Intubasjon-mediert intratrakeal (IMIT) instillasjon av reagenser er et utmerket, ikke-invasiv metode for å studere luftveissykdom, så vel som en fremgangsmåte for instilling terapeutiske reagenser direkte inn i lungen. Dette er en hurtig og meget reproduserbar metode som er egnet for preklinisk testing.
Luftveissykdom studier involverer typisk bruken av murine modeller som surrogat systemer. Men det er betydelige fysiologiske forskjeller mellom mus og menneske respiratoriske systemer, spesielt i de øvre luftveier (URT). I noen modeller kan disse forskjellene i murine nesehulen har en betydelig innvirkning på sykdomsutvikling og presentasjon i nedre luftveier (LRT) ved bruk av intranasal innføring teknikker, potensielt begrense nytten av musemodell for å studere disse sykdommene. Av disse grunner ville det være fordelaktig å utvikle en teknikk for å innpode bakterier direkte inn i muselunger for å studere LRT sykdommen i fravær av involvering av URT. Vi har kalt denne lunge bestemt levering teknikk intubasjon-mediert intratrakeal (IMIT) drypping. Denne ikke-invasiv teknikk reduserer faren for drypping i blodet, noe som kan forekomme i løpet av mer invasive traditional kirurgiske intratrakeal infeksjon tilnærminger, og begrenser muligheten for tilfeldige fordøyelseskanalen levering. IMIT er en to-trinns prosess hvori mus blir først intubert med et mellomliggende trinn for å sikre korrekt innsetting av kateter inn i luftrøret, etterfulgt av innføring av en butt nål inn i kateteret for å mediere direkte levering av bakterier inn i lungen. Denne tilnærmingen muliggjør en> 98% effektivitet for levering til lungene med utmerket fordeling av reagens gjennom hele lungen. Således representerer IMIT en ny tilnærming for å studere LRT sykdom og terapeutisk levering direkte inn i lungene, ved å forbedre evnen til å bruke mus som surrogater for å studere humant respiratorisk sykdom. Videre gjør nøyaktigheten og reproduserbarheten av denne avgivelsessystemet også det mottagelig til god laboratoriepraksis Standards (GLPS), samt levering av et bredt utvalg av reagenser som krever høy effektivitet levering til lungen.
Mus har blitt brukt til å modellere flere humane sykdomsmanifestasjoner, inkludert en myriade av luftveissykdommer. Surrogat sykdomsmodeller er ofte ute av stand til å rekapitulere alle aspekter av et modellerte sykdom, vanligvis på grunn av viktige fysiologiske eller immun forskjeller i de to verts modeller. Dermed er et mål om å forbedre modellsystemer for å utvikle metoder som gjør at surrogater å nærmere gjenspeile en sykdomsprosess eller vert respons som observert i den opprinnelige vertssystemet. Det er flere viktige fysiologiske forskjeller mellom mus og mennesker i mekanismen som stimulerer til de luft. Inkludert i disse forskjellene er betydelige Proporsjonellekspansjon forskjeller i størrelse mellom URT og LRT. Det har blitt anslått at mus har> 100 brett URT flateareal i forhold til mennesker, normalisert mot total lungekapasitet 1,2. Dermed nesemusling av musen tillate mer omfattende filtrering av inspirert luft til rette for en mye større hastighet på breathing, som kan ha en betydelig innvirkning på studier av lungebetennelse hvis infeksjon i nesehulen spiller en betydelig rolle i sykdomsprogresjon.
Flere forskjellige fremgangsmåter har vært anvendt for å innpode bakterier i lungene av mus for å undersøke human-lignende luftveissykdom. Den mest vanlige av disse metodene er intranasal inokulering, hvori en flytende suspensjon påføres på en eller begge nesebor av en mus. Mens relativt enkel, advarsler som drypping volum og type anestesi brukes kan påvirke effektiviteten av drypping inn i LRT via intranasal vaksine 3-5. Nærmere bestemt, Miller et al. har vist at intranasal instillasjon av Francisella tularensis i volum mindre enn 50 ul resulterte ikke i instillasjon av bakteriene inn i LRT 6. De videre observert bedre LRT drypping når du bruker inhalert isofluran i motsetning til injisert ketamin / xylazin for anestesi. Men vår experience med Yersinia pestis intranasal inokulering indikerer mer konsistent inokulering kan oppnås ved hjelp av ketamin / xylazin sammenlignet med isofluran (MBL, upubliserte data). Disse forskjellene kan skyldes patogene brukt eller variasjoner i laboratorieprosedyrer, men viktigere markere potensialet variabilitet i denne teknikk. Videre lungene tatt kort tid etter intranasal instillasjon viser at en forholdsvis lav prosentandel av den innledende bakteriepodestoff når frem til lungene (i tilfelle av Y. pestis, ble bare 10% gjenvunnet 1 time etter instillasjon 7), noe som tyder på at et stort antall bakterier kunne bibeholdes i URT (eller svelget inn i mage-tarmkanalen). I visse sykdomsmodeller, kan dette betydelig avsetning av bakterier på slimhinner URT forvirre vår forståelse av sykdomsprogresjon dersom organismen er i stand til å kolonisere det murine nesehulen på en måte som er uforenlig med den humane sykdommen. For eksempel bruker in vivo </ Em> avbildning, har det blitt observert at Burkholderia pseudomallei, som ikke kolonisere humant URT, fører til en overveldende opportunistisk infeksjon av det murine nesehulen når levert ved intranasal instillasjon metoden 8.
