt evaluert for sin antitumor effekt med flere fremmarsj i kliniske studier 13-15. Til tross for lovende pre-kliniske data, har kliniske resultater falt kort av forventningene. Menneskelig svulst xenograft modeller er vanligvis brukes til å studere antitumor effekt av Ad vektorer, selv om de viser svekket immunresponser mot viruset 16,17. Videre syngene murine modeller er umottagelige til Ad infeksjon, noe som gjør evaluering av vertsimmunresponser ved hjelp av disse modellene upraktisk 17,18.

Vertens immunsystemet har blitt identifisert som den mest innflytelsesrike mekanismen som OVS lokke fram tumorcelledød 19. Antitumor respons mellom toleriserte og ikke-toleriserte tumorassosiert antigen (TAA) modellene skiller og kan i stor grad påvirke suksessen av OV terapi. HSV-1 OV KM100 (ICP0 n212VP16 i 1814 20) 20,21 fremkalte tumor regresjon i 80% av tumorbærende mus i en muse Polyoma Middle T antigen jursvulster modell 22. Men i HER-2 / neu-modeller, den antitumor effekt av KM100 variert mellom 20% komplett regresjon i syngene mus og svulst stasis i transgene, HER2-toleriserte mus. Sammen disse dataene markere betydningen av fullt evaluere OVS bruker dyremodeller som best rekapitulere menneskets immun landskapet å fullt ut forstå hvilke funksjoner bestemme terapeutisk suksess.

Bomullen rotte (Sigmodon hispidus), innfødt til Nord-og Sør-Amerika, er mest brukt som en modell av respiratorisk syncytialt virus infeksjon (som anmeldt i 5). Bomullsrotter blir også brukt i anti-BHV-1 vaksinasjon forskning som de rekapitulere patologien forbundet med bovin respiratorisk sykdom kompleks 6,23. Videre BHV-1-infeksjon av bomullsrotterer immunogent, indusere vedvarende slimhinne og systemiske immunresponser 6,23-25. Cellelinjer er avledet fra spontan fibrosarcoma og osteosarkomer av melkekjertlene (LCRT) og bein (CCRT og VCRT), henholdsvis 26. Bomullsrotter har blitt brukt for å evaluere in vivo effekt av onkolytiske Ad vektorer som de er utsatt for Ad-infeksjon og oppviser lignende patologi for mennesker 27-29. Bruken av immunkompromitterte modeller for pre-klinisk evaluering av OVS er ikke bare mindre indikerer kliniske respons på behandling, men som ikke tar hensyn til den rolle i immunsystemet i onkolytisk virotherapy 30,31. Derfor syngenisk og tumor-toleriserte bomullsrottemodeller av brystkreft og osteosarkom er relevante modeller som å evaluere pre-kliniske effekten av OVS, slik som BHV-1 og Ad, som ikke kan studeres ved hjelp av konvensjonelle murine modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: De protokollene som brukes er godkjent av vår institusjonelle Animal forskningsetikk styret ved McMaster University ifølge Canadian Council on Animal Care retningslinjer. Forsøkene ble utført ved McMaster University Central Animal Facility.

1. Dyrking LCRT Cells

  1. Kultur LCRT celler i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Opprettholde celler i T-150 vevskulturflasker ved 37 ° C og 5% CO2. Passasje cellene når de danner en 90% sammenflytende monolag (etter 2-3 dager, figur 1).
  2. Pre-varm 1x fosfatbufret saltvann (PBS), 1x trypsin og medium i et 37 ° C vannbad i 10 min før splitting av cellene.
  3. Aspirer medium fra kolben og skyll celler med 5 ml av 1 x PBS.
  4. Etter skylling, aspirere PBS og inkuberescellene med 2 ml 1x trypsin inntil cellene dissosiere fra kolben (~ 2 min).
  5. Resuspender celler i 8 ml medium (for totalt 10 ml cellesuspensjon) og forsiktig pipettere opp og ned for å bryte opp klumper av celler.
  6. Opprettholde celler i en T-150-kolbe ved såing 1 ml cellesuspensjon i 24 ml medium (for en total av 25 ml per T-150) og bergkolbe forsiktig fra side til side. Vedlikeholde celler ved 37 ° C og 5% CO 2 til neste split.

2. Vurdere Virus Replication og Cytotoksisitet i LCRT Cells

  1. Virus Replication
    MERK: Virus konstruerer uttrykker en fluorescerende tag, for eksempel grønn fluorescerende protein (GFP), under kontroll av endogene viruspromotere lette visualisering av virusinfeksjon og spre med fluoresens plate lesere.
    1. Seed LCRT celler i kultur plater, forlater en brønn for telling. Seed celler slik at de vil være 80-90% konfluent én dag senere. Bruk en konsentrasjon på 10 5 cells / ml (100 ul per brønn) for å frembringe den ønskede konfluens en dag senere i 96-brønners flatbunnede plater.
    2. Den neste dag, pre-varm 1 x PBS, 1x trypsin, komplett og serumfritt medium i et 37 ° C vannbad i 10 minutter før start av eksperimentet.
    3. Aspirer medium fra telle godt og skylle celler med 5 ml av 1 x PBS ved gynge det over overflaten av brønnen.
    4. Etter skylling, aspireres PBS og inkuberes cellene med 2 ml 1x trypsin inntil cellene dissosiere fra kolben (~ 2 min).
    5. Resuspender cellene i det passende volum av komplett medium til å gi en celletetthet innenfor tellbart område ved hjelp av et hemocytometer. For å sikre en nøyaktig legemer, grundig blande cellesuspensjon forut for inokulering av hemocytometer ved å pipettere opp og ned.
    6. Bestemme volumet av virus lager som er nødvendig for infeksjon ved det ønskede multiplisitet av infeksjon (MOI).
      Nødvendig Paque Forming Units (PFU) = antall belagt celler * MOI(PFU / celle)
      Volum av virus lager påkrevd = obligatorisk pfu / virus lager titer (PFU / ml)
    7. Forbered virusinokulum i serumfritt medium i rør. Bland grundig ved virvling eller pipettering før du legger inoculum til cellene.
    8. Infisere celler i 1 time ved 37 ° C, hvoretter anvende en vedlikeholds overlapping av DMEM + 1% FBS.
    9. Skanne plater én og to dager etter infeksjon (pi) for å visualisere GFP fluorescens.
  2. Virus Cytotoksisitet
    MERK: Utfør resazurin Cvtotoksisitetsmålinq under dårlige lysforhold som det sammensatte er lysfølsomt. En brønn inneholdende medium bare bør inkluderes for å korrigere for bakgrunnsfluorescens.
    1. Fremstille en 5% (v / v) løsning av resazurin i 1 x PBS. Bland løsningen ved pipettering.
    2. Aspirer medium fra celler og bruke 5% resazurin løsning. Ta med en brønn som inneholder medium bare å korrigere for bakgrunnen fluorescens.
    3. Inkuber cellene i 30 minutter ved 37 ° C, ettersom leste fluorescens ved hjelp av en fluorescens plateleser (eksitasjon 530 nm, emisjon 595 nm).
    4. Analysere data i forhold til uinfiserte kontroller korrigere for bakgrunnen fluorescens.

3. Bolig og håndtering

  1. Bolig og Kosthold
    1. Huset bomull rotter individuelt for å redusere i-kampene i polykarbonat rottebur inneholder gnager sengetøy (1/8 "maiskolbe sengetøy), et PVC-rør ikke lenger enn 8 inches og nestlets som berikelse (figur 2).
    2. Bruk en securable stål kurv å sitte overtop av buret og inneholde gnager mat og en flaske med vann.
      MERK: Dette buret oppsett vil gi rom for trygg og enkel fangst av dyrene, med plassering av berikelse tube mot slutten av buret er av den største betydning.
  2. Håndtering
    1. Håndtere bomullsrotter i morgen, før runder av dyr anlegget teknikere for å unngå spennende dem føren fremgangsmåte.
    2. Under alle prosedyrer, bruke tykke skinnhansker for beskyttelse.
    3. Ettersom dyrene hovedsakelig forblir i anrikning rør, bruke dem til å overføre rottene inn i et nytt bur under rutinemessig rengjøring. Alternativt åpne buret litt for å tillate føreren å nå sin hånd på, kan dyret da dempes av scruffing huden like over skuldrene og presser ned. Praksis forsiktighet for ikke å bruke for mye kraft som dyret kan bite tungen sin.
    4. Vær tålmodig og bruke en stødig hånd som dyrene har en sterk flight-or-kampen respons og vil prøve å unngå fangst ved å kjøre og hoppe ut av buret. Viktigst, ikke håndtere dyr i halen som degloving vil oppstå.
    5. Felle dyrene i deres anrikninger rør enn direkte håndtering. Dette reduserer drastisk skader og rømmer.

4. Capture og Anestesi

  1. Capture
    1. Bruke tykke skinnhansker til protection under alle prosedyrer.
    2. Bruke en stor klar plastboks med hull for luft, og et lokk, et anestesiinduksjonskammeret stort nok til å passe i beholderen og en neseseksjon montert på gassutløpsslangen (figur 3).
    3. Arbeide i par for å gjøre framgangsmåten mer effektiv, og for å redusere eksponeringstiden for dyrene å isofluran, en innåndings bedøvelse. Sørge for at en forsker er ansvarlig for åpning og utskifting av dekslet stål på buret og lokket av induksjonskammeret (behandleren # 1), og deres tilknyttede er ansvarlig for fangst av dyr i røret og transport til induksjonskammeret (behandleren # 2).
    4. Plasser buret på et flatt underlag og fjern den ytre lokket. Løfte stål mating litt og langsomt manøvrere anrikning øret slik at det er parallelt med sidene av buret og mot baksiden. Om nødvendig, bruk et objekt å manøvrere berikelse rør uten å åpne buret for å unngå risting av dyr (håndtakr # 1).
    5. Hvis dyret blir agitert og forlater røret, gi tilstrekkelig tid for dyret til å slappe av og igjen slå seg ned i røret (behandleren # 1).
    6. Langsomt og bevisst løft kanten av ståldekselet lengst fra anrikning røret, holde den andre enden i kontakt med buret. Lag en plass stor nok for plastbeholder (behandleren # 2).
    7. I en jevn, rask bevegelse, stikkes plastbeholder overtop berikelse tube. Opprettholde kontakt av beholderen med den siden av buret, fangst av dyr i røret. Utfør trinn 4.1.6 og 4.1.7 så raskt som mulig (behandleren # 2).
    8. Fjern stål mating og gi plastbeholderen lokket til behandleren # 2 (behandleren # 1). Skyv plastlokk mellom siden av buret, og beholderen, være oppmerksom på det innfangede dyrets vedheng i prosessen. Ikke steng beholderen da dette vil gjøre det neste trinnet vanskeligere (behandleren # 2).
  2. Anesthesia
    1. Pass på at beholderen forblir lukket og transportere dyret til induksjonskammeret. Raskt plasseres dyret i kammeret, og fjerne beholderen lokket i en flytende bevegelse (behandleren # 2). Åpne og umiddelbart erstatte induksjonskammeret lokk (behandleren # 1).
    2. Slå på strømmen av isofluran til induksjonskammeret (5 l / min) og overvåke dyret for tegn på letargi, og da raskt glir dyret fra røret og beholderen, fjerne både fra induksjonskammeret for å lette gass-sirkulasjon.
    3. Når rotta er fullt bedøvet, flytte den til arbeidsflaten og plasser nese og munn i nesen membran (figur 3). Rotte er fullt bedøvet når det ikke svarer til en kraftig tå klype.
    4. Plassere dyrlege petrolatum oftalmisk salve på dyrets øyne for å hindre tørrhet og skrubbsår. Dette er et viktig skritt som bomull rotter har store øyne som kan være utsatt for smitte hvis skade oppstår.
    5. <li> Nøye overvåke og opprettholde en konstant pusterytme og sørge for at dyret nesen forblir i nesen membran montering gjennom hele prosedyren. Justere strømningshastigheten av isofluran hensiktsmessig. Mengden av isofluran nødvendig å bedøve hvert dyr vil variere.
    6. Post-prosedyre, returnere dyret til buret sitt og sørge for at den får tilbake full mobilitet og sternal recumbency.

5. Utarbeidelse av LCRT Cells for Subkutan svulstdannelse

MERK: En T-150 kolbe LCRT (90% confluency) gir ca 2 x 10 7 celler. Baser antall T-150 kolber som kreves på det totale antall celler som trengs. Seed ekstra kolber for å sikre at det totale antall celler som kreves er oppnådd, og for å få plass til cellene tapt under fremstillingen, og de som er nødvendig for ekstra injeksjoner. Holde cellene på is når det er mulig å forlenge cellenes levedyktighet.

  1. Å høste celler, aspirer medium fra kolbe end skyll celler med 5 ml 1x PBS.
  2. Aspirer PBS og inkuberes cellene med 2 ml 1x trypsin inntil cellene dissosiere fra kolben (~ 2 min).
  3. Resuspender celler i 8 ml medium (for totalt 10 ml cellesuspensjon) og forsiktig pipettere opp og ned for å bryte opp klumper av celler. Fortsette å høste celler fra flere flasker.
  4. Pool alle cellesuspensjoner i en konisk rør, ca 4 T-150s per 50 ml konisk tube.
  5. Sentrifuger røret ved 160 x g i 10 min ved 4 ° C.
  6. Aspirer medium og cellepelleten suspenderes i det passende volum av PBS (10 ml PBS pr T-150) for å gi en celletetthet innenfor tellbart område ved hjelp av et hemocytometer. For å sikre en nøyaktig legemer, grundig blande cellesuspensjon forut for lasting av hemocytometer ved å pipettere opp og ned.
  7. Beregn det totale antall celler:
    Totalt antall celler høstet = legemer (celler / ml) x resuspensjon volum (ml)
  8. Bestemvolumet av cellesuspensjon som kreves for alle injeksjoner. Gjør 2-3 ekstra doser per eksperiment. En total på 5 x 10 5 LCRT celler injisert subkutant vil danne palpable tumorer i løpet av 3-4 dager.
    Totalt antall celler som kreves = 5 x 10 5 celler x totalt antall doseringer
    Volum cellesuspensjon kreves (ml) = (totale celler som kreves * summen av injeksjonsvolumer) / (totale antall celler høstet)
  9. Pipetter det nødvendige volum av cellesuspensjonen i et konisk rør inneholdende PBS og bland grundig. Aliquot individuelle injeksjoner (100 ul) i Eppendorf-rør. Vedlikeholde rørene på is i løpet av injeksjonsprosedyren.

6. Injeksjoner

MERK: Utfør prosedyrer med to forskere, en til å utføre injeksjonene mens de andre skjermer dyrets pusterytme og generell tilstand mens under narkose. Bruke insulinsprøyter (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) for alle injeksjoner og en ny nål tilhvert dyr.

  1. Subkutane injeksjoner
    1. Fange og bedøve dyret (§ 4).
    2. Barbere injeksjonsstedet ved hjelp av Clippers. Bomull rotte pelsen er tykk og krever en skarp trimmer for å få en glatt overflate for injeksjoner. Rengjør injeksjonsstedet med 70% etanol ved hjelp av en bomullspinne og la det fordampe helt før du fortsetter.
    3. Last sprøyter (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) med cellene ved å tegne opp sakte og jevnt. Hvis bobler er tydelig flick sprøyten med litt kraft. Når boblene er på toppen presse stempelet til væsken er på toppen av nålen.
    4. Løft huden på injeksjonsstedet (referert til som hud telting) og sette nålen skråsiden opp. Kontroller at nålen beveger seg fritt under huden for å unngå å injisere intramuskulært.
    5. Drive ut innholdet av sprøyten jevnt og langsomt. Trekk nålen skråsiden ned.
  2. Intratumorale injeksjoner
    1. Ta etd bedøve dyret (§ 4).
    2. Rengjør injeksjonsstedet med 70% etanol ved hjelp av en bomullspinne og la det fordampe helt før du fortsetter.
    3. Last sprøyter (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) med virusinokulum ved å tegne opp sakte og jevnt mens du holder nålen i oppreist stilling. Hvis bobler er tydelig flick sprøyten med litt kraft. Når boblene er øverst trykk deretter stempelet inntil væsken på toppen av nålen.
    4. Sett nålen skråsiden opp i svulsten og drive ut innholdet av sprøyten jevnt og langsomt mens bevege nålen i en viftelignende mønster, delvis kanylen trekkes ut før hver bevegelse for å hindre sårskader av svulsten. Trekk nålen skråsiden ned.
      MERK: Subkutan LCRT svulster er raskt voksende, og nådde ca 100 mm 3 i 5-7 dager. Videre nekrotiske og hemoragisk sentre ofte danner seg på overflaten av tumoren i løpet av flere dager, og krever ca.reful overvåking (figur 4).
  3. Intraperitonale injeksjoner
    1. Fange og bedøve dyret (§ 4).
    2. Rengjør injeksjonsstedet med 70% etanol ved hjelp av bomullspinner og la det fordampe helt før du fortsetter.
    3. Last sprøyter (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) med stoffet ved å tegne opp sakte og jevnt. Hvis bobler er tydelig flick sprøyten med litt kraft. Når boblene er øverst trykk deretter stempelet inntil væsken på toppen av nålen.
    4. Sett nålen inn i høyre nedre kvadrant av abdomen. Trekk tilbake på stempelet for å sikre at blod eller avføring ikke er aspirert, tyder dette på feil plassering av nålen. Hvis dette skjer, ta ut nålen og forberede en ny sprøyte. Når nålen er riktig plassert, drive ut innholdet av sprøyten jevnt og langsomt.

7. Tumor Eksisjon Obduksjon

  1. Samle og rengjøre all verktøy med 70% etanol før avliving av dyret.
  2. Avlive dyret ved den ønskede fremgangsmåte, er CO 2 inhalasjon (2 l / min i 5 til 10 min) anbefales. Undersøke dyret for noe unormalt i kroppens tilstand.
  3. Plasser dyret i ryggleie på en disseksjon bord og rengjøre dyret med 70% etanol.
  4. Bruk pinsett til å løfte huden på nedre del av magen. Skjære gjennom huden og muskelen med saks og lage en medial snitt kjører lengden på dyret (anus til hake).
  5. Skjær brystkassen ved å gjøre to kutt, en sideveis opp på siden av brystkasse og en over sternum å avsløre hjertet og lungene. Undersøke lungelappen for eventuelle metastaser 27,29.
  6. Undersøke alle organer for misdannelser og registrere eventuelle endringer i farge, størrelse og konsistens. Hvis det er nødvendig, innsnittet organer med en skalpell for å undersøke indre vev. Spesifikt undersøke lever, nyrer, milt og mage-tarm.
  7. Inspisere lymfeknutene for metastaser og utvidelse 27,29.
  8. For å samle tumoren, blir flanke innsnitt over og under tumoren, slik at huden kan bli trukket bort fra kroppen med en pinsett. Mens fast holder huden med pinsett, bruk en skalpell å forsiktig fjerne svulsten ved å kutte mellom svulsten og dermis (figur 5).
  9. Umiddelbart plassere tumor i en merket beholder av 10% nøytral bufret formalin.
  10. Avhengig av størrelsen av tumoren, tillater 1-2 dager (≤ 2 mm, liten) eller 5-6 dager (> 2 mm, stor) for fiksering før fremstilling av seksjoner for histologisk analyse (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På grunn av den ekstremt hissige natur bomull rotter, blir kjent med og utnytte prosedyrer optimalisert for å redusere stress av dyrene vil lette i sin bruk som en pre-klinisk dyremodell. Bruk av riktig håndtering teknikker vil også minimere risiko for forskeren.

Når du bruker bomulls rotter er det viktig å holde seg rolig. Rottene er svært opphisset og vil forsøke å unnslippe sitt bur. Bruk av en berikelse rør og nestlets vil redusere rømningsforsøk. Figur 2 viser optimal bur oppsett for å hjelpe til fangst av bomullsrotter, herunder plassering av berikelse tube. Videre jobber i et lite rom hvis det er mulig å hjelpe til gjenfangst. Hvis flukt skjer, venter for dyret å roe ned og holde seg i ro, og deretter dekke det med den klare fange container eller dekk til med hansker, være forsiktig med å bruke for mye kraft.

I motsetning til en mus, har bomullsrotte en langstrakt snute which krever en annen nese passende å levere anestesigass. Figur 3 viser en nese kjegle konstruert for å passe nøyaktig en bomulls rotte og maksimere levering av isofluran. Ved hjelp av en gummimembran som et passende kan resultere i skade på nesen til rotten.

Hvis mulig få Forkast dyr (de som ikke er nødvendig av andre forskere, bomull rotter eller på annen måte) til å praktisere injeksjonsteknikk før du prøver dem på rottene. Dette vil gi forskeren å få kjennskap til nåler og hvordan du trygt håndtere dem. Insulinsprøyter er foreslått for injeksjoner i bomullsrotter som deres hud er tykk og tøff i forhold til en mus. Imidlertid kan et større nål (21 g x 1 ') bli anvendt for injeksjon av tumorceller for å unngå tap av celle-levedyktighet på grunn av celleskjær under injeksjon. Sikkerhetsregler bør følges, slik som ikke recapping nåler og riktig avhending inn i en beholder for skarpe gjenstander.

Den injecsjon av levedyktige tumorceller er viktig for riktig tumordannelse. Figur 1A viser en sunn monolag av LCRT celler som kan fremstilles for injeksjon i bomullsrotter. Til sammenligning Figur 1B viser LCRT celler som har lav levedyktighet og skal ikke benyttes til injeksjon. Det er viktig å kontrollere tumorcellelevedyktigheten ved anvendelse av en metode slik som Trypan blå flekker ved å telle celler for injeksjoner.

Svulstene dannet fra LCRT celler er raskt voksende og nekrotiske sentre ofte danner (Figur 4A). Som sådan bør tumordannelse overvåkes nøye for å unngå sårdannelse (Figur 4B). Hvis sårdannelse oppstår dyret skal bli ofret for å unngå smitte og mulig død av sepsis.

Effektene av anti-tumor behandlinger er ofte best undersøkt ved histologisk analyse. Dette krever fjerning av svulsten post mortem. Opprettholde svulstvev integritet vil result i en prøve som er en mer nøyaktig representasjon av tumor in vivo. Figur 5 viser en eksisjon teknikk der tumoren blir forsiktig separert fra omgivende vev ved hjelp av en skalpell og pinsetter. Fjerne svulsten ved å trekke den med makt fra omkringliggende vev ved hjelp av pinsett kan sprekke svulsten eller forstyrre svulstvev integritet, påvirker riktig histologisk analyse. Den tette og sterkt vaskularisert struktur av tumoren, som vist i figur 6, blir opprettholdt ved denne utskjæring teknikk. Dette er viktig i analysen av behandlinger som påvirker tumorvaskulatur, slik tilfellet er med mange OVS.

Figur 1
Figur 1:. Bright-felt mikroskopi bilde av LCRT Cells (A) Fenotype av sunn (~ 90% levedyktige) LCRT celler klare for forberedelse til injeksjon i bomullsrotter. (B) Uønsket fenotype av LCRT celler ikke passer for injeksjon. Avrundede celler er døde eller døende (indikert ved en pil). Bilder ble tatt til fange ved 10X forstørrelse; skala bar = 1 mm.

Figur 2
Figur 2: Eksempel på buret oppsett for å lette oppfanging av bomullsrotter Optimal plassering av anrikning røret mot enden av buret og inkludering av nestlets hjelpemidler i dyre fangst..

Figur 3
Figur 3:. Anesthesia nesekonus montering for levering av isofluran til bedøvet bomullsrotter Produsert nesen membran passer langstrakt snute av bomull rotte for å sikre nøyaktig levering av isofluran gass uten traume til nese.

"Figur Fig. 4: nekrotisk vev på en subkutan tumor LCRT (A) Tidlige stadier av nekrose i tumorvevet. Dyret bør overvåkes nøye for å unngå progresjon til (B) helt åpent sår. Dyret bør ofres dersom tumor ulcerates som infeksjon og sepsis kan resultatet.

Figur 5
Fig. 5: excision av en subkutan tumor LCRT for histologi Subkutan tumor på flanken av en bomullsrotte blir forsiktig fjernet fra huden ved hjelp av en skalpell til å opprettholde integriteten tumorvev, og dermed gi en bedre representasjon av tumor arkitektur for histologisk analyse.

Figur 6 Figur 6:. Histologisk vev delen fra en subkutan LCRT svulst Morfologi av LCRT svulstvev undersøkt ved hjelp parafininnstøpte seksjoner farget med hematoxylin og eosin (H & E). Bildet er tatt på 20X forstørrelse; skala bar = 1 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7, (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254, (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78, (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63, (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11, (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8, (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26, (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66, (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20, (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88, (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14, (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62, (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12, (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110, (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30, (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74, (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76, (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12, (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78, (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17, (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222, (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13, (1), 123 (2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16, (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369, (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22, (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19, (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).
Håndtering av Cotton Rat i studier for de prekliniske Evaluering av Onkolytiske virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter