ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
El uso de este protocolo, hemos sido capaces de imagen de 160 micras de espesor secciones de cerebro de ratones infectados con el parásito Toxoplasma gondii, que permite la visualización y el análisis de la relación espacial entre el parásito enquistamiento y la neurona infectada.
Abstract
Toxoplasma gondii es un parásito intracelular obligado con una amplia gama de huéspedes, incluidos los seres humanos y roedores. En los seres humanos y roedores, Toxoplasma establece una infección persistente de por vida en el cerebro. Mientras que esta infección cerebral es asintomática en la mayoría de las personas inmunocompetentes, en el desarrollo del feto o personas inmunodeprimidas, como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) pacientes, esta predilección por y persistencia en el cerebro puede conducir a la enfermedad neurológica devastadora. Por lo tanto, es evidente que la interacción de cerebros Toxoplasma es crítico para la enfermedad sintomática producida por Toxoplasma, sin embargo, tienen poco entendimiento de la interacción celular o molecular entre células del sistema nervioso central (CNS) y el parásito. En el modelo de ratón de la toxoplasmosis del SNC se ha conocido por más de 30 años que las neuronas son las células en las que el parásito persiste, pero hay poca información disponible sobre la queparte de la neurona es generalmente infecta (soma, dendritas, axón) y si esta relación celular cambia entre cepas. En parte, esta falta es secundaria a la dificultad de formación de imágenes y la visualización de las neuronas infectadas enteras de un animal. Estas imágenes se suelen requerir seccionamiento en serie y costuras de tejido fotografiado por microscopía electrónica o microscopía confocal después de inmunotinción. Mediante la combinación de varias técnicas, el método descrito aquí permite el uso de secciones gruesas (160 micras) para identificar y células de imagen completa que contienen quistes, lo que permite la visualización y el análisis de las neuronas individuales, crónicamente infectadas en tres dimensiones sin la necesidad de inmunotinción, microscopía electrónica o seccionamiento y la costura serie. Usando esta técnica, podemos comenzar a entender la relación celular entre el parásito y la neurona infectada.
Introduction
El objetivo general de este método es la obtención de alta resolución, las imágenes tridimensionales de las neuronas individuales que están infectadas por el parásito intracelular obligado Toxoplasma gondii.
Toxoplasma se considera a menudo uno de los parásitos más exitosos debido a su gran rango de huésped intermediario, que incluye seres humanos y roedores. En los seres humanos y roedores, después de la infección aguda por ingestión de alimentos o agua contaminados, Toxoplasma es capaz de provocar una infección persistente del SNC mediante la conversión de su forma de replicación rápida (taquizoíto) a su lenta replicante y encysting forma (la bradyzoite ). En individuos inmunocompetentes, se cree que esta infección latente CNS a ser relativamente asintomática, pero en individuos inmunocomprometidos, como los pacientes con SIDA o receptores de trasplantes, el recrudecimiento del parásito puede provocar encefalitis por toxoplasma 1,2 fatal. Además, estudios recientes hahan demostrado que la infección latente por Toxoplasma puede conducir a cambios de comportamiento en roedores 3,4, aunque el mecanismo sigue siendo desconocido.
Sorprendentemente, a pesar de estos datos destacan la importancia de la interacción CNS Toxoplasma, se sabe relativamente poco acerca de esta relación, sobre todo a nivel celular y molecular. La capacidad para estudiar los aspectos más simples de la interacción parásito-cerebro se ha visto obstaculizada en parte por las limitaciones tecnológicas. Por ejemplo, la mayoría del trabajo que demuestra que las neuronas son las células en las que los quistes persisten se ha hecho con la microscopía electrónica (EM) 5,6. Aunque EM da alta resolución, es mucho tiempo, mano de obra intensiva, y caro. Ensayos de inmunofluorescencia (IF) han sido recientemente utilizado en conjunción con la microscopía confocal para confirmar el trabajo realizado por EM 7. Si los análisis son técnicamente fácil de realizar y relativamente barato, pero el uso de estas técnicas para understand la relación espacial entre el quiste y la neurona infectado requiere la reconstrucción de serie, que es mucho tiempo, técnicamente difícil, y puede conducir a la pérdida de información valiosa. Por lo tanto, hemos desarrollado un método que se puede utilizar con el modelo de ratón de la toxoplasmosis CNS y nos permite la imagen de la totalidad de las neuronas infectadas sin EM o inmunohistoquímica (IHC). Mediante el desarrollo de esta técnica, podemos empezar a explorar la relación entre el celular de la célula infectada y el quiste de una manera relativamente rápida y económica.
El método que hemos desarrollado combina nuevas técnicas para la compensación óptica y de imagen secciones de cerebro de espesor por microscopía confocal 8 con un sistema que marca en las células in vivo que han sido inyectados con proteínas del parásito 9,10. En este sistema, se infectan ratones Cre-reportero que expresan una proteína fluorescente verde (GFP) sólo después de la recombinación Cre-11 mediada con Toxoplasma 9. Esta combinación nos permite cosechar el cerebro de ratón infectado después de establecida la infección del SNC, cortar secciones de cerebro de espesor, y rápidamente identificar las áreas pertinentes a la imagen mediante la búsqueda de la RFP + quistes. Es importante tener en cuenta que a medida que la expresión célula hospedadora de la GFP depende únicamente de la inyección de Cre por parásitos, y no en la infección, un número de las células GFP + no contienen parásitos 10. Como el objetivo de este protocolo es capaz de neuronas infectadas imagen enteros, la atención se centra sólo en las buenas prácticas agrarias + neuronas que contienen también un RFP + quiste, pero el protocolo también se puede usar para la imagen de la GFP + / RFP - neuronas.
Una vez que el cerebro infectado se cosecha y se seccionó, las secciones se convierten transparente por compensación de glicerol. Regiones apropiadas de secciones se avistaron con microscopía confocal, almugido visualización sin precedentes de las células huésped infectadas y los parásitos enquistados en su totalidad. Aquí le ofrecemos un completo protocolo para la identificación, la compensación óptica y, a las neuronas de imágenes infectado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Los ratones fueron criados y mantenidos en un ambiente controlado de temperatura y humedad con 12 hr invertido ciclos de luz / oscuridad con alimento y agua ad libitum en la Universidad de Arizona. Los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices y aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arizona. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Los ratones Cre-reportero están en un C57BL / 6 de fondo 11 y están disponibles comercialmente.
1. Ratón Infección
NOTA: El método de infección de ratón con Toxoplasma gondii se describe a continuación ha sido utilizado en los estudios previamente publicados 10 - 12.
- Cultivar las cepas de Toxoplasma en fibroblastos de prepucio humano (HFFS) cultivadas en alta glucosa de Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml streptomycin, y 2 mM L-glutamina (cDMEM) en un matraz T-25 dentro de una incubadora de CO2 al 5% hasta que los parásitos han formado grandes vacuolas parasitóforas.
- Parásitos de liberación jeringa raspando las células de la parte inferior del matraz y pasar la solución resultante a través de una aguja de calibre 25 conectada a una jeringa de 3 ml 2 veces interior del matraz a continuación, transferir toda la solución a un caso de la jeringa de 5 ml conectada a una aguja de calibre 27 que se ha colocado boca abajo dentro de un tubo cónico de 15 ml. Conecte el émbolo a la jeringa y pasar la solución del parásito en el tubo cónico.
- Centrifugar el tubo durante 10 min a 300 x g. Aspirar el sobrenadante a continuación, resuspender el precipitado en 4-6 grado USP ml estéril 1x tampón fosfato salino (PBS) pH 7,4 (Solución Stock).
- Cargar un hemocitómetro con 10 l de solución madre, esperar 5-10 minutos para que los parásitos se depositan entonces cuentan el número de parásitos en las cuatro esquinas y el centro de la gran plaza central.
- Diluir párrsitios a tamaño del inóculo apropiado de 100K / 200 l 1x PBS luego se inyectan ratones por vía intraperitoneal (ip) con un volumen total de 200 l.
NOTA: Para este procedimiento, los ratones fueron inoculados con 100K Tipo III (CEP) 13 taquizoítos en 200 l 1x PBS. Al infectar ratones con otras cepas de Toxoplasma, puede ser necesario ajustar para tener en cuenta el nivel de virulencia concentración de inóculo.
2. Perfusión Cerebral y Cosecha
NOTA: Este protocolo se realizó a 21 días después de la infección (dpi), ya que esto representa el punto de tiempo en el que los números máximos de los quistes se encuentran en el cerebro de ratón, pero otros puntos de tiempo puede ser utilizado. Tamaño, el número, la ubicación, y la presencia o ausencia de quistes depende de muchos factores, incluyendo la cepa de ratón, parásito cepa de tipo, así como el tamaño del inóculo 7,14 - 17. Los investigadores deberán determinar individualmente el inóculo adecuado para el ratón y Toxoplascepa ma él / ella utiliza.
- Configuración de todas las herramientas de cosecha quirúrgicos (Figura 1).
- Para cada ratón, preparar y mantener en hielo: jeringa de 20 ml lleno con 0,9% de cloruro de sodio (NaCl) + 10 U / ml de heparina en 1x grado USP estéril PBS (heparina / solución salina); 20 ml jeringa llena con 4% de paraformaldehído (PFA); Vial de centelleo con 15 ml de PFA al 4%. Para múltiples ratones, preparar un vaso lleno de toda la cantidad de cada solución necesaria para todos los ratones luego elaborar una jeringa fresca llena de solución para cada perfusión.
- Anestesiar al ratón ip con 200 l / 25 g de peso corporal de ketamina cóctel / xilazina (24 mg / ml y 4,8 mg / ml, respectivamente) en el día de su interés. Monitorear el ratón para el nivel de anestesia comprobando reflejo pizca dedo del pie. Continúe con el protocolo sólo una vez que el ratón no muestra respuesta a una pizca dedo del pie firme.
NOTA: Otros métodos de anestesia se puede utilizar siempre y cuando se alcanza el nivel apropiado de anestesia antesde proceder con el protocolo. - Coloque el ratón en la posición supina sobre la plataforma de espuma cubierto. Pin las cuatro extremidades a cabo en los pies y luego rociar el pecho y el abdomen con un 70% de etanol (EtOH) (Figura 2). La adición de varias toallas de papel estéril bajo el ratón puede ser utilizado para ayudar a absorber el desbordamiento de los fluidos de perfusión.
- Levante la piel justo debajo del esternón con pinzas a continuación, utilizar tijeras para hacer una incisión. Tire de la piel para exponer el pecho (Figura 2B).
- Levante xifoides proceso y hacer una incisión abdominal justo debajo del diafragma, exponiendo el hígado que se disección roma de distancia desde el diafragma. Hacer dos incisiones, una a la izquierda y de la derecha a través del diafragma y la parte inferior de las costillas. Extender las incisiones izquierda y derecha aproximadamente 1 / 2-2 / 3 manera encima de la caja torácica, que se refleja a continuación, volver a abrir la cavidad torácica (Figura 2C).
NOTA: Tenga cuidado de no cortar cualquier órgano o los vasos sanguíneos principales dusonar este procedimiento ya que al hacerlo se comprometer la calidad de la perfusión. - Perfundir transcardially con 10-20 ml de heparina / solución salina seguido de 10-20 ml 4% PFA.
NOTA: Si la perfusión se realiza correctamente, el hígado cambia de rojo a bronceado (Figura 2D). Si no se hace correctamente, los vasos sanguíneos serán visibles (Figura 2E). - Ponga el ratón sobre su abdomen, pies re-pin luego rociar la cabeza y el cuello con EtOH al 70%. Levantar la piel de la base del cuello y hacer una incisión. Quite la piel para exponer el cráneo (Figura 2F). Decapitar a la cabeza al nivel de los hombros. Retire el cráneo, retire con cuidado el cerebro, y colocarlo en un vial de centelleo lleno de PFA al 4% (Figura 2G-H).
NOTA: Si bien perfundido, aparecerá blanca sin vasos sanguíneos visibles (Figura 2I) del cerebro. Si el cerebro no está bien perfundido, los vasos sanguíneos serán visibles (Figura 2J). - Coloque el scintillación vial con el cerebro en el 4% PFA a 4 ° C durante la noche, cubierto de la luz. Enjuague el cerebro en USP no de grado 1 × PBS y traslado a un nuevo vial de centelleo lleno de frío 1x PBS. Guarde el cerebro en 1x PBS a 4 ° C, protegido de la luz.
NOTA: claro éxito y la imagen se ha logrado con secciones almacenados en 1x PBS hasta por un mes, pero lo mejor es la sección es el cerebro en pocos días como el almacenamiento prolongado en PBS invertirá la fijación PFA y podría conducir a menos de imágenes óptimas . Autofluorescencia y el aumento de la falta de definición se han observado en algunas secciones fotografiados después de un almacenamiento en 1X PBS durante un mes o más.
3. Cerebro Seccionado
- Retire el cerebro desde 1x PBS y colocarlo en una matriz de cerebro (Figura 3) para permitir más precisa e incluso cortes a través del cerebro. Se quita los bulbos olfatorios cerebelo y, si está presente, y luego se corta el cerebro coronal en 2 o 3 secciones.
- Pegue cada sección del cerebro en un bloque de montaje espécimen con cianoacrilato. Colocar un pequeño bloque de 5% de gel de agarosa detrás de la sección del cerebro de apoyo (Figura 3B).
NOTA: Otros mecanismos de apoyo pueden ser utilizados, pero sin el apoyo, la Vibratome pueden hacer presión en el cerebro que causa seccionamiento desigual. - Cortar tejido en 160 m (distancia de trabajo del objetivo utilizado para formación de imágenes) secciones gruesas con el Vibratome ajusta a una velocidad de 4 y la amplitud de 9.
NOTA: Los ajustes para la velocidad y la amplitud pueden ajustarse dependiendo de la máquina particular que se usa con el fin de obtener incluso, las secciones lisas. Si los valores sonno es correcto, el resultado puede ser secciones desiguales, desgarro de marcas de tejidos o charla. - Recoger las secciones de tejido en un vial de centelleo lleno de frescos, refrigerados 1x PBS si van a ser limpiado en una semana. Si las secciones no van a ser limpiado en una semana, lugar secciones en 1,5 ml tubos de microcentrífuga llenas de solución crioconservante y almacenar a -20 ° C.
4. Compensación óptica de secciones de tejido cerebral
NOTA: Este protocolo ha sido modificado a partir de un método publicado previamente 8.
- Preparar 25%, 50%, 75% y 90% de glicerol vol / vol en 1X PBS + 2% de Tween-20 (Gl / PBST).
- Retire secciones de 1x PBS o, si en crioconservante, enjuague en PBS 1x y transferir a un vial de centelleo que contiene 10 ml de 25% Gl / PBST. Colocar el vial en un agitador a 4 ° C, cubierta de la exposición a la luz, durante 12 h.
- Confirme que todas las secciones se han hundido a la bottom del vial. Aspirar el 25% Gl / PBST, dejando sólo lo suficiente para cubrir las secciones a continuación, llenar el frasco con 10 ml de 50% Gl / PBST y se deposita en un agitador a 4 ° C, cubierto por la exposición a la luz, durante 12 horas. Repita este proceso para el 75% Gl / PBST entonces el 90% Gl / PBST. Deja secciones en el 90% Gl / PBST durante 24 horas para llegar a la compensación máxima. En el transcurso del proceso de compensación, observar compensación óptica gradual (Figura 4).
NOTA: Este proceso puede acelerarse si las soluciones se cambian inmediatamente después de las secciones han hundido en el fondo del vial. En el 75% y 90% de soluciones, las secciones no se hundirán todo el camino hasta la parte inferior del vial, pero flotan en el medio.
5. Montaje de secciones de tejido cerebral
- Corte un No. 1.5 cubreobjetos en 5 piezas para crear un espaciador. Use un lápiz regla y con punta de diamante para anotar y romper el cubreobjetos lo largo de las líneas de trazo discontinuo en la figura 5A. Descartar tque centrar pieza, organizar las 4 piezas exteriores en un portaobjetos de vidrio claro para crear una ventana, y luego cepille esmalte transparente en las costuras para adherir las piezas del separador a la diapositiva en la configuración correcta (Figura 5B).
NOTA: El separador se utiliza para crear el espacio necesario entre la corredera y el cubreobjetos para el montaje de las secciones despejadas. El cubreobjetos se puede cortar en diferentes formas de crear cualquier tamaño de ventana necesario. Espaciadores de espuma precortadas también están disponibles comercialmente. Para permitir que el esmalte de uñas se seque por completo, lo mejor es hacer diapositivas con espaciadores al menos un día antes de las secciones de montaje. - Secciones de traslado a una diapositiva utilizando una pipeta de plástico con la punta cortada. Asegúrese de llenar en los alrededores con un 90% Gl / PBST. Baje cuidadosamente un cubreobjetos sobre las secciones, asegurándose de no introducir burbujas. El exceso de Gl / PBST puede ser malo lejos con un sin pelusas limpie.
- GFP Imagen + neuronas que contienen RFP +
NOTA: Como alternativa, el sello se desliza completamente alrededor de todos los bordes para almacenar y fotografiados en un momento posterior. El uso de esmalte de uñas transparente para sellar diapositiva es opcional y es posible que sea más difícil de quitar cubreobjetos si uno fuera a eliminar secciones de la diapositiva en una fecha posterior para su posterior procesamiento.
6. Imaging
NOTA: Cualquier microscopio puede ser usado que tiene la capacidad de obtener de alta resolución z-pilas.
- Después de encontrar inicialmente el plano focal en 10 veces, cambiar a un objetivo de 20X y escanear a través de la sección para identificar un quiste localizado en el interior de un GFP + células. Centre la región de interés (ROI) en el campo de visión.
- Cambie a un objetivo de 40X. Enfoque arriba y hacia abajo a través de toda la ROI para asegurarse de que toda la célula y Cyst son visibles.
NOTA: Las imágenes se obtuvieron usando un microscopio confocal con un objetivo de 40X / 1.30 Petróleo DIC M27. - Utilizando el software de imágenes instalado, obtener una pila z que incluye toda la celda con un quiste. Promedio de ajustes utilizados para obtener las imágenes se muestran en la Figura 6.
NOTA: Los ajustes pueden necesitar ser ajustado en función de cada una las secciones de tejido investigadores y capacidades de microscopio. - Obtener una imagen de máxima proyección de la z-stack estableciendo el número de proyecciones a 1. Obtenga una vista rotación completa estableciendo el número de proyecciones a 64.
NOTA: Otros paquetes de software están disponibles y pueden ser usados para obtener la máxima proyección, de rotación, así como otros puntos de vista de imágenes z-pila. - Analizar imagen con el software de análisis de imágenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 7 incluye imágenes representativas de dos GFP + neuronas a partir de dos secciones diferentes 160 m de espesor, así como una medición representativa de la distancia desde quiste a célula-cuerpo para la Figura 7B. Cifras que contiene quiste-7 A y B ilustran que este nuevo protocolo permite la visualización de la neurona infectada en su totalidad. La Figura 7C muestra que con esta técnica de imagen, ahora es posible cuantificar la distancia entre el quiste y el cuerpo de la célula (Imaris 7.7). Figura 7D es una vista de rotación completa de la figura 7B. La visualización de la pila Z de esta manera permite la verificación de la captura completa de la célula y quiste. Figura 7E es una película de rotación 3D que muestra cómo la imagen de 7D se puede analizar mediante software Imaris 7.7 para medir la distancia desde el quiste para el cuerpo de la célula, ya sea de medio a medianos or de borde a borde. Aunque la medición se muestra se hizo usando una línea recta entre el quiste y el cuerpo celular, una medición después de la GFP + real proceso para el cuerpo celular pueden también ser generados (datos no mostrados).
Figura 1: Equipo quirúrgico para la eliminación de cerebro de ratón. (A) de la almohadilla absorbente. (B) del bloque de espuma. (C) Las agujas de precisar pies. (D) 25 G Conjunto de la colección de sangre. (E) 3 vías llave de paso. (F) jeringa de 20 ml de heparina / solución salina. ( G) jeringa de 20 ml de PFA al 4%. (H) fórceps pulgar. (I) Bellas tijeras, angulado a lado, sostenido agudo. (J) tijeras afiladas agudo. (hemostáticos K) Kelly. (L) tijeras Mayo. (M) (N) de centelleo de 4% PFA. Barra de escala = 8 cm.
Figura 2: La recolección de cerebro de ratón. (A) del ratón inmovilizado y el pecho rocía con EtOH al 70%. (B) en el pecho expuesto. Cavidad (C) en el pecho abierto. (D) del hígado después de la perfusión adecuada. (E) del hígado después de la perfusión inadecuada. (F) el cráneo expuesto. ( G) cerebral con medio cráneo eliminado. (H) cerebro Cosechado en frasco lleno de PFA al 4%. (I) después de la perfusión cerebral adecuada. (J) del cerebro después de la perfusión inadecuada.
Figura 3: Seccionamiento cerebro del ratón. Matri cerebro (A) del ratón x. (B) del cerebro del ratón y gel de agarosa fijadas al bloque de montaje con cianoacrilato dentro de la cámara Vibratome lleno de frío 1x PBS.
Figura 4: Proceso de Eliminación de Imágenes representativas de una sección del cerebro del ratón durante cada paso del proceso de compensación..
Figura 5: Cortar y fijar espaciador para deslizarse. A. Nº 1.5 cubreobjetos con marcas representativas para el corte de cubreobjetos en 5 pedazos. B. Portaobjetos de vidrio plano con cada pieza de corte cubreobjetos clavado en su lugar con esmalte transparente para crear una ventana.
2237 / 52237fig6highres.jpg "/>
Figura 6: Captura de pantalla de parámetros generales utilizados para la adquisición de imágenes.
Figura 7:. Quistes de Toxoplasma gondii pueden residir dentro de los procesos neuronales distantes (AB) imágenes de proyección máximo de GFP + neuronas que contienen RFP + quistes (flechas blancas). Barra de escala = 20 m. (CE) proporcionar una visualización adicional y análisis de la relación quiste-neurona se muestra en B. (C) medición de la línea directa generado por el Imaris de la distancia desde el borde del quiste hasta el borde del cuerpo celular (149μm ). (D) 3-D película de giro . (generada Imaris-E)www.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Figura 7E.avi "target =" _ blank "> película en 3-D que presentan medición quiste a célula del cuerpo tanto de media-media (163 micras) y de borde a borde (149 micras).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dado que los cambios celulares en las células huésped infectadas han sido vinculados a resultados de la enfermedad en infecciones con otros organismos intracelulares tales como el VIH, la rabia, y Chlamydia 18,19, hemos desarrollado una técnica que nos permitirá estudiar las interacciones íntimas que se producen entre el SNC sede de célula y Toxoplasma. El método aquí descrito logra este objetivo al permitir imágenes eficiente de las neuronas infectadas crónicamente. Antes del desarrollo de este método, tales imágenes era mucho tiempo, costoso, o no es posible.
Ahora podemos utilizar esta técnica para responder a las preguntas básicas sobre la interacción del Toxoplasma -neuron, como son las áreas neuronales específicas dirigidas por el parásito? En qué se diferencia esta entre las cepas de Toxoplasma? ¿Las áreas celulares en los cuales el quiste reside diferir del resto de la célula (es decir, qué infectadas y no infectadas dendritas de la neurona mismo tener el mismo número de espinas)? ¿Cuáles son las características celulares compartidas por neuronas infectadas? La capacidad de responder a estas preguntas es esencial para la comprensión de cómo la infección por Toxoplasma cambia el SNC, incluso a nivel de comportamiento.
Para obtener las mejores imágenes posibles, es muy importante asegurarse de que el tejido se corta en secciones iguales. Si las secciones son desiguales, el cubreobjetos no sentarse correctamente en la sección que lleva a contacto desigual con el objetivo que resulta en formación de imágenes sub-óptima. Durante la optimización de este protocolo, se hicieron varias modificaciones. El proceso de compensación original fue hecho con fructosa en un intento de reproducir los resultados que se muestran en una técnica conocida como SeeDB 20. Este método era incompatible con este modelo, ya que apaga la RFP (específicamente mCherry). Otro paso clave y probablemente el más importante de todos está permitiendo para la compensación máxima de las secciones de tejido. Si no despachado correctamente, la luz de fondo de difracción será mayor yuna imagen con una ruidosa. Hemos encontrado que la adición de Tween-20 al glicerol dio una imagen ligeramente más claro que el glicerol solo. La tecnología actual nos permite obtener imágenes z-stack a través de secciones de tejido cerebral 160μm de grosor pero en el futuro, estamos mirando para aumentar este espesor de 500 micras o más para permitir aún más en un análisis en profundidad.
Es sólo por mirar a toda la célula y sus conexiones que podemos empezar a desarrollar una idea mecanicista de cómo el cerebro es globalmente afectada por Toxoplasma. Este nuevo protocolo ofrece la oportunidad de estudiar la interacción del Toxoplasma -neuron a nivel de células individuales y hacerlo de una manera rápida y económica. Aún tenemos que explorar todos los posibles usos para este protocolo y cómo podemos traducir a otros sistemas, pero anticipamos que tendrá múltiples aplicaciones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a todo el laboratorio Koshy útil para los debates. Damos las gracias a Patty Jansma y la Universidad de Arizona Departamento de Neurociencia de consejos y ayuda con las imágenes. También agradecemos el laboratorio Porreca para el uso de su Vibratome. Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH NS065116, AAK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-Cl | |
| 200 mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25 cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20 ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10 ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible - used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
References
- Luft, B., Remington, J.
- Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
- Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8 (9), 75246 (2013).
- Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).
- Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).
- Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. , (2010).
- Selever, J., Kong, J. -Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
- Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).
- Koshy, A. a, Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8 (7), (2012).
- Madisen, L., Zwingman, T. a, et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Caffaro, C. E., Koshy, A. s, Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9 (5), (2013).
- Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).
- Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 Forthcoming.
- Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).
- Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6 (12), 28925 (2011).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).
- De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al.
- Scott, C. a, Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
Tags
Neurobiología Número 94 Neurociencia la microscopía confocal ratón Cerebro Compensación las proteínas fluorescentes,Erratum
Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 09/01/2015.
Citeable Link.
A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy
