Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

3-D Imaging och analys av nervceller Infekterade doi: 10.3791/52237 Published: December 9, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Med hjälp av detta protokoll, kunde vi bilden 160 ìm tjock hjärnsektioner från möss infekterade med parasiten Toxoplasma gondii, vilket möjliggör visualisering och analys av rumsliga förhållandet mellan encysting parasit och den infekterade neuron.

Abstract

Toxoplasma gondii är en obligat, intracellulär parasit med ett brett spektrum av värd, inklusive människor och gnagare. I både människor och gnagare, Toxoplasma etablerar ett livslångt ihållande infektion i hjärnan. Även om detta hjärninfektion är symptomfri i de flesta immunkompetenta människor, i det växande fostret eller nedsatt immunförsvar, såsom förvärvat immunbristsyndrom (AIDS) patienter, detta förkärlek för och uthållighet i hjärnan kan leda till förödande neurologisk sjukdom. Det är sålunda klart att hjärn Toxoplasma interaktion är kritisk för symtomatisk sjukdom producerad av Toxoplasma, men vi har liten förståelse för det cellulära eller molekylära interaktionen mellan celler i det centrala nervsystemet (CNS) och parasiten. I musmodell av CNS toxoplasmos det har varit känt i över 30 år som nervceller är cellerna där parasiten kvarstår, men lite information finns tillgänglig om vilkadel av neuron är allmänt infekterat (soma, dendrite, axon) och om denna cellulära förhållandet förändras mellan stammar. Delvis denna brist är sekundär till svårigheten att bildbehandling och visualisering hela infekterade nervceller från ett djur. Sådana bilder skulle normalt kräva seriesnittning och sömnad av vävnad avbildas genom elektronmikroskopi eller konfokalmikroskopi efter immunfärgning. Genom att kombinera flera tekniker, den metod som beskrivs här möjliggör användning av tjocka sektioner (160 nm) för att identifiera och bild hela celler som innehåller cystor, vilket gör tredimensionell visualisering och analys av enskilda, kroniskt infekterade nervceller utan behov av immunfärgning, elektronmikroskopi eller seriesnittning och sömnad. Med denna teknik kan vi börja förstå det cellulära förhållandet mellan parasiten och den infekterade neuronen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det övergripande målet med denna metod är att med hög upplösning, tredimensionella bilder av enskilda nervceller som är infekterade av obligat intracellulära parasiten Toxoplasma gondii.

Toxoplasma anses ofta vara en av de mest framgångsrika parasiter på grund av dess stora mellanvärdområde, vilket inkluderar människor och gnagare. I både människor och gnagare, efter akut infektion genom intag av förorenad mat eller vatten, är Toxoplasma kan orsaka en ihållande infektion i CNS genom att konvertera från dess snabba repliker formen (den tachyzoite) till dess långsamma replikerande och encysting formen (den bradyzoite ). I immunkompetenta individer, är denna latenta CNS infektion tros vara relativt symptomfria, men med nedsatt immunförsvar såsom AIDS-patienter eller transplanterade patienter, kan nya utbrottet av parasiten leda till dödlig toxoplasmic encefalit 1,2. Dessutom senaste studierna have visat att latent infektion med Toxoplasma kan leda till beteendeförändringar hos gnagare 3,4, men mekanismen är okänd.

Överraskande, trots dessa uppgifter belyser vikten av CNS- Toxoplasma interaktion, är relativt lite känt om detta förhållande, speciellt på cellulär och molekylär nivå. Förmågan att studera även enkla aspekter av hjärn-parasit interaktion har hind delvis av teknologisk begränsningar. Till exempel, de flesta av det arbete som visar att neuroner är de celler i vilka cystor härdar har gjorts med elektronmikroskopi (EM) 5,6. Även EM ger hög upplösning, är det tidskrävande, personalkrävande och dyrt. Immunofluorescens (IF) analyser har nyligen använts i samband med konfokalmikroskopi att bekräfta det arbete som EM 7. IF analyser är tekniskt enkelt att utföra och relativt billiga, men med användning av dessa tekniker för att understand det rumsliga förhållandet mellan cysta och smittade neuron kräver seriell rekonstruktion, vilket är tidskrävande, tekniskt svår, och kan leda till förlust av värdefull information. Därför har vi utvecklat en metod som kan användas med musmodell av CNS toxoplasmos och tillåter oss att bilden helheten av infekterade nervceller utan EM eller immunohistokemi (IHC). Genom att utveckla en sådan teknik, kan vi börja att utforska den cellulära förhållandet mellan den infekterade cellen och cysta på ett relativt snabbt och billigt sätt.

Den metod vi utvecklat kombinerar nyare tekniker för optiskt clearing och bild tjocka hjärnan sektioner av konfokalmikroskopi 8 med ett system som markerar in vivo celler som har injicerats med parasitproteiner 9,10. I detta system, vi infektera Cre-reporter möss som uttrycker ett grönt fluorescerande protein (GFP) endast efter Cre-medierad rekombination 11 med Toxoplasma 9. Denna kombination gör att vi kan skörda den infekterade musen hjärnan efter CNS-infektion är etablerad, skär tjocka hjärnan sektioner, och snabbt identifiera relevanta områden till bilden genom att hitta RFP + cystor. Det är viktigt att notera att när värdcell uttryck av GFP beror enbart på injektion av Cre av parasiter, och inte på infektion, ett antal av GFP + celler inte innehåller parasiter 10. Eftersom målet med detta protokoll är att kunna bild hela infekterade nervceller, är fokus bara på GFP + nervceller som även innehåller en RFP + cysta, men protokollet kan också användas för att bilden GFP + / RFP - nervceller.

När den infekterade hjärnan skördas och sektion, är de avsnitt återges transparent med glycerol clearing. Lämpliga områden i sektioner sedan avbildas med konfokalmikroskopi, aljande motstycke visualisering av infekterade värdceller och de inkapslade parasiter i sin helhet. Här ger vi en komplett protokoll för att identifiera, optiskt clearing, och bild smittade nervceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS: Möss uppvuxna och underhållas i en kontrollerad temperatur och luftfuktighet rum med 12 hr omvänd ljus / mörker-cykler med mat och vatten tillgängligt ad libitum vid University of Arizona. Experiment utfördes under riktlinjer och godkännande av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Arizona. Alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet. Cre-reporter möss är på en C57BL / 6 bakgrund 11 och är kommersiellt tillgängliga.

1. Mus Infektion

OBS: Förfarandet för infektion mus med Toxoplasma gondii beskrivs nedan har använts i studier tidigare publicerade 10-12.

  1. Grow Toxoplasma stammar i humana förhudsfibroblaster (HFFS) odlades i Dulbeccos hög glukoshalt Modifierat Eagles Medium (DMEM) kompletterat med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, och 2 mM L-glutamin (cDMEM) i en T-25-kolv inuti en 5% CO2 inkubator tills parasiter har bildat stora parasitofor vakuoler.
  2. Spruta frisättning parasiter genom att skrapa cellerna från kolvens botten och passerar den resulterande lösningen genom en 25 gauge nål ansluten till en 3 ml spruta 2 gånger inuti kolven sedan överföra all lösning till en 5 ml spruta fall förbunden med en 27 gauge nål som har placerats upp och ned i en 15 ml koniska rör. Anslut kolven till sprutan och passera parasiten lösningen in i koniska rör.
  3. Centrifugera röret i 10 minuter vid 300 x g. Aspirera supernatanten resuspendera sedan pelleten i 4-6 ml sterilt USP kvalitet 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4 (stamlösning).
  4. Ladda en hemocytometer med 10 | il av stamlösning, vänta 5-10 min för parasiterna att sedimentera sedan räkna antalet parasiter i de fyra hörn- och mitt rutor av mitten stor fyrkant.
  5. Späd paraplatser till lämplig inokulat storlek 100K / 200 l 1x PBS injicera sedan möss intraperitonealt (ip) med en total volym på 200 l.
    OBS: För denna procedur, möss ympades med 100K Typ III (CEP) 13 tachyzoiter i 200 l 1x PBS. När infektera möss med andra stammar av Toxoplasma kan koncentrationen av inokulat behöva justeras för att ta hänsyn till graden av virulens.

2. Perfusion och Brain Skörd

NOTERA: Detta protokoll utfördes vid 21 dagar efter infektion (dpi), eftersom detta representerar den tidpunkt vid vilken topp antal cystor finns i mushjärna, men andra tidspunkter kan användas. Storlek, antal, plats och närvaro eller frånvaro av cystor beror på många faktorer, inklusive musstammen, parasit stam typ samt inokulatets storlek 7,14 - 17. Utredare måste individuellt bestämma lämplig inokulat för musen och Toxoplasma stam han / hon använder.

  1. Setup alla kirurgiska avverkningsverktyg (Figur 1).
  2. För varje mus, förbereda och hålla på is: 20 ml spruta fylld med 0,9% natriumklorid (NaCl) + 10 U / ml Heparin i 1x steril USP klass PBS (Heparin / saltlösning); 20 ml spruta fylld med 4% paraformaldehyd (PFA); Scintillationsampull med 15 ml 4% PFA. För flera möss, förbereda en bägare fylld med hela beloppet för varje lösning som behövs för alla möss sedan utarbeta en ny spruta full av lösningen för varje perfusion.
  3. Bedöva musen ip med 200 ^ il / 25 g kroppsvikt av ketamin / xylazin cocktail (24 mg / ml och 4,8 mg / ml) på dagen av intresse. Övervaka musen för nivå av anestesi genom att kontrollera tå nypa reflex. Fortsätt med protokoll förrän musen visar inget svar på ett fast tå nypa.
    OBS: Andra metoder för anestesi kan användas så länge som den lämpliga nivån av anestesi nås innanfortsätter med protokollet.
  4. Placera musen i ryggläge på den täckta skumplattform. Pin alla fyra lemmar ut vid fötterna sedan spraya bröstet och buken med 70% etanol (EtOH) (Figur 2A). Tillsats av flera sterila pappershanddukar under musen kan användas för att hjälpa till att absorbera överflöd av perfusion vätskor.
  5. Lyft huden strax nedanför bröstbenet med pincett sedan använda sax för att göra ett snitt. Dra huden tillbaka att exponera bröstet (Figur 2B).
  6. Lyft xiphoid processen och göra en buksnitt strax under diafragman, utsätta levern som rent ut dissekeras bort från membranet. Gör två snitt, en på vänster och en på höger genom membranet och botten av revbenen. Utöka vänster och höger snitt ca 1 / 2-2 / 3 vägen upp bröstkorgen, som sedan reflekteras tillbaka för att öppna brösthålan (figur 2C).
    OBS: Se till att inte klippa några organ eller större blodkärl DUring detta förfarande eftersom detta kommer att äventyra kvaliteten på perfusion.
  7. BEGJUTA transcardially med 10-20 ml Heparin / Saline följt av 10-20 ml 4% PFA.
    OBS: Om perfusion görs på rätt sätt, kommer levern från röd till ljusbrun (figur 2D). Om inte görs på rätt, kommer blodkärlen syns (Figur 2E).
  8. Vänd på musen på dess buk, re-pin fötter spraya därefter huvud och hals med 70% EtOH. Lyft hud från basen av halsen och göra ett snitt. Ta bort huden att exponera skallen (Figur 2F). Halshugga huvud vid nivån för axlarna. Ta skallen, försiktigt bort hjärnan, och placera den i en scintillationsflaska fylld med 4% PFA (Figur 2G-H).
    OBS: Om väl perfusion, kommer hjärnan att visas vita utan synliga blodkärl (Figur 2i). Om hjärnan inte är väl perfusion, kommer blodkärlen syns (Figur 2J).
  9. Placera scintillationsflaska med hjärnan i 4% PFA vid 4 ° C över natten, täckt från ljus. Skölj hjärnan i icke-USP kvalitet 1x PBS och överför till en ny scintillationsflaska fylld med kyld 1 x PBS. Förvara hjärnan i 1x PBS vid 4 ° C, täckt från ljus.
    OBS: Lyckad clearing och bildbehandling har åstad med sektioner som lagras i 1x PBS i upp till en månad, men det är bäst att avsnittet hjärnan inom några dagar som långvarig lagring i PBS kommer vända PFA fixering och kan leda till mindre än optimala bilder . Autofluorescens och ökad oskärpa har noterats i vissa avsnitt avbildas efter lagring i 1x PBS i en månad eller längre.

3. Brain Sektione

  1. Avlägsna hjärnan från 1 x PBS och placera den i en hjärna matris (Figur 3A) för att möjliggöra mer exakt och även skär genom hjärnan. Trimma bort lillhjärnan och lukt glödlampor, om den finns, och sedan klippa hjärnan koronalt i 2 eller 3 sektioner.
  2. Fäst varje hjärna sektion på ett prov monteringsblock med cyanoakrylat. Anbringa ett litet block av 5% agarosgel bakom hjärnsektion till stöd (figur 3B).
    OBS: Andra stödmekanismer kan användas, men utan stöd, kan Vibratome tryck på hjärnan som orsakar ojämn sektione.
  3. Skär vävnad i 160 nm (arbetsavstånd av målet som används för avbildning) tjocka sektioner med Vibratome inställd på en hastighet av 4 och amplitud 9.
    Anmärkning: Inställningarna för hastighet och amplitud kan justeras beroende på den speciella maskin som används för att erhålla jämna, plana sektioner. Om inställningarna ärinte är korrekt, kan resultatet bli ojämna sektioner, riva av vävnad eller slagmärken.
  4. Samla vävnadssnitt i en scintillationsflaska fylld med färska, kylda 1x PBS om de kommer att rensas inom en vecka. Om delar inte kommer att rensas inom en vecka, placera sektionerna i 1,5 ml mikrorör fyllda med kryokonserveringsmedel lösning och förvara vid -20 ° C.

4. Optisk Clearing av hjärnvävnad Sektioner

OBS: Detta protokoll har ändrats från en tidigare publicerad metod 8.

  1. Förbered 25%, 50%, 75% och 90% vol / vol glycerol i 1x PBS + 2% Tween-20 (Gl / PBST).
  2. Ta bort sektioner från 1x PBS eller, om i kryokonserveringsmedel, skölj i 1x PBS och överför till en scintillationsflaska innehållande 10 ml 25% Gl / PBST. Placera flaskan på en shaker vid 4 ° C, täckt från ljus, i 12 h.
  3. Kontrollera att alla avsnitt har sjunkit till bottom av flaskan. Aspirera 25% Gl / PBST, lämnar bara tillräckligt för att täcka de avsnitt fyller sedan flaskan med 10 ml 50% Gl / PBST och placera på en shaker vid 4 ° C, täckt från ljus, i 12 h. Upprepa denna process för 75% Gl / PBST sedan 90% Gl / PBST. Lämna avsnitt i 90% Gl / PBST i 24 timmar för att nå maximal clearing. Under clearingprocessen, observera gradvis optisk clearing (Figur 4).
    OBS: Denna process kan påskyndas om lösningar byts direkt efter avsnitten har sjunkit till botten av flaskan. I 75% & 90% lösningar, kommer avsnitten inte sjunka hela vägen till botten av flaskan, men kommer att flyta i mitten.

5. Montering Hjärnvävnad Sektioner

  1. Skär en nr 1.5 täck i fem delar för att skapa en distans. Använd en linjal och diamantbestyckade penna för att göra mål och bryta täck längs de streckade linjerna som visas i figur 5A. Släng tHan centrum bit, ordna fyra yttre bitar på en vanlig glasskiva för att skapa ett fönster, och sedan borsta genomskinligt nagellack på sömmarna att fästa bitar av distans till bilden i rätt konfiguration (figur 5B).
    OBS: Distans kommer att användas för att skapa det nödvändiga utrymmet mellan bild och täck för montering av clearade sektionerna. Täck kan skäras på olika sätt för att skapa ett fönster nödvändiga storleken. Pre-cut skum distanser är också kommersiellt tillgängliga. För att tillåta nagellack torka helt, är det bäst att göra bilder med distanser minst en dag före monteringssektioner.
  2. Överför sektioner till en bild med hjälp av en plastöverförings pipett med spetsen avskurna. Se till att fylla i omgivningen med 90% Gl / PBST. Försiktigt sänka en täck över sektionerna se till att inte införa några bubblor. Överskott Gl / PBST kan ledas bort med en luddfri torka.
  3. Bild GFP + nervceller innehållande RFP + (Figur 7A-B) sedan lagra diabilder platt och täckt från ljus vid 4 ° C.
    OBS: Alternativt tätningen glider helt runt alla kanter för att lagra och avbildade vid ett senare tillfälle. Användning av genomskinligt nagellack för att täta slide är valfritt och kan göra det svårare att ta bort täck om man skulle ta bort sektioner från bilden vid ett senare tillfälle för vidare bearbetning.

6. Imaging

OBS: Varje mikroskop kan användas som har förmågan att få högupplösta z-stackar.

  1. Efter att inledningsvis hitta fokalplanet vid 10X, byta till en 20X objektiv och scanna igenom avsnittet för att identifiera en cysta som ligger inuti en GFP + celler. Centrera regionen av intresse (ROI) i synfältet.
  2. Byt till en 40X objektiv. Fokusera upp och ner genom hela ROI för att se till att hela cellen och cyst är synliga.
    OBS: Bilder erhölls med hjälp av en konfokalmikroskop med 40X / 1,30 Olja DIC M27 objektiv.
  3. Använda den installerade bildbehandlingsprogram, erhålla ett z-stack som omfattar hela cellen med cysta. Genomsnittliga inställningar som används för att få bilder visas i figur 6.
    OBS: Inställningar kan behöva justeras beroende på varje utredare vävnadssnitt och mikroskop kapacitet.
  4. Skaffa en maximal projektion bild av z-stack genom att ställa in antalet projektioner till 1. Skaffa en full rotations uppfattning genom att ställa in antalet projektioner till 64.
    OBS: Andra programvarupaket finns tillgängliga och kan användas för att erhålla maximal projektion, roterande och andra vyer av z-stack bilder.
  5. Analysera bild med bild analysprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 7 innehåller representativa bilder av två cysta innehållande GFP + nervceller från två olika 160 nm tjocka sektioner samt en representativ mätning av avståndet från cysta till cell-organ för figur 7B. Figurer 7 A och B visar att denna nya protokollet möjliggör visualisering av den infekterade neuron i sin helhet. Figur 7C visar att med denna bildteknik, är det nu möjligt att kvantifiera avståndet mellan cysta och cellkroppen (Imaris 7.7). Figur 7D är en full rotations av figur 7B. Visualisering av z-stack på detta sätt möjliggör verifiering av fullständig uppsamling av cellen och cysta. Figur 7E är en 3D rotations film som visar hur bilden från 7D kan analyseras med Imaris 7,7 programvara för att mäta avståndet från cysta till cellkroppen antingen från mitten-till-middle or kant till kant. Även mätningen visad gjordes med användning av en rak linje mellan cystan och cellkroppen, en mätning från det faktiska GFP + processen till cellkroppen kan också genereras (data ej visade).

Figur 1
Figur 1: Kirurgisk utrustning för borttagning av mushjärna. (A) absorberande dyna. (B) skumblock. (C) Nålar att sätta fingret på fötterna. (D) 25 G samlingen Blod set. (E) 3-vägskran. (F) 20 ml spruta för heparin / saltlösning. ( G) 20 ml spruta för 4% PFA. (H) Tumme pincett. (I) Fine sax, vinklad till sida, skarp skarp. (J) Sharp skarp sax. (K) Kelly peanger. (L) Mayo sax. (M) (N) scintillationsampull för 4% PFA. Skalstreck = 8 cm.

Figur 2
Figur 2: Skörde mushjärna. (A) Mus nålas ner och bröstet besprutas med 70% EtOH. (B) Utsatt bröstet. (C) Chest hålighet öppen. (D) Lever efter lämplig perfusion. (E) Lever efter felaktig perfusion. (F) Utsatt skalle. ( G) Hjärna med halva skallen bort. (H) Skördad hjärnan flaska fylld med 4% PFA. (I) Brain efter lämplig perfusion. (J) Brain efter felaktig perfusion.

Figur 3
Figur 3: Sektione mushjärna. (A) mushjärna MATRI x. (B) Mus hjärnan och agarosgel fäst monteringsblock med cyanoakrylat inne Vibratome kammare fylld med kyld 1x PBS.

Figur 4
Figur 4: Rensa process Representativa bilder av en mus hjärnsektion under varje steg i clearingprocessen..

Figur 5
Figur 5: Styckning och fastställande distans att glida. A nr 1.5 täck. Med representativa märken för att skära täck i 5 st. B. Vanligt glasskiva med varje skär täck kryssade på plats med genomskinligt nagellack för att skapa ett fönster.

2237 / 52237fig6highres.jpg "/>
Figur 6: Skärmdump av allmänna parametrar som används för bildtagning.

Figur 7
Figur 7:. Toxoplasma gondii cystor kan finnas inom avlägsna neuronala processer (AB) Maximala projektionsbilder av GFP + nervceller innehållande RFP + cystor (vita pilar). Skala bar = 20 nm. (CE) ger ytterligare visualisering och analys av cysta-neuron förhållande som visas i B. (C) Imaris genererade direkt linje mätning av avståndet från kanten av cysta till kanten av cellkroppen (149μm ). (D) 3-D rotations film . (E) Imaris genereradewww.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Figur 7E.avi "target =" _ blank "> 3-D film visar cysta till cell-kroppsmätning från både mellan till mitten (163 nm) och kant-till-kant (149 | im).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med tanke på att cellförändringar i infekterade värdceller har varit kopplade till sjukdomsutfall i infektioner med andra intracellulära organismer som HIV, Rabies, och Chlamydia 18,19, utvecklade vi en teknik som skulle tillåta oss att studera de intima samspel som sker mellan CNS värdcell och Toxoplasma. Den här beskrivna metoden åstadkommer detta mål genom att möjliggöra effektiv bildåtergivning av kroniskt infekterade neuroner. Före utvecklingen av denna metod, såsom avbildning var tidskrävande, kostsamt, eller inte möjligt.

Vi kan nu använda denna teknik för att svara på grundläggande frågor om Toxoplasma -neuron interaktion, till exempel är specifika neuronala områden som omfattas av parasiten? Skiljer sig detta mellan Toxoplasma stammar? Gör de cellulära områden där cysta bosatt skiljer sig från resten av cellen (dvs gör infekterade och oinfekterade dendriter från samma neuron har samma antal ryggar)? Vilka är de cellulära egenskaper som delas av infekterade nervceller? Förmågan att svara på sådana frågor är viktigt att förstå hur toxoplasmainfektion ändrar CNS, även på nivån av beteende.

För att erhålla de bästa bilderna möjligt, är det mycket viktigt att se till vävnaden skärs i jämna avsnitt. Om sektionerna är ojämna, betyder täckglas inte sitta ordentligt på det avsnitt som leder till ojämn kontakt med målet som resulterar i suboptimal avbildning. Under optimering av detta protokoll, har flera ändringar gjorts. Den ursprungliga clearingprocessen gjordes med fruktos i ett försök att reproducera resultat som visas i en teknik känd som SeeDB 20. Denna metod var oförenlig med denna modell eftersom den kylda RFP (specifikt mCherry). En annan viktig steg och förmodligen den viktigaste av allt är att tillåta för maximal clearing av vävnadssnitt. Om inte rensat ordentligt, kommer bakgrundsljus diffraktion vara högre ochbilder blir bullrigt. Vi fann att tillsats av Tween-20 till glycerolen gav en något klarare bild än enbart glycerol. Dagens teknik gör det möjligt för oss att skaffa z-stack bilder via 160μm tjock hjärnvävnadssnitt men i framtiden ser vi att öka denna tjocklek till 500 um eller mer för att möjliggöra ännu mer djupgående analys.

Det är bara genom att titta på hela cellen och dess anslutningar som vi kan börja utveckla en mekanistisk uppfattning om hur hjärnan är globalt påverkas av Toxoplasma. Detta nya protokoll erbjuder en möjlighet att studera Toxoplasma -neuron samspel på enstaka cellnivå och göra det på ett snabbt, ekonomiskt sätt. Vi har ännu att utforska alla tänkbara användningsområden för detta protokoll och hur den kan översätta till andra system, men vi räknar med att det kommer att ha flera program.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna.

Acknowledgments

Vi tackar hela Koshy labbet för bra diskussioner. Vi tackar Patty Jansma och University of Arizona neurovetenskap Institutionen för råd och hjälp med bildbehandling. Vi tackar också Porreca labbet för användningen av deras Vibratome. Denna forskning stöds av US National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System Technical Products International, Inc. Other vibratomes are compatible
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Premium Slides Fisher Scientific 12-544-2
#1.5 Coverslips VWR 48393 251
Diamond Scriber VWR 52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope Zeiss LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml Western Medical Supply, Inc. 4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml Lloyd Inc.
ZsGreen Mice Jackson Laboratories 7906 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) HyClone SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine Corning 25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask Fisher Scientific 1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium VWR 45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade amresco K813-500ml
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079
Bright-Line Hemocytometer Sigma-aldrich Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS005-1
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-aldrich H3393-100KU
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials Fisher Scientific FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof In-house 17212945 This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software Bitplane
Clear nail polish Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok VWR BD309604 Other syringes are compatible
Three-way Stopcock Any brand is compatible
Hypodermic needle Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter Greiner Bio-One 450099 Other brands are compatible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15, (2), 211-222 (1992).
  2. Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8, (10), 634-640 (2002).
  3. Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8, (9), 75246 (2013).
  4. Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
  5. Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411, (1), 39-43 (1987).
  6. Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72, (4), 463-474 (1991).
  7. Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. (2010).
  8. Selever, J., Kong, J. -Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
  9. Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7, (4), 307-309 (2010).
  10. Koshy, A. a, Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8, (7), (2012).
  11. Madisen, L., Zwingman, T. a, et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, (1), 133-140 (2010).
  12. Caffaro, C. E., Koshy, A. s, Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9, (5), (2013).
  13. Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21, (10), 476-481 (2005).
  14. Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11, (2), 267-299 Forthcoming.
  15. Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29, (3), 205-214 (2014).
  16. Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6, (12), 28925 (2011).
  17. Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73, (6), 483-491 (1987).
  18. De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46, (3), 614-638 (2012).
  19. Scott, C. a, Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82, (1), 513-521 (2008).
  20. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, (8), 1154-1161 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 09/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:

Anita A. Koshy, Carla M. Cabral

to:

Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

3-D Imaging och analys av nervceller Infekterade<em&gt; In Vivo</em&gt; Med<em&gt; Toxoplasma gondii</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).More

Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter