Abstract
विकास, उत्थान का अध्ययन, और रोग सेल हदबंदी और आरएनए, डीएनए और प्रोटीन की शुद्धि के लिए वयस्क दिलों के उपयोग की ओर विस्तार हो रहा है के लिए zebrafish मॉडल प्रणाली का प्रयोग करें। इन आवेदनों में से सभी नियामक जीन, चयापचय, और मृत्यु के बाद शुरू हो कि अन्य परिवर्तन से बचने के लिए zebrafish के दिलों की बड़ी संख्या में तेजी से वसूली की मांग। वयस्क zebrafish दिल भी म्यूटेंट की एक किस्म के लिए दिल की संरचना का अध्ययन करने के लिए और दिल के उत्थान के अध्ययन के लिए आवश्यक हैं। हालांकि, पारंपरिक zebrafish दिल विच्छेदन धीमी और कठिन है और वयस्क zebrafish दिलों की बड़े पैमाने पर विच्छेदन थकाऊ बना रही है, विशेष उपकरणों की आवश्यकता है। पारंपरिक तरीकों में भी विच्छेदन के दौरान दिल हानिकारक के जोखिम बंदरगाह। यहाँ, हम तेजी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और दिल वास्तुकला को बरकरार रखता है कि वयस्क zebrafish दिल के विच्छेदन के लिए एक विधि का वर्णन। इसके अलावा, इस विधि विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, zebrafish के लिए दर्द रहित होती हैताजा या तय नमूनों पर प्रदर्शन किया, और एक महीने पुराने के रूप में के रूप में युवा zebrafish पर प्रदर्शन किया जा सकता है। वर्णित दृष्टिकोण हृदय अनुसंधान के लिए वयस्क zebrafish के उपयोग से फैलता है।
Protocol
नोट: हमेशा IACUC या नैतिकता समिति के अनुमोदन के लिए zebrafish का उपयोग कर किसी भी प्रयोगात्मक प्रक्रिया शुरू होने से पहले जगह में है कि सुनिश्चित करें।
1. अभिकर्मकों और सेटअप की तैयारी
- निम्नलिखित समाधान तैयार करें। मानक zebrafish मैनुअल 10 में इन समाधान के लिए सभी के लिए व्यंजनों का पता लगाएं।
- अंडे पानी की 500 मिलीलीटर
- अंडे पानी में 0.03% tricaine के 200 मिलीलीटर
- 1x फॉस्फेट बफर खारा की 100 मिलीलीटर (पीबीएस)
- आरबीसी lysis बफर (वैकल्पिक)
- बर्फ पर एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में पसंद के गंतव्य बफर (लगानेवाला, Trizol, पीबीएस, आदि)
नोट: वे त्वचा के साथ संपर्क में आते हैं, तो लगानेवाला और Trizol विषाक्त कर रहे हैं। इन पदार्थों से निपटने जब दस्ताने पहनें।
- विच्छेदन सेटअप तैयार:
- विदारक माइक्रोस्कोप से अधिक gooseneck प्रकाश स्रोत स्थिति। विदारक माइक्रोस्कोप के मंच पर एक 9 सेमी पेट्री डिश के ढक्कन प्लेस, और में 1x पीबीएस की एक पतली परत डालनायह (पकवान खुद एक आसान विच्छेदन के लिए भी गहरी है क्योंकि ढक्कन प्रयोग किया जाता है)।
- विदारक गुंजाइश के पास countertop पर पेट्री डिश में ही नहीं है (ढक्कन) प्लेस और उस में 1x पीबीएस के लगभग 15 मिलीलीटर डालना। विच्छेदन के बाद दिल को धोने के लिए इसका प्रयोग करें। वैकल्पिक रूप से, आरबीसी lysis बफर का उपयोग करें।
- प्लेस रेजर ब्लेड, दो संदंश, microscissors के (वैकल्पिक) के जोड़े, और माइक्रोस्कोप के बगल में एक हस्तांतरण पिपेट। तेजी से ठंडा द्वारा इच्छामृत्यु चुना जाता है अगर बर्फ की एक कंटेनर प्राप्त करते हैं।
- Tricaine द्वारा इच्छामृत्यु चुना जाता है अगर एक 250 एमएल कांच बीकर में अंडे पानी में 0.03% tricaine के 200 मिलीलीटर डालो। Zebrafish शवों के निपटान के लिए एक छोटा सा Biohazard बैग तैयार करें।
2. Zebrafish तैयार करें
- तय मछली के लिए, माइक्रोस्कोप सेटअप करने के लिए, पीबीएस में rinsed निश्चित मछली, ले आओ।
- > 10 मिनट के लिए बर्फ के साथ तेजी से ठंडा करके पूरे वयस्क zebrafish euthanize।
- पेरिटोनियम पर त्वचा में एक छेद बनाने के लिए संदंश का प्रयोग करें(दूर दिल से) लगानेवाला के प्रवेश सहायता, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या हे / एन पर दो घंटे के लिए फिक्स बफर 10 में 4% paraformaldehyde में डाल दिया।
- वैकल्पिक रूप से, ताजा मछली के लिए, जगह मछली एक छोटे जोत टैंक में euthanized किया जाना है और माइक्रोस्कोप सेटअप करने के लिए ले आओ। व्यक्तिगत सुविधा के मछली प्रोटोकॉल और विच्छेदित मछली दिलों के लिए नीचे की ओर का उपयोग करता है पर निर्भर करता है, Tricaine के साथ मछली anesthetize या कत्ल से पहले तेजी से ठंडा द्वारा euthanize।
- मछली आगे बढ़ बंद हो जाता है, जब तक बर्फ के पानी में मछली जाल और जगह के साथ लगभग 5 मिनट के एक मछली उठाओ, बर्फ का उपयोग करने के लिए।
- वैकल्पिक रूप से, गिल आंदोलनों को रोकने के लिए जब तक समाधान की बीकर में मछली जाल और जगह के साथ एक मछली उठाओ, Tricaine उपयोग करने के लिए।
- जल्दी से अपनी पूंछ पंख द्वारा euthanized मछली उठाओ और 1x पीबीएस के साथ भरा हुआ था कि पेट्री डिश कवर में अपने पक्ष पर यह करना। Razo का उपयोग करते समय, एक हाथ से एक छाती पर का कवच पंख लिफ्ट करने के लिए संदंश का प्रयोग करेंआर ब्लेड सिर्फ छाती पर का कवच पंख (चित्रा 1 ए) के लगाव के पीछे, दूसरे हाथ से मछली सिर काटना करने के लिए। माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख कर या बस सीधे खुर्दबीन मंच पर मछली visualizing द्वारा या तो इस चरण को पूरा करें।
नोट: हौसले euthanized मछली अभी भी कत्ल के बाद खून बहाना होगा।
चित्रा 1. Zebrafish वयस्क दिल विच्छेदन zebrafish संरचनात्मक स्थलों का इस्तेमाल करता। (ए), मछली सिर काटना एक संदंश के साथ छाती पर का कवच पंख उठा और के रूप में दिखाया लाल बिंदीदार रेखा के साथ एक तेज साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करने के लिए। (बी), मछली सिर स्थिर मछली मुंह देर में संदंश की एक शाखा जगह अन्य शाखा आंख भर में निहित है, और उदर की सतह के ऊपर है और संदंश के दोनों tines के पेट्री डिश के तल के खिलाफ स्थिर रहे हैं कि ऐसा है तो मछली सिर बारी है। (सी) मुक्त forc का प्रयोग करेंईपीएस operculum (तीर)। (डी) इस भारोत्तोलन की कुर्की कटौती करने के लिए, पृष्ठीय महाधमनी luminal रक्त (तीर) denoting एक गुलाबी पट्टी के साथ एक सफेद संरचना के रूप में दिख रहा है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
3. हार्ट काटना
- खुर्दबीन के नीचे मछली सिर कल्पना। अन्य शाखा आंख (चित्रा 1 बी) के पार, सिर के बाहर है, जबकि एक संदंश के साथ, मस्तिष्क के माध्यम से, मछली के मुंह में संदंश की एक शाखा रखकर मछली सिर स्थिर। संदंश के दोनों tines के पेट्री डिश के तल के खिलाफ स्थिर रहे हैं सुनिश्चित करें। मछली सिर इस तरह होल्डिंग, अपने उदर की सतह से ऊपर की तरफ का सामना करना पड़ जाना चाहिए।
- दूसरे हाथ से, शरीर (चित्रा 1C तीर) के लिए operculum के उदर लगाव में कटौती करने के लिए दूसरा संदंश का उपयोग करें। संदंश के साथ थोड़ा इस भारोत्तोलन, घorsal महाधमनी महाधमनी लुमेन (चित्रा -1 तीर) में खून की एक लाल पट्टी के साथ एक सफेद संरचना के रूप में नीचे दिखाई देगा। महाधमनी बन्द रखो और ऊपर की तरफ खींच कर संदंश के साथ पृष्ठीय महाधमनी कटौती; वैकल्पिक रूप से, पृष्ठीय महाधमनी में कटौती करने के microscissors के उपयोग करें।
- अब, फिन के आधार पर शरीर उपास्थि सहित अपने बेस से छाती पर का कवच पंख काबू करने के लिए दूसरा संदंश का उपयोग, और यह लिफ्ट बंद। अन्य छाती पर का कवच पंख के साथ दोहराएँ। कभी-कभी, दिल छाती पर का कवच पंख के साथ बाहर आता है, तो दिल उन्हें discarding पहले संलग्न नहीं है सुनिश्चित करने के लिए इन टुकड़ों की जांच।
नोट: (कभी कभी यह छाती पर का कवच पंख के साथ उतर आता है) इस बिंदु पर, दिल, दृश्य अभी भी बरकरार है और शेष मछली सिर से जुड़ा होना चाहिए। दिल अपने आकार, अपने गुलाबी रंग, और pigmented पेरीकार्डियम से घिरा अपनी किया जा रहा द्वारा की पहचान की जा सकती है। मछली की इच्छामृत्यु की जल्दी से किया जाता है, क्योंकि हाल में euthanized मछली दिलों में अभी भी SLO पिटाई हो सकता हैWLY। - दोनों हाथों संदंश पकड़ और स्वतंत्र हैं, इसलिए है कि पहले संदंश के साथ मछली सिर के चलते हैं। दूर पेरीकार्डियम से दिल तंग करने के लिए दोनों संदंश का प्रयोग करें। शेष पेरीकार्डियम दूर खींच लिया है, जबकि पृष्ठीय महाधमनी के शेष के द्वारा दिल समझ।
नोट: निश्चित या ताजा चाहे, दिल के आसपास संयोजी ऊतक अधिक नाज़ुक है, जबकि खींच कोमल को मजबूत है। इसलिए, किसी भी आसपास के पेरिकार्डियल ऊतक दिल बरकरार शेष के साथ दूर विच्छेदित किया जा सकता है। - Biohazard बैग में बचे हुए मछली शव त्यागें।
4. बहाव के अनुप्रयोगों के लिए दिल की तैयारी
- संदंश का प्रयोग, पृष्ठीय महाधमनी / धमनी कन्द के किनारे से दिल समझ और 1x पीबीएस के ताजा पकवान में दिल जगह है। वैकल्पिक रूप से, एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें। आगे और पीछे पीबीएस में दिल कदम के बारे में 10x जितना संभव हो उतना खून दूर धोने के लिए।
- अनुप्रयोगों के लिए यह सब possib के दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमेंLe रक्त कोशिकाओं, एक ही पीछे और आगे गति का उपयोग करते हैं, बजाय पीबीएस के 15 मिलीलीटर आरबीसी lysis बफर के साथ एक 9 सेमी पेट्री डिश में धो लें। दिल की संरचना के संरक्षण (जैसे, आरएनए बनाने), हृदय गुहा खोलने के लिए और दूर रक्त कोशिकाओं के rinsing की सुविधा के लिए संदंश या microscissors के उपयोग बहाव के आवेदन के लिए महत्वपूर्ण नहीं है।
- अलग दिल कक्षों वांछित हैं जिसमें अनुप्रयोगों के लिए, एक दूसरे से अलग धमनी कन्द, आलिंद, और निलय काटना संदंश या microscissors के उपयोग करें।
- बर्फ पर गंतव्य बफर करने के लिए दिल, या अलग कक्षों, स्थानांतरण।
नोट: आम स्थलों सेल हदबंदी, 4% paraformaldehyde के, या Trizol के लिए बफ़र्स शामिल हैं।
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Representative Results
इस विधि का प्रयोग, एक वयस्क zebrafish दिल पारंपरिक तरीकों 8 का उपयोग पर 5 मिनट की तुलना में कम से कम 1 मिनट में विच्छेदित किया जा सकता है। पारंपरिक तरीकों 8 पेरीकार्डियम में आँख बंद करके काटने और इसलिए आमतौर पर अलिंद या धमनी कन्द (चित्रा 2B) की क्षति या हानि का कारण की आवश्यकता होती है, जबकि इस पद्धति का उपयोग विच्छेदित दिल, (2A चित्रा) मज़बूती से बरकरार हैं। विच्छेदित दिल उनके संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने और प्रोटोकॉल (चित्रा -2), इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 डी) के लिए उपयुक्त है, साथ ही दिल अलग या चूर्णित है जहां अनुप्रयोगों के लिए कर रहे हैं। हमारे हाथ में, एक हफ्ते के प्रयोगों के पाठ्यक्रम पर 50 दिलों की एक विच्छेदन से, 50 दिलों संरचनात्मक रूप बरकरार प्राप्त किया गया। हम यह भी zebrafish विच्छेदन के साथ कोई अनुभव नहीं था, जो प्रयोगशाला में किसी सहकर्मी को इस तकनीक को पढ़ाया जाता है। शुरुआत सहयोगी द्वारा विच्छेदित 9 दिलों के 9 बाहर भी struc थेturally बरकरार। इस विच्छेदन विधि से अधिक उम्र के एक महीने पुराने किशोरों के लिए और सभी उम्र के वयस्कों के लिए उपयुक्त है।
चित्रा 2. विच्छेदित दिल बरकरार हैं और स्थापत्य अखंडता को बनाए रखने। कम से कम 1 मिनट, एक अक्षुण्ण आलिंद (ए), निलय (वि), और धमनी कन्द (बीए) के साथ एक वयस्क zebrafish दिल में (ए) एक euthanized मछली से विच्छेदित किया जा सकता है। (बी) के पारंपरिक वयस्क zebrafish दिल dissections के लंबे समय तक ले और ध्यान रखा जाता है, तब भी जब क्षति का खतरा रहता है। यहाँ, केवल निलय बरकरार है। (सी) एक टीजी (myl7 dsRed) वयस्क मछली से विच्छेदित एक दिल ऊतक विज्ञान में इस्तेमाल के लिए अपने संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखा। अलिंद (ए), निलय (वि), और धमनी कन्द (बीए) में देखा जाता है, और अलिंदनिलय संबंधी वाल्व (ए वी, तीर) और बहिर्वाह पथ की तरह भी छोटे संरचनाओं (ओ एफ टी, तीर) बरकरार हैं। (डी) </ Strong> विच्छेदित जंगली प्रकार वयस्क दिल की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी sarcomeres विच्छेदन प्रक्रिया द्वारा undamaged रहेगा कि पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
वयस्क zebrafish दिल विदारक के लिए तरीकों में वर्णित किया गया है, इन तरीकों समय लेने वाली थे और आमतौर पर विच्छेदन के दौरान दिल को नुकसान पहुंचाया। वयस्क दिलों की एक बड़ी संख्या में जरूरत हो सकती है, जहां प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए और / या हृदय के ऊतकों का क्षरण से बचने के बहाव के अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है, जब पारंपरिक विच्छेदन तकनीक का उपयोग कर आवश्यक समय निषेधात्मक है। इसी तरह, reproducibly undamaged बरकरार दिलों प्राप्त दिल संरचना के अध्ययन के लिए और immunohistochemical और माइक्रोस्कोपी तरीकों के लिए महत्वपूर्ण है। हम भी शुरुआती के हाथों में, विच्छेदित दिल की 100% संरचनात्मक रूप बरकरार बरामद किया गया है कि पाया। कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत वयस्क दिल विच्छेदन के लिए विधि दिल की चोट और उत्थान के प्रयोगों में उपयोग सहित वर्तमान और भविष्य के आवेदनों की एक किस्म के लिए वयस्क zebrafish के उपयोग से फैलता है कि तकनीक में एक अग्रिम प्रस्तुत करता है।
डब्ल्यू कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैंइस प्रोटोकॉल ithin। सबसे पहले, zebrafish दिलों की आवश्यकता होती है, जिसके लिए प्रयोग पर निर्भर करता है, यह रक्त कोशिकाओं से जितना संभव हो उतना दिलों कुल्ला करने के लिए महत्वपूर्ण है। रक्त कोशिकाओं को हटाने से लाभ होगा कि प्रयोगों के उदाहरण रक्त की उपस्थिति जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल परिवर्तन, या रक्त कोशिकाओं मायोकार्डियल कोशिकाओं से सॉर्ट करने के लिए मुश्किल हो सकता है, जहां छँटाई FACS के लिए होगा जहां शाही सेना Seq, के लिए दिल की वसूली भी शामिल है। मछली Tricaine या बर्फ के साथ euthanized है, के बाद इसे जल्दी से मछली सिर काटना और अतिरिक्त रक्त के दिल छुटकारा में मदद करने के लिए होते हैं खून बह रहा है की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अक्षुण्ण दिल की योजना बनाई प्रयोग के लिए आवश्यक नहीं है, तो यह पीबीएस में आगे खून बाहर कुल्ला करने के लिए जब अलिंद में कटौती और खुले वेंट्रिकल के लिए उपयोगी हो सकता है। आरबीसी lysis बफर भी बजाय पीबीएस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
उपरोक्त के रूप में दूसरा, कभी-कभी दिल बल्कि सिर से जुड़ी रहने से छाती पर का कवच पंख से एक के साथ उतर आता है। इसलिए, छाती पर का कवच पंख खींचखुर्दबीन के नीचे बंद दिल पहचाना जा सकता है। दूर पेरीकार्डियम आसपास से हृदय विदारक अंत में, जब दिल ही काबू करने की कोशिश नहीं की; इसके बजाय, पेरीकार्डियम के दो टुकड़े समझ और नाज़ुक पेरीकार्डियम से अधिक संरचनात्मक अखंडता है जो दिल से दूर उन दोनों को खींच। इस तरह, दिल के लिए भी कम से कम नुकसान से बचा जा सकता है।
दिल अपने आकार और संकुचन से आसानी से पहचाना जाना चाहिए। दिल को खोजने में एक अतिरिक्त सहायता के रूप में, एक एक प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त एक दिल काटना कर सकते हैं। यह आमतौर पर की जरूरत नहीं है, लेकिन शुरुआती के लिए और / या बहुत छोटे दिल के dissections के लिए उपयोगी हो सकता है।
इस तकनीक की एक सीमा छोटी मछली, यानी, छोटे से तीन सप्ताह पुरानी से दिलों विदारक, मुश्किल यह है कि; अन्य तकनीकों के लार्वा dissections के 9 के लिए डिजाइन किया गया है। यह आसान है, जबकि इसके अलावा, कन्द एक टुकड़े करनाएक दूसरे से rteriosus, आलिंद, और निलय, यह अपने आप ही अलिंदनिलय संबंधी वाल्व टुकड़े करना संभव नहीं है। वाल्व ज्यादातर मामलों में निलय के साथ जुड़ा रहता।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
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