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Medicine

挿管媒介気管内(IMIT)点眼:非侵襲的、肺特異的送達システム

doi: 10.3791/52261 Published: November 17, 2014

Summary

試薬の挿管媒介気管内(IMIT)点滴は、呼吸器疾患を研究するための優れた、非侵襲的な方法だけでな​​く、肺に直接治療薬を浸透させるための方法である。これは前臨床試験のために適して迅速かつ高度に再現可能な方法である。

Abstract

呼吸器疾患の研究は、典型的には、サロゲートシステムなどのマウスモデルの使用を含む。しかし、マウスおよびヒトの呼吸器系との間に有意な生理学的な相違は、特にその上部気道(URT)である。鼻腔内点滴注入法を使用する場合にいくつかのモデルでは、マウスの鼻腔内でこれらの差異は、潜在的にこれらの疾患を研究するためにマウスモデルの有用性を制限し、下気道(LRT)の疾患進行とプレゼンテーションに大きな影響を持つことができる。これらの理由から、URTの関与が存在しない場合にLRT疾患を研究するためにマウスの肺に直接細菌を植え付けるための技術を開発することが有利であろう。我々は、この肺特異的送達技術挿管媒介気管内(IMIT)点滴と呼ばれている。この非侵襲的手法は、より侵襲traditi中に発生する可能性が血流の中に点滴注入の可能性を最小限に抑える角項外科気管内感染のアプローチ、および付随的消化管の配信の可能性を制限します。 IMIT最初に肺に細菌の直接送達を媒介するためにカテーテルに鈍針を挿入した気管内に適切なカテーテル配置を確保するために中間段階で、挿管されたマウスでは、二段階プロセスである。このアプローチは、肺全体に試薬の優れた分布と、肺に配達の> 98%の有効性を容易にします。したがって、IMITは、人間の呼吸器疾患を研究するためのサロゲートとしてマウスを使用する能力に改善し、肺に直接LRT疾患や治療的送達を研究するための新規なアプローチを表しています。さらに、この送達システムの精度および再現性は、また、安全性試験実施基準(GLPS)の影響を受けやすいだけでなく、肺への高効率送達を必要とする試薬の広い範囲の配達になる。

Introduction

マウスは、呼吸器疾患の無数を含む多数のヒトの疾患の症状をモデル化するために使用されている。サロゲート疾患モデルは、一般的に、多くの場合、重要な生理学的または2つのホストモデルでの免疫の違いによるモデル化された疾患のすべての側面を再現することはできません。このように、モデルシステムの改善の目的は、元のホストシステムで観察されるような代用物は、より密接に、疾患プロセス又は宿主応答をミラーリングを可能にするアプローチを開発することである。彼らは空気を鼓舞するためのメカニズムでマウスとヒトの間でいくつかの重要な生理的な違いがあります。 URTとLRTの間のサイズの大幅なレシオメトリックな違いは、これらの違いに含まれる。それは、マウスは> 100総肺容量1,2に対して正規のヒトへURT表面積を相対的に、折る有することが推定されている。このように、マウスの鼻甲介はbreathiのはるかに大きな割合を容易にするためのインスピレーションの空気のより広範なフィルタリングを可能に鼻腔の感染が疾患の進行に重要な役割を果たしている場合ngが、肺炎の研究に大きな影響を有していてもよい。

いくつかの異なるアプローチが人間のような呼吸器疾患を研究するためにマウスの肺に細菌を植え付けるために使用されてきた。これらのアプローチの最も一般的なものは、液体懸濁液をマウスの一方または両方の鼻孔に適用される鼻腔内接種である。比較的単純ながら、そのような鼻腔内接種3-5を経由して、LRTに点滴の効率に影響を与える可能性が使用される全身麻酔の点眼量や種類などの注意点。具体的にはMiller 50未満μlをLRT 6内に細菌の点滴には至らなかったボリュームで野兎病菌の鼻腔内点滴注入を示している。吸入イソフルランを使用する際に麻酔用注射さケタミン/キシラジンとは対照的に、彼らは、さらに優れたLRTの点滴を観察した。しかし、私たちの経験豊富ペスト菌の鼻腔内接種された電子は、イソフルラン(MBL、未発表データ)と比較して、より一貫した接種はケタミン/キシラジンを用いて達成することができることを示します。これらの違いは、使用される病原体や実験手順のばらつきに起因しますが、重要なのは、この技術の潜在的な変動性を強調することができた。さらに、初期の細菌接種の比較的低い割合が肺に達したことを鼻腔内点滴注入のショーの後まもなく収穫肺の細菌が多数いることを示唆している、( ペスト菌の場合は、わずか10%が点眼7の1時間後に回収した) URTに保持(または胃腸管に飲み込ま)することができた。生物は、ヒト疾患と矛盾した方法でマウスの鼻腔コロニー形成することができる場合、特定の疾患モデルでは、URT粘膜上の細菌のこの重要な堆積は、疾患進行の理解を混乱させることができる。例えば、 生体内で使用して</全角>をイメージングは、それが鼻腔内点滴注入法8により送達された場合に、人間のURTにコロニーを形成しない疽菌は 、マウスの鼻腔の圧倒的な日和見感染を引き起こすことが観察されている。

マウスの肺に細菌を浸透させるための他の方法はまた、感染症の研究に用いられてきた。経口的[消化管とLRT];しかし、鼻腔内点滴注入に比べ、これらの方法は、複数の部位( 例えば 、エアゾール[URTおよびLRT]で感染開始の可能性を排除することなく、より多くの技術的な専門知識および/ ​​または高価な装置を必要とする傾向があり、外科的気管内[LRTと血流])。感染のセカンダリサイトに関連付けることができた潜在的な合併症を考えると、我々はURTをバイパスし、直接麻酔したマウスの肺に病原体を提供し、気管内アプローチを開発しようとしただけでなく、不注意inoculatを制限血流または胃腸管へイオンを打ち込む。この終わりに向かって、挿管媒介気管内(IMIT)点滴前点滴に適切なカテーテル留置を確認するために中間ステップを含めることによって、接種材料のLRT点滴を保証非外科的手順として開発されました。この方法は、視覚的に、肺全体に接種物の広い分布を実証し、P.、染料点滴を用いて説明する肺へのこの方法の非常に有効配信を実証する緑膿菌点滴(接種材料の> 98%)。他の呼吸器疾患モデルの研究のための様々な分子のⅰ)点滴、ⅱ)肺特異的治療的送達、およびターゲットを含むⅲ)基本的な肺機能の研究、:もともと細菌送達のために開発しながら、重要なこと、IMITものための効果的なツールを提供しています肺へのsiRNA送達。

Protocol

注:ここで説明する手順のすべてが見直され、大学、ルイビルの制度バイオセーフティ委員会(プロトコル#13から056)と、施設内動物管理使用委員会(プロトコル#13から064)によって承認された。

染料の調製

  1. 0.45μMのシリンジフィルターを用いて滅菌PBSクマシーブリリアントブルー及びフィルタ(w / v)の0.1%に希釈する。

緑膿菌文化の調製

  1. 15時間点滴の前に、単一の細菌コロニーをブロス培養の3ミリリットルを接種する。
  2. シェーカー(200 rpm)の上で37℃で培養する15時間を育てる。
  3. 遠心分離機30秒1.5mlマイクロチューブ12000×gの中の文化の1ミリリットル。
  4. 培地を除去し、PBS 1ml中ペレットを再懸濁。
  5. PBS中の細菌ストック懸濁液1:10アリコートを希釈し、決定するために、希釈した細菌懸濁液のOD 600を測定する細菌濃度。
  6. IMIT接種のために50μlの配信ボリュームを使用して、細菌接種の所望の濃度にPBS中の細菌ストック懸濁液を希釈する。

3. IMIT点眼

  1. イソフルラン麻酔導入チャンバーにマウスの群を配置し、2を用いた麻酔 - 3%イソフルラン/酸素混合物を。
  2. 鎮静の初期開始時に、直立マウスを保持し、マウスを首筋、そして喉の奥まで強制経口投与針によって2%リドカイン溶液10μlを投与し、その溶液がダウン喉頭蓋へ排出させる。麻酔室にマウスを返します。
    1. 局所麻酔薬としての完全な効果を取るためにリドカインを可能にするために、5分間の最小値を許可します。
  3. マウスは鎮静の所望のレベル(〜60 BPMの呼吸数)を達成したら、鎮静を維持するために、2%イソフルランを減らす。
  4. 250μlの気密に染料または細菌接種をプリロード22 Gの長い鈍針付き精密シリンジフィット。
    1. 第1のシリンジのテフロンプランジャによって測定された空気を150μlを、策定。次に、注射器本体に200μlのマークに150μlのマークからテフロンプランジャーを前進させることによって、接種物50μlのを策定。
      注:サンプルは挿管マウスに排出されると、50μlの懸濁液は、肺全体に接種物を配布します150μlのエアクッションが続き、最初に配信されます。
  5. 誘導室から一匹のマウスを取り外し、挿管プラットフォーム上で仰臥横たわっていた。マジックテープに付着したOリングとの切歯をフックし、プラットフォームにベルクロを固定することによって、プラットフォームにマウスを固定します。 45°傾斜にマウスを持ち上げます。
  6. マイクロ綿棒を使用して、利き手を使用して、ローリング運動と舌を引っ込める。
  7. 非優位手で両方のMAへ挿管検鏡で動作耳鏡フィットを使用舌後退intainと声門を視覚化。
  8. 利き手で、マウスの気管(カテーテルが露出し、カテーテルの10ミリメートルのシリコンスリーブ付きフィット)に10ミリメートルの深さまでカテーテル、シーティングマウスを挿管する20のGカテーテルに通し、ガイドワイヤーを使用しています。耳鏡/検鏡を削除します。
  9. マウスが正しく簡単に着色された染料を含む1/16「クリアチューブのルアー接続長さを装着しながら、非優位手でカテーテルを固定することにより、挿管されたことを確認します。
    NOTE:染料が急速に呼吸に応じて前後に移動する。
  10. 挿管の確認はこの時点で確立されていない場合、その後のステップに進まないでください。挿管が失敗した実行し​​ようとした場合、挿管一つの追加の試みのためのカテーテル、ガイドワイヤをリセットします。
    注:マウスの​​外傷を引き起こすことなく、1つのセッションでのマウス二つ以上の挿管を試みるunadvisableある。
  11. に進みます液体懸濁液/エアクッションを含む精密シリンジ/ブラント針を挿入しながら、非優位手でカテーテルを固定します。
  12. 単一の流体運動で直接肺への液体/空気を分配し、すぐにマウスから針/カテーテルを取り除く。
  13. ケージにマウスを返し、麻酔からの回復を可能にする。

IMT配信の4キャラクタリゼーション

  1. IMIT点滴注入した後、適切な時間、接種後のCO 2窒息によりマウスを安楽死させる。
  2. 解剖ボードに安楽死させたマウスを保護し、噴出ボトルを使用し、70%EtOHで胸と腹部を浸す。
  3. 肺全体の造影剤の分布を評価する場合は、無菌技術を用いて動物から肺を除去し、画像化に適するように肺を表示する。
    注:肺は、適切な固定または凍結保存を通じて追加的な組織学的染色技術のために調製することができる<。/ LI>
  4. 感染した肺組織の細菌負荷を評価する場合は、無菌技術を用いた動物から肺を取り出します。無菌に肺を置き、1オンスサンプルバッグを予め秤量。計量し、サンプルバッグ+肺の重量を記録します。
    1. 各サンプルバッグ+組織への滅菌1×PBSの1ミリリットルを追加します。サンプルバッグを再シール。
    2. サンプルバッグ+組織上の25ミリリットルの血清学的ピペットを圧延することにより穏やかな組織を均質化する。
    3. シリアル寒天プレート上の滅菌PBSおよびプレート内の肺ホモジネートの希釈液(LB、または検討されて細菌種への適切な)を生成します:
      1. その後、寒天プレート上でマルチチャンネルによる三連のサンプルをプレートマルチチャンネルピペッターによるU底96ウェルプレート中で6倍連続希釈を行っています。
    4. 37℃にて一晩寒天プレートをインキュベートし、翌日のコロニー形成単位を列挙。

Representative Results

IMIT法による点滴注入材料の分布を可視化するために、0.1%クマシーブリリアントブルー染料50μlを、麻酔したマウスの肺に注入した。マウスを直ちに安楽死させ、肺を無菌剖検により除去した。 図1は、色素が肺のすべて葉に送達されたことを示している。

IMIT方法を介して肺に送達する細菌の量を、マウスの3つのグループ(n = 3)のP.三つの異なる濃度で注入したかを決定するために緑膿菌 (1.21×10 8、1.21x10 7、および1.21×10 6コロニー形成単位[CFU]を50μlあたり)。直ちにIMIT点滴注入後、マウスは、肺を除去し、安楽死させ、細菌数は、接種材料( 図2)に列挙して比較した。接種物の送達は、点滴の肺から回収された接種物の> 98%が、このメソッドを介して非常に効率的である動物。さらに、IMIT点滴にかかわらず、接種物(R 2 = 0.9951)の濃度の非常に再現性があった。

図1
図1:IMIT点滴注入は、肺全体に接種物を配布し 、すべての葉に分布して0.1%のクマシーブリリアントブルーショー青色色素50μlの点滴注入したマウスからの肺

図2
図2:肺マウスへの細菌のIMIT点滴注入は Pで注入した。 緑膿菌や肺に注入する細菌の数は(10 CFUをログ-回復)の推定接種材料と比較した(10 CFUをログ-配信)。各円は個々のマウス(のCFU /肺それぞれについてはn = 3を表す。細菌の用量)。

Discussion

IMIT点滴を再現肺に直接試薬を植え付ける能力の既存の呼吸器疾患モデルに主な改善を提供しています。それはIMIT技法を行い、誰が麻酔およびケージングの物流を管理しそのうちの一つ、理想的には2人の研究者のチームのために位置している急速なアプローチであり、もう。マウス当たり3分 - 大規模研究では2の平均時間のコミットメントとIMITを使用して行うことができる。アプローチは、麻酔薬としてのイソフルランを使用するので、マウスが回復を通して動物を監視する畜産時間を短縮すること、麻酔から急速に回復する。

IMIT方法の中で最も技術的に困難な側面は、マウスを挿管の初期段階である。 IMITを実行することを学ぶ個人はカテーテル留置のこの第一段階に集中することであり、挿管が染料移動の視覚的確認によって達成されたことを保証する。アプローチの利点は、肺スペックですIFIC点滴注入は、新しい研究者の双方の信頼だけでなく、困難な動物を挿管しようとする専門家を増加挿管の確認、の使用によって保証されています。成功した挿管の可能性を最適化する重要な要素は次のとおりです。深い鎮静を達成i)は、ⅱ)口の中で検鏡の正しい配置は第III)は、良好な深さの配置、喉頭蓋の良い可視化を可能にするのに十分な作業時間を可能にするために検鏡舌は手順全体を通して後退したまま、そして手順はリラックスして安定したアプローチを用いて実施されるように、ⅳ)傾斜プラットフォームの使用が研究者の手を支援するようにします。

IMIT手順の制限の一つは、IMIT点滴注入事象の頻度に関連している。逃した挿管に関連する潜在的な外傷が原因で、それは以上の2挿管の試みが(最大2ミスまで)単一のセッションで行われることが推奨されていません。 IMITマウス肺に治療薬を送達するために使用させる能力に優れた潜在能力を有するが、肺への試薬の非常に頻繁な送達を利用する治療法はIMITには適していない。これは、挿管に伴う外傷の大部分が失わ挿管イベントに関連すると考えられているように、IMITが有意な外傷を引き起こすことなく、マウスの肺内に試薬を送達するために日常的に使用され得ることが、高度に熟練した研究者が行った場合にのみ可能である。このような高周波IMITは、地元の獣医師や動物実験委員会で議論されるべきである。

IMITのさらなる潜在的な制限は挿管されているマウスのサイズです。 20 Gカテーテルは、このサイズ範囲内のマウスの気管に適したサイズであることが見出された22gの、 - 上述のIMIT手順は、約17匹のマウスを使用して開発された。大きなカテーテルが正常老齢マウスで使用されてきた。 IMIT mの初期開発> 20グラムであるBALB / cマウスにおける18 GカテーテルのADEの使用。代替のカテーテルサイズが使用される場合、重要なことに、鈍い針はカテーテルの内腔に適合し、カテーテル先端を越えてちょうど1ミリメートルを拡張長さにトリミングされた供給されるべきである。 17グラム未満のマウスの挿管が可能かもしれないが、必要な専門知識のために推奨されていません、と小さくカテーテルおよび上記に記載されているよりも検鏡の使用を必要とするであろう。

我々は、P。に加えて、いくつかの呼吸器病原体の送達にIMITを使用してきたB.含む緑膿菌疽菌 9および肺炎桿菌 10。 IMITモデルは、Bの我々の研究にとって重要な進歩を遂げています疽菌呼吸器疾患は、鼻腔内接種ではなく、ヒトの疾患9で観察された全身性疾患のエンドポイントよりもマウスの初期の、URT関連の病的状態を引き起こすことを識別した。B.疽菌は、ティア1セレクです生体防御衝撃tの薬剤、ならびに、呼吸器疾患モデルは、エアロゾル曝露のために開発されているように、そのモデル兵器病原体のエントリが潜在的生体防御関連経路。現在のエアロゾルのモデルは、我々はBの鼻腔モデルに特定した同電位の早期罹患表現型、URTおよびLRTの両方の感染につながるため、 疽菌呼吸器疾患は、エアロゾルモデルに適用される場合があります。 IMITモデルの将来の適応はマウスのみ肺へのターゲットエアロゾル送達のために挿管されている挿管媒介エアロゾル送達(IMAD)、である可能性があります。人工呼吸器は、エアロゾル化し、液体ベースではなく、病原体チャレンジを送達するように適合することができたイソフルラン麻酔を維持するために現在利用可能である。

IMITは、肺への細菌の送達を最適化するためのアプローチとして最初に開発されたが、また、マウスの肺への他の試薬を送達するための用途を有した。 DISとして上記cussed、低効率でマウスの結果への化合物の鼻腔内送達、肺の標的臓器への試薬の非常に可変配達。我々はIMITが> 98%配信の有効性および多葉分布に近づく他の肺送達に対する優れた代替手段を提供することが実証されているのに対し、マウス肺へのポジトロン放出断層撮影(PET)画像化試薬の鼻腔内送達は、40%の送達効率11が得られた。肺への標的送達のこの改善は、肺疾患の治療のための治療的送達の再現性を高める可能性がある。 ⅰ)環境肺刺激物の影響は、ⅱ)肺がん表現型の研究は、ⅲ)肺特異的siRNAがノックダウン:IMITは、同様の研究をに利益を提供することができます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rodent, Tilting WorkStand Hallowell EMC 000A3467 Base should be detached when working in a BSC
Operating Otoscope Head Welch Allyn 21700
Otoscope 3.5 V Li Battery Welch Allyn 71900
Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable Hallowell EMC 200A3589S
Incisor Loops Hallowell EMC 210A3490A
Cotton fine tip applicator Puritan 871-PC DBL  Used for tongue retraction
I.V. Catheter, 20 G Exel Int 26741 Optional: fit a silicon sleeve with 10 mm exposed catheter surface
Gas tight syringe, 250 ul Hamilton 81120 Used for delivery of liquid inoculum by IMIT
Blunt Needle, 22 G Hamilton 91022 Trim to length to protrude 1 mm from 20 G catheter
Guide wire (Fiber optic wire, 0.5 mm) TheFiberOpticStore.com FOF .50 Cut to 6" length: used as guide wire for intubation
Tuberculin syringe, 1 ml Becton Dickinson 309659 Assemble with fiber optic wire as guide wire
Brilliant Blue R (Coomassie) Sigma B0149
Tygon tubing, 1/16" Saint Gobain ALC00002 
Male Luer 1/16" barb Cole Parmer 45503-22
Female Luer 1/16" barb Cole Parmer 45500-00
Lidocaine, USP Spectrum LI102 pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0
Sample bag, 1 oz Whirl-Pak B01067
U-bottom 96 well plate, sterile Greiner 650161

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References

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Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. J. Vis. Exp. (93), e52261, doi:10.3791/52261 (2014).More

Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System. J. Vis. Exp. (93), e52261, doi:10.3791/52261 (2014).

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