Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التصوير 3-D وتحليل الخلايا العصبية المصابة Published: December 9, 2014 doi: 10.3791/52237
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Bio5 Institute, University of Arizona, 2Department of Neurology, University of Arizona, 3Department of Immunobiology, University of Arizona

ERRATUM NOTICE

Summary

باستخدام هذا البروتوكول، كنا قادرين على الصورة 160 ميكرون أقسام الدماغ سميكة من الفئران المصابة بالطفيلي التوكسوبلازما، والتي تمكن التصور وتحليل العلاقة المكانية بين الطفيلي encysting والخلايا العصبية المصابة.

Abstract

التوكسوبلازما هو إلزام، الطفيليات داخل الخلايا مع مجموعة المضيف واسع، بما في ذلك البشر والقوارض. في كل من البشر والقوارض، التوكسوبلازما يضع العدوى المستمرة مدى الحياة في الدماغ. بينما الإصابة في الدماغ وهذا هو دون أعراض في معظم الناس مناعيا، في وضع الجنين أو الأفراد المناعة مثل متلازمة نقص المناعة (الإيدز) من المرضى، وهذا ميل للوالمثابرة في الدماغ يمكن أن يؤدي إلى مرض عصبي مدمر. وبالتالي، فمن الواضح أن التفاعل التوكسوبلازما brain- أمر حاسم لهذا المرض أعراض التي تنتجها التوكسوبلازما، ولكن لدينا القليل من الفهم والتفاعل الخلوي أو الجزيئية بين خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS) والطفيليات. في نموذج الفأر من الجهاز العصبي المركزي داء المقوسات وقد كان من المعروف لأكثر من 30 عاما أن الخلايا العصبية هي الخلايا التي استمرت الطفيلي، ولكن القليل من المعلومات متاح حول أيجزء من الخلايا العصبية مصاب عموما (سوما، التغصنات، محور عصبي)، وإذا هذه العلاقة الخلوية يتغير بين السلالات. في جزء منه، هذا النقص هو الثانوي لصعوبة التصوير وتصور الخلايا العصبية المصابة كلها من حيوان. ان مثل هذه الصور عادة ما تتطلب باجتزاء المسلسل وخياطة من الأنسجة تصويرها بواسطة المجهر الإلكتروني أو المجهري متحد البؤر بعد المناعية. من خلال الجمع بين عدة تقنيات، الطريقة الموصوفة هنا يمكن استخدام أبواب سميكة (160 ميكرون) لتحديد والصورة كاملة الخلايا التي تحتوي على الخراجات، والسماح التصور والتحليل من الفردية، والخلايا العصبية المصابة بشكل مزمن ثلاثي الأبعاد دون الحاجة لالمناعية، المجهر الإلكتروني ، أو باجتزاء المسلسل وخياطة. باستخدام هذه التقنية، يمكننا أن نبدأ في فهم العلاقة بين الطفيل الخلوية والخلايا العصبية المصابة.

Introduction

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على ارتفاع القرار، وصور ثلاثية الأبعاد من الخلايا العصبية الفردية التي تقوم إصابة بطفيل التوكسوبلازما داخل الخلايا إلزام.

غالبا ما تعتبر التوكسوبلازما واحدة من الطفيليات الأكثر نجاحا بسبب مجموعة مضيفه كبير وسيطة، والتي تشمل البشر والقوارض. في كل من البشر والقوارض، بعد العدوى الحادة من خلال تناول طعام أو ماء ملوث، التوكسوبلازما غير قادرة على التسبب في العدوى المستمرة للجهاز العصبي المركزي عن طريق تحويل من شكله تتكاثر بسرعة (على tachyzoite) لالبطيء الطويل تكرار وencysting النموذج (المتباطئة ). في الأفراد مناعيا، ويعتقد أن هذا المرض الجهاز العصبي المركزي الكامنة لتكون أعراض نسبيا، ولكن في الأفراد المناعة مثل مرضى الإيدز أو متلقى، تجدد الطفيلي يمكن أن يؤدي إلى التهاب الدماغ بالمقوسات قاتلة 1،2. وبالإضافة إلى ذلك، الدراسات الحديثة هكتارلقد أظهرت أن العدوى الكامنة مع التوكسوبلازما يمكن أن يؤدي إلى تغيرات سلوكية في القوارض 3،4، على الرغم من أن آلية لا تزال مجهولة.