Andre fremgangsmåter for instilling bakterier i lungene av mus har også vært anvendt i infeksjonssykdom forskning. Men sammenlignet med intranasal innføring disse metodene har en tendens til å kreve mer teknisk kompetanse og / eller dyrt utstyr uten å eliminere faren for infeksjon initiering på flere steder (f.eks aerosol [URT og LRT]; transoral [fordøyelseskanalen og LRT]; og kirurgisk intratrakeal [LRT og blodstrøm]). Gitt de potensielle komplikasjoner som kan være forbundet med sekundære områder av infeksjon, forsøkte vi å utvikle en intratrakeal tilnærming som omgår URT og leverer patogen direkte inn i lungene av bedøvede mus, men også begrenser utilsiktet inoculatIon inn i blodstrømmen eller mage-tarmkanalen. Mot dette formål, ble intubasjon-mediert intratrakeal (IMIT) drypping utviklet som en nonsurgical prosedyre som garanterer LRT drypping av inoculum ved å inkludere et mellomtrinn for å verifisere korrekt plassering av kateter før drypping. Denne metode er beskrevet ved bruk av fargestoff instillasjon for visuelt å demonstrere bred fordeling av inokulumet over hele lungen, og P. aeruginosa instillasjon for å demonstrere den meget effektive produksjonstid (> 98% av inokulum) av denne fremgangsmåte til lungen. Viktigere, mens opprinnelig utviklet for bakteriell levering, IMIT tilbyr også et effektivt verktøy for: i) drypping av ulike molekyler for studiet av andre respiratoriske sykdomsmodeller, ii) lunge-spesifikke terapeutiske levering, og iii) grunnleggende lungefunksjons studier, inkludert målrettet siRNA levering til lungen.
IMIT instillasjon tilbyr viktige forbedringer av eksisterende luftveissykdomsmodeller i evnen til å innpode reproduserbart reagenser direkte inn i lungen. Det er en rask tilnærming som har en ideell beliggenhet for et team av to forskere, hvorav den ene styrer logistikken av anestesi og caging, og den andre som utfører IMIT teknikk. Store studier kan gjennomføres ved hjelp av IMIT med en gjennomsnittlig tidsbruk på 2 – 3 min per mus. Fordi tilnærming gjør bruk av isofluran som et bedøvelsesmiddel, mus gjenopprette raskt fra bedøvelsen, og reduserer tiden for å overvåke driften dyr gjennom utvinning.
Den mest teknisk utfordrende aspekt ved IMIT metoden er den første trinn av intubasjon mus. Enkeltpersoner lære å utføre IMIT er i stand til å fokusere på dette første trinnet av kateteriseringen og sikre at intubering er oppnådd gjennom visuell bekreftelse av fargestoff bevegelse. Fordelen med metoden er at lunge-specific instillasjon garanteres ved bruk av bekreftelse av intubasjon, som øker tilliten til både den nye forsker, så vel som den sakkyndige forsøker å intubere en vanskelig dyr. De viktigste elementer av optimalisere sannsynligheten for en vellykket intubasjon er: i) å oppnå en dyp sedasjon for å tillate tilstrekkelig arbeidstid, ii) riktig plassering av spekulum i munnen for å tillate god visualisering av epiglottis, iii) god dybde plassering av spekulum slik at tungen forblir tilbaketrukket under hele prosedyren, og iv) bruk av vippeplattformen til å understøtte forskernes hender, slik at fremgangsmåten blir utført avslappet og med en jevn tilnærming.
En av begrensningene til IMIT prosedyren er relatert til hyppigheten av IMIT drypping hendelser. På grunn av den potensielle traumer knyttet til en savnet intubasjon, er det ikke anbefalt at mer enn to intubasjon forsøk gjennomføres i en enkelt økt (opp til to meteren). IMIThar en utmerket potensial i sin evne til å bli brukt for å levere terapeutiske midler inn i den murine lunge, kan imidlertid terapeutiske regimer som gjør bruk av meget hyppig levering av reagens inn i lungen ikke være egnet for IMIT. Det kan være mulig at IMIT kunne brukes daglig for å levere reagenser inn en muse lunge uten å forårsake betydelige traumer, men bare når utført av en meget dyktig forsker, som de fleste av traumer i forbindelse med intubasjon er tenkt å være forbundet med en savnet intubasjon event . Slike høyfrekvente IMIT bør diskuteres med lokale veterinærer og IACUC.
En ytterligere potensiell begrensning av IMIT er størrelsen av mus som blir intubert. Den IMIT fremgangsmåten beskrevet ovenfor ble utviklet ved bruk av mus av ca. 17-22 g, der en 20 G kateter ble funnet å være en egnet størrelse for trakea hos mus i dette størrelsesområdet. Større katetre har blitt brukt i eldre mus; den første utviklingen av IMIT made anvendelse av en 18 G kateter i BALB / c mus som er> 20 g. Viktigere, hvis alternative kateter størrelser blir brukt, sløve nåler bør være hentet som passer lumen av kateteret, og er trimmet til en lengde som strekker seg bare 1 mm utover kateterspissen. Intubasjon av mus mindre enn 17 g kan være mulig, men anbefales ikke på grunn av den kompetansen som kreves, og vil kreve bruk av mindre kateter og spekulum enn det som er beskrevet ovenfor.
Vi har benyttet IMIT for levering av en rekke respiratoriske patogener i tillegg til P. aeruginosa, inkludert B. pseudomallei 9 og Klebsiella pneumoniae 10. Den IMIT modellen har gjort viktige fremskritt i våre studier av B. pseudomallei luftveissykdom, etter å ha identifisert at intranasal vaksine fører til en tidlig, URT relatert sykelighet av mus i stedet for systemisk sykdom endepunkt observert i menneskelig sykdom 9. B. pseudomallei er en Tier 1 select agent for biodefense innvirkning, og som sådan, respiratoriske sykdomsmodeller blir utviklet for aerosoleksponering hvilke modeller en potensiell biodefense relatert svei ved weaponized patogener. Fordi dagens spray modeller føre til infeksjon av både URT og LRT, de samme potensielle tidlig sykelighet fenotyper vi har identifisert for intranasal modell av B. pseudomallei luftveissykdom kan gjelde for aerosol-modellen. En fremtidig tilpasning av IMIT modellen kan være en intubasjon-mediert aerosolavlevering (imad), hvori mus blir intubert for target aerosol levering bare inn i lungen. Mekaniske ventilatorer er for tiden tilgjengelig for å opprettholde isofluran anestesi, som kan være innrettet til å levere en aerosolisert, snarere enn væskebasert, patogen utfordring.
IMIT opprinnelig ble utviklet som en tilnærming for å optimalisere levering av bakterier til lungen, men kan også anvendes for levering av andre reagenser inn i muselunge. Som diser diskutert ovenfor, intranasal levering av forbindelsene til mus resulterer i en lav virkningsgrad, sterkt variabel levering av reagenser inn i målorganet av lungen. Intranasal levering av Positron Emission Tomography (PET) bildebehandlings reagenser til murine lunge ga en 40% leveringsdyktighet 11, mens vi har vist at IMIT tilbyr et utmerket alternativ til andre lunge levering tilnærminger med sitt> 98% levering effekt og Multilobær distribusjon. Denne forbedring i målrettet levering til lungen har potensial til å øke reproduserbarheten av terapeutisk levering for behandling av pulmonal sykdom. IMIT kan likeledes gi fordeler til studier av: i) virkningen av miljølunge irritanter, ii) lungekreft fenotypiske studier, iii) lunge-spesifikke siRNA knock-down.
The authors have nothing to disclose.
The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
I.V. Catheter, 20G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface |
Gas tight syringe, 250ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
Blunt Needle, 22G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter |
Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
Tuberculin syringe, 1ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
Male luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
Female luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
Sample bag, 1oz | Whirl-Pak | B01067 | |
U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |