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Biology

恢复成年斑马鱼的心脏的高通量应用

doi: 10.3791/52248 Published: December 12, 2014

Abstract

用于研究发育,再生,和疾病正在扩大向着使用成年心脏细胞解离和RNA,DNA和蛋白质的纯化使用斑马鱼模型系统。所有这些应用都需要显著数字斑马鱼的心的迅速恢复,以避免基因调控,代谢和死亡后开始发生转变。也需要研究心脏结构,适用于各种突变体和研究心脏再生的成年斑马鱼的心。然而,传统的斑马鱼心脏解剖是缓慢而艰难的,需要专门的工具,使得成年斑马鱼心中大规模清扫乏味。传统的方法也怀有解剖过程中损坏心脏的风险。在这里,我们描述的方法对成年斑马鱼解剖心中是快速,可重复,并保留心脏结构。此外,这种方法不需要专门的工具,是无痛的斑马鱼,可以在新鲜的或固定的标本进行的,并且可以对斑马鱼年仅一个月大进行。所描述的方法扩展了使用成年斑马鱼的心血管研究。

Protocol

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注:请始终确保IACUC或伦理委员会的批准到位开始使用斑马鱼的任何实验过程之前。

1.准备试剂和设置

  1. 准备了以下解决方案。找到食谱所有这些解决方案在标准的斑马鱼手册10。
    • 500毫升蛋水
    • 200毫升0.03%三卡因在水蛋
    • 百毫升1X磷酸盐缓冲盐水的(PBS)中
    • RBC裂解液(可选)
    • 选择的(固定剂,Trizol试剂,PBS ),在冰上1.5 ml离心管目标缓冲区
      注意:固色剂和Trizol法是有毒的,如果他们接触到皮肤接触。处理这些物质时戴上手套。
  2. 准备剥离的设置:
    1. 定位鹅颈光源在解剖显微镜。放置在解剖显微镜阶段9厘米培养皿的盖子,并倒入一薄层的1×PBS的成它(盖被使用,因为盘本身过深为易于解剖)。
    2. 放置在培养皿本身(而不是盖)附近的解剖范围的台面和倒在它大约15毫升1X PBS的。使用此解剖后洗的心脏。另外,使用红细胞裂解液。
    3. 地方刀片,两对镊子,microscissors(可选),以及显微镜旁移液管。获得的冰的容器,如果安乐死通过快速冷却被选择。
    4. 倾200毫升0.03%三卡因的蛋水到250ml玻璃烧杯中,如果安乐死由三卡因被选择。准备一个小袋子生物危害处置斑马鱼的尸体。

2.准备斑马鱼

  1. 固定鱼,带来固定鱼,用PBS漂洗,在显微镜的设置。
    1. 安乐死迅速冷却用冰> 10分钟,整个成年斑马鱼。
    2. 使用镊子,使皮肤中的一个洞在腹膜(远离心脏),以帮助固定液的渗透,然后把它们放在4%多聚甲醛固定缓冲10 2小时在室温或O / N在4℃。
  2. 另外,对于鲜鱼,地方鱼被安乐死在小保持槽和带至显微镜设置。取决于个人设施的鱼协议和下游用途的解剖鱼心,用三卡因麻醉鱼或断头之前通过快速冷却安乐死。
    1. 用冰,拿起一条鱼的渔网,地点在冰水中待鱼停止移动,约5分钟。
    2. 可替代地,使用三卡因,拿起在溶液的烧杯1鱼用鱼网和地点直到鳃的动作停止。
  3. 赶快拿起安乐死的鱼其尾鳍,并将其放在其在培养皿盖被充满1X PBS的一面。使用镊子解除胸鳍用一只手,而使用razoř刀片用另一只手斩首鱼,只是后侧的胸鳍( 图1A)的附接。无论是看通过显微镜或干脆直接在显微镜舞台上可视化鱼执行此步骤。
    注意:新鲜的鱼安乐死仍然将斩首后出血。

图1
图1.斑马鱼成人心脏解剖利用斑马鱼解剖标志。 (一)要杀头鱼,解除胸鳍有镊子,用锋利的干净的刀片沿着红色虚线所示。(B)以稳定的鱼头,把镊子的一个叉在鱼嘴里一边其他齿在于整个眼睛,然后打开鱼嘴使腹面是和镊子的两个齿是稳定对培养皿底部。(C)使用免费FORCEPS切割厣(箭头)。(D)提升本的附件,背主动脉是白色结构,粉红色的条纹表示管腔血(箭头)可见。 请点击此处查看该图的放大版本。

3.解剖心

  1. 可视化在显微镜下鱼头。与一个钳,稳鱼嘴通过将钳子之一齿在鱼口,通过大脑,而另一叉是头部外,整个眼睛( 图1B)。确保钳子的两个尖齿是稳定对抗培养皿的底部。抱着鱼头这样一来,其腹面应朝上。
  2. 用另一只手,使用第2钳子切断厣腹侧附着到主体(箭头, 图1C)。用钳子轻轻抬起这一点,对Dorsal主动脉下方会出现一个白色的结构,血红色的条纹在主动脉管腔(箭头, 图1D)。切背主动脉与镊子捏住主动脉和向上拉;可替代地,可使用microscissors削减背主动脉。
  3. 现在,使用第2钳子从其基部把握胸鳍,包括主体软骨在翅片的基部,并解除这种关闭。重复与其他胸鳍。偶尔,心脏出来的胸鳍,所以研究这些作品,以确保心脏没有连接丢弃它们。
    注意:在这一点,心脏应该是可见的,仍然完好无损并连接到其余鱼嘴(虽然偶尔它与胸鳍脱落)。的心脏可以通过它的形状,它的粉红色,而其正被着色的心包包围被识别。因为鱼的安乐死是快速执行,新鲜的鱼安乐死心中仍有可能击败SLOWLY。
  4. 放开鱼头与第一钳,使双手握住钳都是免费的。同时使用镊子挑逗的心脏远离心包。由背主动脉的剩余把握的心脏,而剩下的心包被拉走。
    注意:无论是固定的还是新鲜的,心脏是强大的,以温和的拉动,而周围的结缔组织更加易碎。因此,任何周围的心包组织可走解剖与心脏保持完整。
  5. 丢弃剩下的鱼胴体在生物危害袋中。

4.准备心下游应用

  1. 使用镊子,由背主动脉/浙动脉边缘把握的心脏,并将心脏在1X PBS的新鲜菜。另外,用移液管。将心脏来回在PBS约10倍,以洗去尽可能多的血越好。
  2. 对于应用,其中以除去所有possib是很重要勒血细胞,洗涤,并在9厘米培养皿用15ml的RBC裂解缓冲液代替PBS中,使用相同的背面的往复运动。如果保留了心脏的结构是不适合下游应用的重要( 例如,使得RNA),可以使用钳子或microscissors打开心脏腔和促进漂洗程的血细胞。
  3. 对于应用程序中单独心脏室所需,使用产钳或microscissors从对方解剖延髓动脉,心房,心室和分开。
  4. 心脏,或单独室,传输到目标缓冲区冰上。
    注:常见的目的地包括缓冲区细胞分离,4%多聚甲醛,或Trizol法。

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Representative Results

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使用这种方法,一个成年人斑马鱼心脏可以解剖在不到1分钟,相比于在5分钟内用传统方法8。心中使用这种方法解剖是可靠完整( 图2A),而传统的方法需要8盲目削减入心包,因此通常导致心房或延髓动脉( 图2B)的损坏或丢失。心切开保持它们的结构完整性,并适合用于组织学( 图2C),电子显微镜( 图2D),以及用于应用的心脏解离或粉化。在我们的手中,从50心中超过一个星期的实验过程中解剖,50心中获得了结构完整。我们还教这个技术在实验室的同事谁曾与斑马鱼解剖没有经验。 9出9心中的初学者同事解剖也STRUCturally完好无损。这种夹层方法适用于未成年人超过1个月,并为所有年龄段的成年人。

图2
图2.解剖的心是完整和维护架构的完整性。 (A)在不到1分钟,成年斑马鱼心脏有一个完整的中庭(A),心室(V),以及延髓动脉(BA),可以从安乐死的鱼进行解剖。(B)传统的成年斑马鱼的心脏解剖需要更长的时间并且即使当照顾,运行损坏的风险。在这里,只有脑室是否完好。(C)在组织学从使用的Tg(MYL7红色荧光蛋白 )成鱼解剖一个心脏保持其结构的完整性。中庭(A),心室(V),以及延髓动脉(BA)都见过,而像房室瓣(AV,箭头)和流出道,甚至更小的结构(OFT,箭头)都完好无损。(D)</ STRONG>解剖野生型成人心脏的电子显微镜显示肌节仍然受到解剖过程中没有损坏。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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而对于解剖成年斑马鱼心脏的方法已被描述的,这些方法是耗时的,而且经常造成夹层期间对心脏的损伤。执行实验中,可能需要大量的成人心,和/或当避免心脏组织的降解是用于下游应用重要,用传统的剥离工艺所需要的时间是令人望而却步。同样,重复获得完好的,完整的心是心脏结构的研究及免疫组化和显微镜方法很重要。我们发现,即使在初学者的手中,心切开的100%回收得到结构完整。总体而言,该方法为成人心脏解剖这里提出呈现在技术的进步,它扩展了使用成年斑马鱼的用于各种当前和未来的应用,包括在心脏损伤和再生实验。

有几个关键步骤瓦特ithin此协议。首先,视的量,斑马鱼心是需要的实验中,以冲洗心尽可能从血细胞中是很重要的。实验将受益于除血细胞的实例包括心为RNA测序,其中的血液的存在将改变基因的表达谱,或用于FACS分选,其中的血细胞可能难以从心肌细胞进行排序的恢复。在这条大鱼被实施安乐死三卡因或冰,它可以快速斩首鱼,让出血的发生,帮助排除体内多余的血液的心脏是很重要的。如果不需要对所计划的实验的完整心脏,它可以是有帮助的切断心房和心室开放时在PBS中以进一步冲洗血液。 RBC裂解缓冲液也可使用,代替PBS中。

第二,如上所述,偶尔的心脏与胸鳍之一脱落,而不是原地附着到头部。因此,拉胸鳍断,在显微镜下,以使心脏可以鉴别。最后,解剖远离周围的心包心脏的时候,尽量不要抓心脏本身;相反,把握两条心包和心脏,它具有比易碎心包更多的结构完整性拉他们两个了。以这种方式,可避免对心脏甚至最小的损伤。

的心脏应该是它的形状和收缩容易辨认。在寻找心脏的额外援助,可以解剖心脏荧光解剖显微镜下表达荧光蛋白。这通常不是必要的,但可能是有用的,对于初学者和/或用于非常小心解剖。

这种技术的一个限制是,从解剖小鱼, 年龄小于3周龄的心,很难;其它技术已经被设计用于幼虫解剖9。此外,虽然很容易解剖延髓一rteriosus,心房,并且彼此心室,这是不可能的解剖自身房室瓣。阀保持附着到心室在大多数情况下。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Small tank for transporting fish Aquaneering ZHCT100
Fish net Petsmart 36-16731
250 ml glass beaker Kimble 14005-250
9 cm polystyrene Petri dish Nunc 172958
Razor blade Personna American Safety Razor Company 94-120-71
2 Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00
Dissecting microscope Olympus SZX16
Tricaine Sigma A-5040
Plastic transfer pipette Thermo Scientific 202-20S
Gooseneck light source Dolan-Jenner Industries, Inc Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System
Fluorescent light source Lumen Dynamics X-Cite 120Q optional
Micro-scissors Biomedical Research Instruments, Inc 11-1000 optional
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57 optional

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References

  1. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (27), 11316-11321 (2007).
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  10. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
恢复成年斑马鱼的心脏的高通量应用
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Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis. Exp. (94), e52248, doi:10.3791/52248 (2014).More

Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis. Exp. (94), e52248, doi:10.3791/52248 (2014).

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