Abstract
El uso del sistema de modelo de pez cebra para estudiar el desarrollo, la regeneración, y la enfermedad se está expandiendo hacia el uso de los corazones adultos para disociación celular y purificación de ARN, ADN y proteínas. Todas estas aplicaciones exigen la rápida recuperación de un número significativo de los corazones de pez cebra para evitar gen regulador, metabólicos y otros cambios que comienzan después de la muerte. También se requieren adultos corazones de pez cebra para el estudio de la estructura del corazón para una variedad de mutantes y para el estudio de la regeneración del corazón. Sin embargo, la disección corazón del pez cebra tradicional es lenta y difícil y requiere herramientas especializadas, haciendo la disección a gran escala de corazones de pez cebra adultos tedioso. Los métodos tradicionales también albergan el riesgo de dañar el corazón durante la disección. Aquí se describe un método para la disección de corazones adultos de pez cebra que es rápido, reproducible, y preserva la arquitectura del corazón. Además, este método no requiere herramientas especializadas, es indoloro para el pez cebra,se pueden realizar en muestras frescas o fijos, y se puede realizar en el pez cebra de tan sólo un mes de edad. El enfoque descrito se expande el uso de adultos de pez cebra para la investigación cardiovascular.
Protocol
NOTA: Asegúrese siempre de que la aprobación del IACUC o el comité de ética está en su lugar antes de comenzar cualquier procedimiento experimental utilizando el pez cebra.
1. Preparar reactivos y configuración
- Preparar las siguientes soluciones. Encuentra las recetas de todas estas soluciones en los manuales estándar de pez cebra 10.
- 500 ml de agua del huevo
- 200 ml de 0,03% tricaína en Egg Agua
- 100 ml de tamponada con fosfato salino (PBS 1x)
- RBC tampón de lisis (opcional)
- Búfer de destino de elección (fijador, Trizol, PBS, etc.) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en hielo
NOTA: Fijador y Trizol son tóxicos si entran en contacto con la piel. Use guantes para manipular estas sustancias.
- Preparar configuración disección:
- Coloque la fuente de luz de cuello de cisne sobre el microscopio de disección. Coloque la tapa de una placa de Petri de 9 cm en la platina del microscopio de disección, y se vierte una capa delgada de 1x PBS enella (la tapa se utiliza porque el plato en sí es demasiado profunda para una disección fácil).
- Coloque la propia placa de Petri (no la tapa) en la encimera cerca del microscopio de disección y vierta aproximadamente 15 ml de PBS 1x en ella. Use esto para lavar el corazón después de la disección. Como alternativa, utilice tampón de lisis RBC.
- Hoja de afeitar Place, dos pares de pinzas, microtijeras (opcional), y una pipeta de transferencia al lado de la microscopio. Obtener un recipiente con hielo si se elige la eutanasia por enfriamiento rápido.
- Vierta 200 ml de 0,03% tricaína en Egg agua en un vaso de vidrio de 250 ml si se elige la eutanasia por tricaína. Preparar una pequeña bolsa de riesgo biológico para la eliminación de cadáveres de pez cebra.
2. Prepare Pez Cebra
- Para los peces fijo, traer peces fijo, se enjuagan en PBS, a la configuración de microscopio.
- La eutanasia a todo el pez cebra adulto de un rápido enfriamiento con hielo durante> 10 min.
- El uso de fórceps para hacer un agujero en la piel sobre el peritoneo(Lejos del corazón) para ayudar a la penetración del fijador, y luego ponerlos en paraformaldehído al 4% en Fix Buffer 10 durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
- Alternativamente, para el pescado fresco, pescado lugar a ser sacrificado en un pequeño tanque de retención y traer a la configuración de microscopio. Dependiendo del protocolo de peces de la instalación individual y los usos posteriores de los corazones de peces disecados, anestesiar pescado con tricaína o la eutanasia de un enfriamiento rápido antes de la decapitación.
- Para utilizar hielo, recoger un pez con la red de pesca y el lugar en agua helada hasta que el pescado deja de moverse, aproximadamente 5 minutos.
- Como alternativa, utilizar tricaína, coger un pez con la red de pesca y el lugar en el vaso de la solución hasta que los movimientos de enmalle se detienen.
- Rápidamente recoger los peces sacrificados por su aleta de la cola y lo pondré sobre su lado en la cubierta placa de Petri que estaba lleno de PBS 1x. Utilice las pinzas para levantar una aleta pectoral con una mano, mientras que con el razocuchilla r para decapitar a los peces con la otra mano, justo posterior a la fijación de la aleta pectoral (Figura 1A). Realice este paso mirando por el microscopio o simplemente visualizar directamente el pescado sobre la platina del microscopio.
NOTA: Pescados recién sacrificados todavía sangran después de la decapitación.
Figura 1. disección corazón adulto pez cebra utiliza referencias anatómicas de pez cebra. (A) para decapitar a los peces, levante la aleta pectoral con una pinza y utilizar una hoja de afeitar limpia agudo a lo largo de la línea de puntos de color rojo, como se muestra. (B) Para estabilizar la cabeza de pescado, coloque una púa de la pinza en la boca de pescado, mientras que el otro diente miente a través del ojo, y luego gire la cabeza de pescado para que la superficie ventral es y ambas puntas de la pinza son estables frente a la parte inferior de la placa de Petri. (C) Utilice el forc gratiseps para cortar el apego del opérculo (flecha). (D) de elevación de esto, la aorta dorsal es visible como una estructura blanca con una raya rosada denota sangre luminal (flecha). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Disección del Corazón
- Visualice la cabeza de pescado bajo el microscopio. Con uno fórceps, estabilizar la cabeza de pescado mediante la colocación de una púa de la pinza en la boca de pescado, a través del cerebro, mientras que el otro diente está fuera de la cabeza, a través del ojo (Figura 1B). Asegúrese de que ambas puntas de las pinzas son estables contra la parte inferior de la placa de Petri. La celebración de la cabeza de pescado de esta manera, su superficie ventral debe estar mirando hacia arriba.
- Con la otra mano, utilizar los segundo fórceps para cortar el enganche ventral del opérculo al cuerpo (flecha, Figura 1C). Esta elevación ligeramente con las pinzas, la dOrsal aorta aparecerá debajo, como una estructura de color blanco con una franja roja de la sangre en la luz aórtica (flecha, Figura 1D). Cortar la aorta dorsal con las pinzas por pellizcar la aorta y tirando hacia arriba; alternativamente, utilizar microtijeras para cortar la aorta dorsal.
- Ahora, usa los segundos pinzas para agarrar la aleta pectoral de su base, incluyendo el cartílago del cuerpo en la base de la aleta, y levantar esto. Repita con la otra aleta pectoral. En ocasiones, el corazón sale con las aletas pectorales, por lo que examinar estas piezas para asegurarse de que el corazón no está conectado antes de desecharlos.
NOTA: En este punto, el corazón debe ser visible, sigue intacto y conectado a la cabeza de pescado restante (aunque en ocasiones se corre con las aletas pectorales). El corazón puede ser identificado por su forma, su color rosa, y su ser rodeado por el pericardio pigmentada. Debido a la eutanasia de los peces se realiza de forma rápida, corazones pescado recién sacrificados todavía puede ser vencer sloWLY. - Dejar de lado la cabeza de pescado con los primeros fórceps, de modo que ambas manos sostienen fórceps y son gratuitos. Use las dos pinzas para embromar el corazón lejos del pericardio. Agarre el corazón por el resto de la aorta dorsal, mientras que el pericardio restante se apartó.
NOTA: Ya sea fijo o fresco, el corazón es robusto a suave tirando mientras el tejido conectivo que rodea es más friable. Por lo tanto, cualquier tejido pericárdico circundante puede ser disecado de distancia con el corazón intacto restante. - Deseche la canal pescado sobrante en la bolsa de riesgo biológico.
4. Preparar el Corazón para aplicaciones posteriores
- Con unas pinzas, agarre el corazón por el borde de la aorta dorsal / bulbo arterioso y poner el corazón en el plato fresco de 1x PBS. También puede utilizar una pipeta de transferencia. Mover el corazón de ida y vuelta en la PBS sobre 10x para lavar tanta sangre como sea posible.
- Para aplicaciones en las que es importante para eliminar todo possibglóbulos le, se lavan en una placa de Petri de 9 cm con 15 ml de tampón de lisis RBC en lugar de PBS, con el mismo movimiento hacia atrás y hacia adelante. Si la preservación de la estructura del corazón no es importante para la aplicación de aguas abajo (por ejemplo, haciendo RNA), utilizar los fórceps o micro tijeras para abrir la cavidad del corazón y facilitar el aclarado de distancia de células sanguíneas.
- Para aplicaciones en las que se desean cámaras del corazón separadas, el uso de fórceps o microtijeras para diseccionar la arterioso bulbus, atrio, ventrículo y separados unos de otros.
- Transferir el corazón, o cámaras separadas, a la memoria intermedia de destino en hielo.
NOTA: los destinos comunes incluyen tampones de disociación celular, el 4% de paraformaldehído, o Trizol.
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Representative Results
Usando este método, un corazón del pez cebra adulto puede ser diseccionado en menos de 1 min, en comparación con más de 5 min usando métodos tradicionales 8. Corazones disecados utilizando este método son de forma fiable intacta (Figura 2A), mientras que los métodos tradicionales requieren el corte de 8 a ciegas en el pericardio y por lo tanto comúnmente causar daños o pérdida de la aurícula o bulbus arterioso (Figura 2B). Corazones disecados mantienen su integridad estructural y son adecuados para la histología (Figura 2C), microscopía electrónica (Figura 2D), así como para aplicaciones en las que el corazón se disocia o pulverizado. En nuestras manos, a partir de una disección de 50 corazones en el transcurso de los experimentos de una semana, 50 corazones se obtuvieron estructuralmente intacto. También nos enseña esta técnica a un colega en el laboratorio que no tenía experiencia con la disección del pez cebra. 9 de 9 corazones disecados por el colega principiante también eran estrucralmente intacta. Este método de disección es adecuado para los menores mayores de 1 mes de edad, y para los adultos de todas las edades.
Figura 2. disecado corazones están intactos y mantener la integridad arquitectónica. (A) En menos de 1 minuto, un corazón del pez cebra adulto con un atrio intacto (A), ventrículo (V), y arterioso bulbus (BA) puede extraerse del pescado sacrificados. (B) de adultos tradicional disección del corazón del pez cebra tardan más e incluso cuando se tiene cuidado, correr el riesgo de daños. Aquí, sólo el ventrículo está intacto. (C) Un corazón disecado de una Tg (myl7 dsRed) peces adultos mantiene su integridad estructural para su uso en histología. El atrio (A), ventrículo (V), y arterioso bulbus (BA) se ven, y las estructuras aún más pequeñas, como la válvula auriculoventricular (AV, flecha) y el tracto de salida (OFT, flecha) están intactas. (D) </ Strong> La microscopía electrónica de una de tipo salvaje adulto corazón disecado muestra que sarcómeros sufrirán ningún daño por el proceso de disección. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque se han descrito métodos para la disección de la corazón del pez cebra adultos, estos métodos eran mucho tiempo y comúnmente causaron daños al corazón durante la disección. Para llevar a cabo experimentos en los que puede ser necesario un gran número de corazones adultos, y / o al evitar la degradación del tejido del corazón es importante para aplicaciones posteriores, el tiempo requerido usando técnicas de disección tradicionales es prohibitivo. Del mismo modo, la obtención reproducible en buen estado, corazones intactos es importante para el estudio de la estructura del corazón y de los métodos de inmunohistoquímica y microscopía. Encontramos que incluso en manos de principiantes, el 100% de los corazones disecados fueron recuperados estructuralmente intacta. En general, el método para la disección corazón adulto se presenta aquí presenta un avance en la técnica que se expande el uso de adultos de pez cebra para una variedad de aplicaciones actuales y futuras, incluyendo el uso en lesiones del corazón y los experimentos de regeneración.
Hay varios pasos críticos wentro de este protocolo. En primer lugar, dependiendo del experimento para el que se requiere que los corazones de pez cebra, es importante para enjuagar corazones tanto como sea posible a partir de células de la sangre. Los ejemplos de los experimentos que se beneficiarían de la eliminación de las células de sangre incluyen la recuperación de corazones para RNA-Seq, donde la presencia de la sangre va a alterar los perfiles de expresión génica, o para FACS clasificación, donde las células sanguíneas pueden ser difíciles de resolver a partir de células del miocardio. Después de que el pescado es sacrificado con tricaína o hielo, es importante para decapitar a los peces rápidamente y permitir que se produzca el sangrado para ayudar a liberar el corazón de exceso de sangre. Si no se requiere un corazón intacto para el experimento planificada, puede ser útil para cortar la aurícula y el ventrículo abierto cuando en PBS para enjuagar más lejos la sangre. Tampón de lisis RBC también se puede utilizar en lugar de PBS.
En segundo lugar, como se mencionó anteriormente, de vez en cuando el corazón se corre con una de las aletas pectorales en lugar de permanecer unido a la cabeza. Por lo tanto, tirar de las aletas pectoralesfuera bajo el microscopio para que el corazón pueda ser identificado. Finalmente, cuando la disección del corazón lejos de pericardio rodea, trate de no comprender el propio corazón; en cambio, comprender dos piezas de pericardio y tirar de ellos, tanto desde el corazón, que tiene más integridad estructural que el pericardio friable. De esta manera, incluso el mínimo daño al corazón puede ser evitado.
El corazón debe ser fácilmente identificable por su forma y contracciones. Como una ayuda adicional en encontrar el corazón, se puede diseccionar un corazón que expresa una proteína fluorescente bajo un microscopio de disección de fluorescencia. Esto generalmente no es necesario, pero puede ser útil para los principiantes y / o para las disecciones de muy pequeños corazones.
Una limitación de esta técnica es que la disección de corazones de peces pequeños, es decir, menores de 3 semanas de edad, es difícil; otras técnicas han sido diseñados para las disecciones de larvas 9. Además, mientras que es fácil de diseccionar el bulbus unarteriosus, atrio, ventrículo y el uno del otro, no es posible diseccionar la válvula atrioventricular por su cuenta. La válvula permanece unido al ventrículo en la mayoría de los casos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small tank for transporting fish | Aquaneering | ZHCT100 | |
| Fish net | Petsmart | 36-16731 | |
| 250 ml glass beaker | Kimble | 14005-250 | |
| 9 cm polystyrene Petri dish | Nunc | 172958 | |
| Razor blade | Personna American Safety Razor Company | 94-120-71 | |
| 2 Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | |
| Plastic transfer pipette | Thermo Scientific | 202-20S | |
| Gooseneck light source | Dolan-Jenner Industries, Inc | Fiber-Lite 180 Illuminator, 181 Dual Gooseneck System | |
| Fluorescent light source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | optional |
| Micro-scissors | Biomedical Research Instruments, Inc | 11-1000 | optional |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | optional |
References
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- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. 55, (2011).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