والمثير للدهشة أنه بالرغم من هذه البيانات تسليط الضوء على أهمية التفاعل CNS- التوكسوبلازما، والقليل نسبيا هو معروف عن هذه العلاقة، وخاصة على المستوى الخلوي والجزيئي. وقد أعاق القدرة على دراسة الجوانب حتى بسيطة للتفاعل الدماغ الطفيلي في جزء من القيود التكنولوجي. على سبيل المثال، فإن الغالبية من العمل تبين أن الخلايا العصبية هي الخلايا التي لا تزال قائمة الخراجات تم القيام به مع المجهر الإلكتروني (EM) 5،6. على الرغم من EM يعطي ارتفاع القرار، وذلك هو مضيعة للوقت، والعمل المكثف، ومكلفة. وقد تم مؤخرا استخدام المناعي (IF) المقايسات بالتزامن مع المجهري متحد البؤر لتأكيد العمل الذي قام به EM 7. IF المقايسات سهلة من الناحية الفنية لأداء وغير مكلفة نسبيا، ولكن باستخدام هذه التقنيات لالفضوليةTAND العلاقة المكانية بين الكيس والخلايا العصبية المصابة تتطلب إعادة الإعمار المسلسل، والتي تستغرق وقتا طويلا، من الصعب من الناحية الفنية، وربما يؤدي إلى فقدان معلومات قيمة. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة التي يمكن استخدامها مع نموذج الفأر من الجهاز العصبي المركزي داء المقوسات ويسمح لنا الصورة بكاملها من الخلايا العصبية المصابة دون EM أو المناعية (IHC). من خلال تطوير هذه التقنية، يمكننا أن نبدأ لاستكشاف العلاقة الخلوية بين الخلايا المصابة والكيس بطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا.

طريقة ضعنا يجمع بين التقنيات الحديثة للمقاصة بصريا والتصوير أقسام الدماغ سميكة بواسطة المجهر متحد البؤر 8 مع نظام الذي يصادف في خلايا الجسم الحي التي تم حقنها مع البروتينات الطفيلي 9،10. في هذا النظام، ونحن تصيب الفئران لجنة المساواة العرقية-مراسل التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) إلا بعد لجنة المساواة العرقية بوساطة إعادة التركيب 11 مع التوكسوبلازما 9. هذا المزيج يسمح لنا حصاد مخ الفأر المصاب بعد ثبوت العدوى CNS، وقطع أقسام الدماغ سميكة، وبسرعة تحديد المجالات ذات الصلة إلى الصورة من خلال إيجاد RFP + الخراجات. ومن المهم أن نلاحظ أنه مع التعبير الخلية المضيفة من GFP يعتمد فقط على حقن لجنة المساواة العرقية عن الطفيليات، وليس على العدوى، وعدد من الخلايا GFP + لا تحتوي على طفيليات 10. وبما أن الهدف من هذا البروتوكول هو أن تكون قادرة على الصورة كاملة الخلايا العصبية المصابة، ويتم التركيز فقط على GFP + الخلايا العصبية التي تحتوي أيضا على طلب تقديم العروض + الكيس، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لصورة GFP + / RFP - الخلايا العصبية.

مرة واحدة يتم حصاد الدماغ المصاب ومقطوع، ويتم تقديم الأقسام شفافة عن طريق مسح الجلسرين. ثم يتم تصويرها المناطق المناسبة من المقاطع مع المجهر متحد البؤر، ALخوار التصور غير مسبوق من الخلايا المضيفة المصابة والطفيليات متكيسة في مجملها. هنا نقدم بروتوكول كامل لتحديد وإزالة بصريا، والتصوير إصابة الخلايا العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كانت ولدت الفئران وحفظه في درجة حرارة الغرفة والرطوبة التي تسيطر عليها مع 12 ساعة عكس الضوء دورات / الداكنة مع الغذاء والمياه المتاحة الإعلانية libitum في جامعة أريزونا: ملاحظة. وأجريت التجارب في إطار المبادئ التوجيهية وموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة ولاية اريزونا. تم بذل كافة الجهود للحد من المعاناة. الفئران لجنة المساواة العرقية-مراسل هي على C57BL / 6 الخلفية 11 ومتاحة تجاريا.

1. ماوس العدوى

ملاحظة: طريقة العدوى الفأر مع التوكسوبلازما هو موضح أدناه استخدمت في الدراسات التي نشرت سابقا 10-12.

  1. تنمو سلالات التوكسوبلازما في الإنسان القلفة الخلايا الليفية (HFFs) المثقف في Dulbecco وارتفاع السكر التعديل النسور المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ FBS، و 100 U / البنسلين مل، 100 ملغ / مل streptomycin، و2 مم L-الجلوتامين (cDMEM) في T-25 قارورة داخل 5٪ CO 2 الحاضنة حتى شكلت الطفيليات فجوات parasitophorous كبيرة.
  2. الطفيليات حقنة الإفراج عن طريق كشط الخلايا من الجزء السفلي من القارورة وتمرير الحل الناتج من خلال إبرة قياس 25 متصلة حقنة 3 مل 2 مرات داخل قارورة ثم نقل عن حل لقضية حقنة 5ML متصلة إبرة قياس 27 التي وقد وضعت رأسا على عقب داخل أنبوب مخروطي 15 مل. توصيل المكبس إلى حقنة وتمرير الحل الطفيلي في أنبوب مخروطي الشكل.
  3. الطرد المركزي أنبوب لمدة 10 دقيقة في 300 ز س. نضح طاف ثم resuspend الكرية في 4-6 عقيمة مل USP الصف 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 (محلول المخزون).
  4. تحميل عدادة الكريات مع 10 ميكرولتر من محلول المخزون، انتظر 5-10 دقيقة للطفيليات ليستقر ثم حساب عدد الطفيليات في أربعة الزاوية ومركز الساحات من ساحة كبيرة الأوسط.
  5. تمييع الفقرةمواقع لحجم اللقاح المناسب من 100K / 200 ميكرولتر 1X PBS ثم حقن الفئران داخل الصفاق (IP) بإجمالي 200 ميكرولتر.
    ملاحظة: للحصول على هذا الإجراء، تم تلقيح الفئران مع 100K النوع الثالث (CEP) 13 tachyzoites في 200 ميكرولتر 1X PBS. عندما تصيب الفئران مع سلالات أخرى من التوكسوبلازما، قد تحتاج تركيز اللقاح إلى تعديل لحساب مستوى الفوعة.

2. الإرواء وحصاد الدماغ

ملاحظة: تم إجراء هذا البروتوكول في 21 يوما إصابة آخر (نقطة في البوصة)، وهذا يمثل نقطة الوقت الذي تم العثور على أرقام ذروة الخراجات في مخ الفأر، ولكن نقطة زمنية أخرى يمكن استخدامها. حجم، عدد، والموقع، وجود أو عدم وجود الخراجات يعتمد على العديد من العوامل بما في ذلك سلالة الماوس، الطفيلي نوع السلالة وكذلك حجم اللقاح 7،14 - 17. سوف تحتاج المحققين لتحديد بشكل فردي اللقاح المناسب للماوس وToxoplasسلالة أماه انه / انها تستخدم.

  1. إعداد جميع الأدوات الجراحية الحصاد (الشكل 1).
  2. لكل الماوس، وإعداد والحفاظ على الجليد: حقنة 20ML مليئة 0.9٪ كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) + 10 U / مل الهيبارين في 1X معقم USP الصف PBS (الهيبارين / المالحة)؛ 20 مل حقنة مليئة 4٪ لامتصاص العرق (PFA)؛ التلألؤ قارورة مع 15 مل 4٪ PFA. بالنسبة للفئران متعددة، وإعداد كوب مملوء كامل المبلغ من كل حل اللازمة لجميع الفئران ثم وضع حقنة جديدة مليئة حل لكل الارواء.
  3. تخدير الملكية الفكرية الفأر مع 200 ميكرولتر / 25 غرام من وزن الجسم من الكيتامين / زيلازين الكوكتيل (24 ملغ / مل و 4.8 ملغ / مل على التوالي) في اليوم من الفائدة. مراقبة الماوس لمستوى التخدير عن طريق فحص القدمين قرصة المنعكس. تواصل مع بروتوكول فقط مرة واحدة يظهر الماوس أي رد على قرصة اصبع القدم حازمة.
    ملاحظة: أساليب أخرى من التخدير يمكن استخدام طويلة كما يتم الوصول إلى مستوى مناسب من التخدير قبلالشروع في البروتوكول.
  4. ضع الماوس في موقف ضعيف على منصة رغوة مغطاة. يعلقون جميع أطرافه الأربعة من تحت أقدام ثم رش الصدر والبطن مع الايثانول 70٪ (ETOH) (الشكل 2A). إضافة عدة مناشف ورقية معقمة تحت الماوس يمكن أن تستخدم للمساعدة على امتصاص الفائض من السوائل الارواء.
  5. الجلد رفع أسفل عظمة القص مع ملقط ثم استخدام المقص لإجراء شق. سحب الجلد إلى الوراء لفضح الصدر (الشكل 2B).
  6. رفع الخنجري عملية وإجراء شق في البطن أسفل الحجاب الحاجز، ويعرض الكبد والتي يتم تشريح بصراحة بعيدا عن الحجاب الحاجز. جعل اثنين من الشقوق، واحد على اليسار واحد على اليمين من خلال الحجاب الحاجز والجزء السفلي من الأضلاع. توسيع الشقوق اليسار واليمين ما يقرب من 1 / 2-2 / 3 الطريق حتى القفص الصدري، الذي هو ثم تنعكس مرة أخرى لفتح تجويف الصدر (الشكل 2C).
    ملاحظة: احرص على عدم قطع أي أجهزة أو الأوعية الدموية الرئيسية ودوحلقة هذا الإجراء لأن ذلك سوف تؤثر سلبا على جودة الارواء.
  7. يروي transcardially مع 10-20 مل الهيبارين / المالحة تليها 10-20 مل 4٪ PFA.
    ملاحظة: إذا تم نضح بشكل صحيح، فإن الكبد تتحول من اللون الأحمر إلى تان (الشكل 2D). إذا لم تفعل بشكل صحيح، سوف الأوعية الدموية تكون مرئية (الشكل 2E).
  8. تحويل الماوس فوق على البطن لها والقدمين إعادة دبوس ثم رش الرأس والرقبة مع 70٪ ETOH. رفع الجلد من قاعدة العنق وإجراء شق. إزالة الجلد لفضح الجمجمة (الشكل 2F). قطع رأس رئيس على مستوى الكتفين. إزالة الجمجمة، وإزالة بلطف الدماغ، ووضعه في قارورة التلألؤ مليئة 4٪ PFA (الشكل 2G-H).
    ملاحظة: إذا perfused لكذلك، فإن الدماغ تظهر بيضاء مع عدم وجود أوعية دموية مرئية (الشكل 2I). إذا لم يتم perfused لالدماغ بشكل جيد، والأوعية الدموية تكون مرئية (الشكل 2J).
  9. وضع الشرارةنشوئها قارورة مع الدماغ في 4٪ PFA في 4 درجات مئوية خلال الليل، غطى من الضوء. شطف الدماغ في غير USP الصف برنامج تلفزيوني 1X ونقل إلى قارورة التلألؤ جديدة مليئة المبردة برنامج تلفزيوني 1X. تخزين الدماغ في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات مئوية، وتغطيتها من الضوء.
    ملاحظة: الناجحة المقاصة والتصوير تم إنجازه مع أقسام المخزنة في برنامج تلفزيوني 1X لشهر واحد ولكن من الأفضل إلى قسم الدماغ في غضون بضعة أيام كما التخزين لفترات طويلة في برنامج تلفزيوني سوف عكس تثبيت PFA ويمكن أن يؤدي إلى أقل من الصور المثالية . وقد لاحظت تألق ذاتي وزيادة طمس في بعض المقاطع المصورة بعد التخزين في برنامج تلفزيوني 1X لمدة شهر أو أكثر.

3. الدماغ باجتزاء

  1. إزالة الدماغ من برنامج تلفزيوني 1X ووضعه في مصفوفة الدماغ (الشكل 3A) للسماح لمزيد من الدقة، وحتى يمر في الدماغ. تقليم قبالة المخيخ وحاسة الشم المصابيح، إذا كان موجودا، ومن ثم خفض الدماغ coronally إلى 2 أو 3 أقسام.
  2. يضعوا كل قسم المخ على عينة تصاعد كتلة مع cyanoacrylate. يضعوا كتلة صغيرة من 5٪ هلام الاغاروز راء الباب الدماغ لدعم (الشكل 3B).
    ملاحظة: يمكن استخدام آليات الدعم الأخرى، ولكن من دون دعم، قد Vibratome دفع على خلايا المخ مما يؤدي باجتزاء متفاوتة.
  3. قطع الأنسجة إلى 160 ميكرون (العمل عن بعد للهدف المستخدمة في التصوير) أبواب سميكة مع Vibratome مجموعة إلى سرعة 4 والسعة من 9.
    ملاحظة: يمكن تعديل إعدادات السرعة والسعة تبعا لآلة معينة تستخدم من أجل الحصول على حتى والأقسام على نحو سلس. إذا كانت الإعداداتغير صحيح، يمكن أن تكون النتيجة أقسام غير المستوية وتمزيق النسيج أو الثرثرة العلامات.
  4. جمع أقسام الأنسجة إلى قارورة التلألؤ مليئة طازجة أو مبردة برنامج تلفزيوني 1X إذا أنهم ذاهبون إلى أن يتم مسح خلال أسبوع واحد. إذا أقسام لن يتم مسح خلال أسبوع واحد، أقسام مكان إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge مليئة حل cryopreservative وتخزينها في -20 ° C.

4. المقاصة البصري من الدماغ أقسام الأنسجة

ملاحظة: لقد تم تعديل هذا البروتوكول من أسلوب المنشورة سابقا 8.

  1. إعداد 25٪، 50٪، 75٪ و 90٪ المجلد / المجلد الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X + 2٪ توين-20 (GL / PBST).
  2. إزالة أجزاء من برنامج تلفزيوني 1X أو، إذا كان في cryopreservative، وشطف في برنامج تلفزيوني 1X ونقل إلى قارورة التلألؤ تحتوي على 10 مل من 25٪ GL / PBST. مكان قنينة على شاكر في 4 درجات مئوية، وتغطيتها من التعرض للضوء، لمدة 12 ساعة.
  3. أؤكد أن جميع أقسام وانخفضت إلى بوttom من القارورة. نضح 25٪ GL / PBST، وترك ما يكفي لتغطية أقسام ثم ملء القارورة مع 10 مل 50٪ GL / PBST ومكان على شاكر في 4 درجات مئوية، وتغطيتها من التعرض للضوء، لمدة 12 ساعة. كرر هذه العملية ل75٪ GL / PBST ثم 90٪ GL / PBST. ترك المقاطع في 90٪ GL / PBST لمدة 24 ساعة للوصول إلى المقاصة القصوى. وعلى مدار عملية المقاصة ومراقبة المقاصة البصرية تدريجية (الشكل 4).
    ملاحظة: قد يكون المعجل هذه العملية إذا تم تغيير الحلول على الفور بعد أن غرقت أقسام إلى أسفل القارورة. في 75٪ و 90٪ الحلول، وأقسام لا تغرق على طول الطريق إلى قاع القارورة ولكن سوف تطفو في الوسط.

5. تركيب أقسام أنسجة المخ

  1. قطع رقم 1.5 ساترة إلى 5 قطع لخلق فاصل. استخدام قلم رصاص الحاكم وذات الرؤوس الماس ليسجل وكسر ساترة على طول الخطوط المتقطعة هو مبين في الشكل 5A. تجاهل رانه توسيط قطعة، وترتيب 4 قطع الخارجي على شريحة زجاجية واضحة لخلق النافذة، ثم فرشاة طلاء الأظافر واضحة على طبقات التمسك قطعة من الفاصل إلى الشريحة في التكوين الصحيح (الشكل 5B).
    ملاحظة: سيتم استخدام هل لإنشاء المساحة اللازمة بين الشرائح وساترة لتركيب أقسام مسح. قد يتم اقتطاع ساترة بطرق مختلفة لخلق أي نافذة حجم ضروريا. قبل قطع الفواصل رغوة متاحة تجاريا أيضا. للسماح للطلاء الأظافر لتجف تماما، فمن الأفضل لجعل الشرائح مع الفواصل يوم واحد على الأقل قبل أقسام المتزايدة.
  2. قطع أقسام نقل إلى شريحة باستخدام الماصة نقل من البلاستيك مع غيض قبالة. تأكد من ملء المنطقة المحيطة مع 90٪ GL / PBST. خفض بعناية ساترة على أقسام التأكد من عدم إدخال أي فقاعات. فائض GL / PBST يمكن شرير بعيدا مع خالية من الوبر مسح.
  3. صورة GFP + الخلايا العصبية التي تحتوي على RFP + (الشكل 7A-B) ثم متجر شرائح مسطحة ومغطاة من الضوء في 4 ° C.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، وختم الشرائح تماما حول كافة الحواف لتخزين وتصويرها في وقت لاحق. استخدام طلاء الأظافر واضحة لاغلاق الشريحة هو أمر اختياري ويمكن أن تجعل الأمر أكثر صعوبة لإزالة ساترة إذا كان للمرء أن إزالة أجزاء من الشريحة في وقت لاحق لمزيد من المعالجة.

6. التصوير

ملاحظة: أي المجهر ويمكن استخدام ذلك لديها القدرة على الحصول على دقة عالية-Z-مداخن.

  1. بعد العثور في البداية البؤري في 10X، وتغيير لهدف 20X والمسح الضوئي من خلال قسم للتعرف على الكيس الموجود داخل GFP + خلية. توسيط المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في مجال الرؤية.
  2. التغيير إلى الهدف 40X. التركيز صعودا وهبوطا من خلال ROI كامل للتأكد من أن الخلية بأكملها وقبرصيالحادي ومرئية.
    تم الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر مع هدف النفط DIC M27 40X / 1.30: ملاحظة.
  3. باستخدام برنامج التصوير المثبتة، الحصول على ض المكدس يتضمن الخلية بأكملها مع الكيس. ويبين متوسط ​​الإعدادات المستخدمة للحصول على صور في الشكل (6).
    قد تحتاج إلى تعديل إعدادات اعتمادا على كل أقسام الأنسجة المحققين وقدرات المجهر: ملاحظة.
  4. الحصول على صورة الإسقاط القصوى للض المكدس من خلال تحديد عدد من التوقعات إلى 1. الحصول على رأي التناوب الكامل من خلال تحديد عدد من التوقعات إلى 64.
    ملاحظة: تتوفر حزم البرامج الأخرى، ويمكن استخدامه للحصول على أقصى قدر من الإسقاط، التناوب، وكذلك وجهات النظر الأخرى من الصور ض المكدس.
  5. تحليل الصورة مع برامج التحليل التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويشمل الرقم 7 صور تمثيلية اثنين من GFP + الخلايا العصبية من اثنين مختلفة 160 ميكرون أبواب سميكة، فضلا عن قياس التمثيل في المسافة من الكيس الى خلية الجسم عن الشكل 7B. أرقام التي تحتوي على كيس 7 A و B توضيح أن هذا جديدة بروتوكول يسمح لتصور من الخلايا العصبية المصابة في مجملها. ويبين الشكل 7C أنه مع هذه التقنية والتصوير، وأصبح من الممكن الآن لقياس المسافة بين الكيس وجسم الخلية (Imaris 7.7). الشكل 7D نسخة التناوب كاملة من الشكل 7B. التصور من ض المكدس في هذه الطريقة يسمح للتحقق من التقاط كاملة من الخلية والكيس. 7E الشكل هو فيلم التناوب 3D تظهر كيف يمكن لصورة من 7D يمكن تحليلها من قبل Imaris 7.7 برنامج لقياس المسافة من الكيس ل جسم الخلية إما من منتصف إلى منتصف سص من الحافة إلى الحافة. على الرغم وقد تم قياس أظهرت باستخدام خط مستقيم بين الكيس وخلايا الجسم، قياس بعد GFP الفعلي + عملية لخلايا الجسم ويمكن أيضا أن تتولد (لا تظهر البيانات).

الشكل (1)
الشكل 1: المعدات الجراحية لإزالة من مخ الفأر. (A) لوحة ماص. (ب) كتلة رغوة. (C) إبر تحديد ماهيتها قدم. (D) 25 G مجموعة جمع الدم. (E) 3-الطريقة محبس. (F) حقنة 20 مل لالهيبارين / المالحة. ( G) حقنة 20 مل لمدة 4٪ PFA. (H) ملقط الإبهام. (I) مقص الجميلة، الزاوية إلى جنب، حاد حاد. (J) مقص حاد حادة. (المرقأة K) كيلي. (L) مقص مايو. (M) (N) التلألؤ لمدة 4٪ PFA. شريط مقياس = 8 سم.

الشكل 2
الشكل 2: حصاد مخ الفأر. (A) ماوس تمركزها والصدر رش مع ETOH 70٪. (B) مكشوف الصدر. (C) الصدر تجويف مفتوح. (D) الكبد بعد نضح السليم. (E) الكبد بعد نضح غير لائق. (F) الجمجمة مكشوف. ( G) الدماغ مع نصف الجمجمة إزالتها. (H) الدماغ تحصد في قنينة مليئة 4٪ PFA. (I) الدماغ بعد نضح السليم. (J) الدماغ بعد نضح غير لائق.

الشكل (3)
الشكل 3: باجتزاء مخ الفأر. (A) ماوس ماتري الدماغ س. (B) الفأر الدماغ وagarose هلام اضافته الى تصاعد كتلة مع cyanoacrylate داخل Vibratome غرفة مليئة المبردة برنامج تلفزيوني 1X.

الشكل (4)
الشكل 4: عملية مسح الصور التمثيلية للقسم مخ الفأر خلال كل خطوة من عملية المقاصة.

الرقم 5
الشكل 5: قص وتحديد هل إلى الشريحة. A. رقم 1.5 ساترة مع علامات تمثيلية لقطع ساترة إلى 5 قطع. B. سهل شريحة زجاجية مع كل قطعة من قطع ساترة علق في مكانه مع طلاء الأظافر واضحة لإنشاء إطار.

2237 / 52237fig6highres.jpg "/>
الشكل 6: قطة الشاشة من المعايير العامة المستخدمة للحصول على الصورة.

الرقم 7
الرقم 7: يمكن الخراجات التوكسوبلازما يقيم في العمليات العصبية البعيدة (AB) وصور الإسقاط القصوى من GFP + الخلايا العصبية التي تحتوي على RFP + الخراجات (السهام البيضاء). شريط النطاق = 20 ميكرومتر. (CE) تقديم التصور إضافية وتحليل العلاقة الكيس الخلايا العصبية هو مبين في (ب). (C) Imaris ولدت-قياس خط مباشر للمسافة من حافة الكيس إلى حافة جسم الخلية (149μm ). (D) 3-D فيلم التناوب . (E) Imaris ولدت-www.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video الشكل 7E.avi "الهدف =" _ فارغة "> 3-D فيلم يظهر قياس الكيس إلى خلايا الجسم من كل من منتصف إلى منتصف (163 ميكرون) والحافة إلى الحافة (149 ميكرون).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وبالنظر إلى أن التغيرات الخلوية في الخلايا المضيفة المصابة وقد تم ربط لنتائج المرض في العدوى مع الكائنات الحية داخل الخلايا الأخرى مثل فيروس نقص المناعة البشرية، وداء الكلب، والكلاميديا ​​18،19، قمنا بتطوير تقنية من شأنها أن تسمح لنا لدراسة التفاعلات الحميمة التي تحدث بين الجهاز العصبي المركزي الخلية والتوكسوبلازما استضافة. الطريقة الموصوفة هنا يحقق هذا الهدف من خلال تمكين التصوير كفاءة من الخلايا العصبية المصابة بشكل مزمن. قبل تطوير هذه الطريقة، وكان هذا التصوير تستغرق وقتا طويلا، ومكلفة، أو غير ممكن.

يمكننا الآن استخدام هذه التقنية للإجابة على الأسئلة الأساسية المتعلقة تفاعل التوكسوبلازما -neuron، مثل المناطق هي العصبية محددة مستهدفة من قبل الطفيلي؟ يختلف هذا بين سلالات التوكسوبلازما؟ هل المناطق الخلوية التي الكيس يقيم تختلف عن بقية الخلية (أي لا المصابة وغير المصابة التشعبات من نفس الخلايا العصبية لديهم نفس العدد من العمود الفقري)؟ ما هي خصائص الخلوية المشتركة من قبل الخلايا العصبية المصابة؟ القدرة على الإجابة عن هذه الأسئلة ضرورية لفهم كيفية تغير عدوى التوكسوبلازما الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك على مستوى السلوك.

للحصول على أفضل الصور ممكن، من المهم جدا للتأكد من يتم قطع الأنسجة في حتى أقسام. إذا كان أقسام هي متفاوتة، ساترة لا يجلس بشكل صحيح على قسم مما يؤدي إلى اتصال غير متكافئ مع الهدف مما أدى إلى التصوير دون المستوى الأمثل. خلال تعظيم الاستفادة من هذا البروتوكول، أدلى العديد من التعديلات. تم إجراء عملية المقاصة الأصلية مع الفركتوز في محاولة لإعادة إنتاج النتائج المبينة في تقنية تعرف باسم SeeDB 20. كان هذا الأسلوب يتعارض مع هذا النموذج كما تطفئ RFP (على وجه التحديد mCherry). خطوة رئيسية أخرى، وربما الأهم من ذلك كله هو السماح للمقاصة القصوى من أقسام الأنسجة. إذا لا تمسح بشكل صحيح، سوف خلفية ضوء حيود تكون أعلى وصور تصبح صاخبة. لقد وجدنا أن إضافة توين-20 إلى الجلسرين أعطت صورة أكثر وضوحا بقليل من الجلسرين وحدها. تسمح التكنولوجيا الحالية لنا للحصول على صور ض المكدس من خلال سميكة أقسام أنسجة المخ 160μm ولكن في المستقبل، ونحن نتطلع لزيادة هذا السمك إلى 500 ميكرون أو أكثر للسماح أكثر في تحليل معمق.

ما هي الا من خلال النظر في الخلية بأكملها وارتباطاتها أن نتمكن من البدء في تطوير فكرة الآلية لكيفية تأثر الدماغ على الصعيد العالمي بحلول التوكسوبلازما. ويوفر هذا البروتوكول الجديد فرصة لدراسة تفاعل التوكسوبلازما -neuron على مستوى خلية واحدة وذلك في، بطريقة اقتصادية سريعة. لدينا حتى الآن استكشاف جميع الاستخدامات المحتملة لهذا البروتوكول وكيف يمكن أن تترجم إلى أنظمة أخرى ولكن نتوقع أنها سوف تكون لها تطبيقات متعددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ونحن نشكر مختبر كوشي كامل لإجراء مناقشات مفيدة. نشكر باتي Jansma وجامعة ولاية اريزونا وزارة العلوم العصبية للحصول على المشورة والمساعدة في التصوير. كما نشكر مختبر Porreca لاستخدام Vibratome بهم. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة (NIH NS065116، AAK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System Technical Products International, Inc. Other vibratomes are compatible
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Premium Slides Fisher Scientific 12-544-2
#1.5 Coverslips VWR 48393 251
Diamond Scriber VWR 52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope Zeiss LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml Western Medical Supply, Inc. 4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml Lloyd Inc.
ZsGreen Mice Jackson Laboratories 7906 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) HyClone SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine Corning 25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask Fisher Scientific 1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium VWR 45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade amresco K813-500ml
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079
Bright-Line Hemocytometer Sigma-aldrich Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS005-1
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-aldrich H3393-100KU
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials Fisher Scientific FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof In-house 17212945 This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software Bitplane
Clear nail polish Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok VWR BD309604 Other syringes are compatible
Three-way Stopcock Any brand is compatible
Hypodermic needle Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter Greiner Bio-One 450099 Other brands are compatible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).
  2. Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
  3. Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8 (9), 75246 (2013).
  4. Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
  5. Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).
  6. Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).
  7. Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. , (2010).
  8. Selever, J., Kong, J. -Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
  9. Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).
  10. Koshy, A. a, Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8 (7), (2012).
  11. Madisen, L., Zwingman, T. a, et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  12. Caffaro, C. E., Koshy, A. s, Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9 (5), (2013).
  13. Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).
  14. Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 Forthcoming.
  15. Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).
  16. Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6 (12), 28925 (2011).
  17. Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).
  18. De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).
  19. Scott, C. a, Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).
  20. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).

Tags

علم الأعصاب، العدد 94، علم الأعصاب، متحد البؤر المجهري، الفأر، الدماغ، المقاصة، والبروتينات الفلورية،

Erratum

Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 09/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:

Anita A. Koshy, Carla M. Cabral

to:

Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

التصوير 3-D وتحليل الخلايا العصبية المصابة<em&gt; في فيفو</em&gt; مع<em&gt; التوكسوبلازما</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D… More

Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter