La intubación mediada intratraqueal (IMIT) instilación: A, Sistema de Entrega de pulmón-específica no invasiva

Abstract

Estudios de enfermedades respiratorias típicamente implican el uso de modelos murinos como sistemas sustitutos. Sin embargo, hay diferencias fisiológicas significativas entre el murino y los sistemas respiratorios humanos, especialmente en sus vías respiratorias superiores (URT). En algunos modelos, estas diferencias en la cavidad nasal murino pueden tener un impacto significativo sobre la progresión de la enfermedad y la presentación en el tracto respiratorio inferior (LRT) cuando se utilizan técnicas de instilación intranasal, limitando potencialmente la utilidad del modelo de ratón para estudiar estas enfermedades. Por estas razones, sería ventajoso desarrollar una técnica para inculcar bacterias directamente en los pulmones del ratón con el fin de estudiar la enfermedad LRT en ausencia de afectación de la URT. Hemos denominado este mediada por la intubación intratraqueal técnica de entrega (IMIT) la instilación específica del pulmón. Esta técnica no invasiva minimiza el potencial para la instilación en el torrente sanguíneo, lo cual puede ocurrir durante traditi más invasivaonal enfoques quirúrgicos intratraqueales infección, y limita la posibilidad de entrega tracto digestivo incidental. IMIT es un proceso de dos pasos en el que los ratones son intubados primero, con un paso intermedio para asegurar la colocación correcta del catéter en la tráquea, seguido por la inserción de una aguja roma en el catéter para mediar la entrega directa de las bacterias en el pulmón. Este enfoque facilita una eficacia> 98% de la ejecución en los pulmones con una excelente distribución de reactivo de todo el pulmón. Por lo tanto, IMIT representa un nuevo enfoque para estudiar la enfermedad LRT y suministro terapéutico directamente en el pulmón, la mejora de la capacidad de utilizar los ratones como sustitutos para estudiar la enfermedad respiratoria humana. Además, la exactitud y reproducibilidad de este sistema de administración también hace que sea susceptible de Normas de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP), así como la entrega de una amplia gama de reactivos que requieren la entrega de alta eficiencia en el pulmón.

Introduction

Los ratones se han utilizado para modelar numerosas manifestaciones de enfermedades humanas, incluyendo una gran variedad de enfermedades respiratorias. Modelos de enfermedades sustitutos son a menudo incapaces de recapitular todos los aspectos de una enfermedad modelado, por lo general debido a la fisiológica importante o diferencias inmunológicas en los dos modelos de acogida. Por lo tanto, un objetivo de la mejora de los sistemas de modelo es el desarrollo de métodos que permitan a los sustitutos reflejan más de cerca un proceso de enfermedad o de acogida que la respuesta observada en el sistema host original. Hay varias diferencias fisiológicas clave entre ratones y seres humanos en el mecanismo por el que se inspiran aire. Se incluyen en estas diferencias son diferencias significativas en el tamaño radiométricos entre la URT y LRT. Se ha estimado que los ratones que poseen> 100 veces el área de superficie URT relativa a los seres humanos, normalizado contra el total de la capacidad pulmonar ^1,2. Por lo tanto, los cornetes nasales del ratón permiten más extensa de filtrado de aire inspirado para facilitar una mayor tasa de breathing, que puede tener un impacto significativo en los estudios de neumonía si la infección de la cavidad nasal juega un papel importante en la progresión de la enfermedad.

Se han empleado varios enfoques diferentes para infundir bacterias en los pulmones de ratones para estudiar la enfermedad respiratoria similar a la humana. El más común de estos enfoques es la inoculación intranasal, en el que se aplica una suspensión líquida en uno o ambos orificios nasales de un ratón. Aunque es relativamente sencillo, advertencias, como el volumen de la instilación y el tipo de anestesia que se utiliza puede afectar la eficiencia de la instilación en la LRT a través de la inoculación intranasal ^3-5. Específicamente, Miller et al. han mostrado que la instilación intranasal de Francisella tularensis en los volúmenes de menos de 50 l no dio lugar a la instilación de las bacterias en la LRT ^6. Observaron además mejor instilación LRT al utilizar isoflurano inhalado en lugar de inyectar ketamina / xilacina para la anestesia. Sin embargo, nuestra experience con Yersinia pestis inoculación intranasal indica la inoculación más consistente se puede lograr usando ketamina / xilacina en comparación con isoflurano (MBL, datos no publicados). Estas diferencias podrían atribuirse a patógeno utilizado o a la variación en los procedimientos de laboratorio, pero importante destacar la variabilidad potencial en esta técnica. Además, los pulmones cosechadas poco después de la instilación intranasal muestran que un porcentaje relativamente bajo del inóculo bacteriano inicial alcanza el pulmón (en el caso de Y. pestis, sólo el 10% se recuperaron 1 hr después de la instilación ^7), lo que sugiere que un gran número de bacterias podría ser retenido en la URT (o se ingiere en el tracto gastrointestinal). En ciertos modelos de enfermedad, esta deposición significativa de bacterias en la mucosa URT puede confundir nuestra comprensión de la evolución de la enfermedad si el organismo es capaz de colonizar la cavidad nasal murino de manera incompatible con la enfermedad humana. Por ejemplo, el uso in vivo </ Em> de imágenes, se ha observado que Burkholderia pseudomallei, que no colonizan la URT humano, causa una infección oportunista abrumadora de la cavidad nasal murino cuando se entrega por el método de la instilación intranasal ^8.

Otros métodos para inculcar bacterias en los pulmones de ratones también se han empleado en investigación de enfermedades infecciosas. Sin embargo, en comparación con la instilación intranasal estos métodos tienden a requerir más conocimientos técnicos y / o un equipo costoso, sin eliminar el potencial para la iniciación de la infección en múltiples sitios (por ejemplo, aerosol [URT y LRT]; transoral [tracto digestivo y LRT]; y intratraqueal quirúrgica [LRT y corriente de la sangre]). Dadas las complicaciones potenciales que podrían estar asociados con los sitios secundarios de la infección, hemos tratado de desarrollar un enfoque intratraqueal que no pasa por la URT y entrega patógeno directamente en los pulmones de ratones anestesiados, pero también limita inoculados inadvertidade iones en el torrente sanguíneo o en el tracto GI. Hacia este fin, intratraqueal (IMIT) instilación intubación mediada fue desarrollado como un procedimiento no quirúrgico que garantiza LRT instilación de inóculo mediante la inclusión de un paso intermedio para verificar la colocación del catéter adecuado antes de la instilación. Este método se describe usando el tinte de la instilación de demostrar visualmente amplia distribución del inóculo en todo el pulmón, y P. aeruginosa instilación para demostrar la entrega altamente eficaz (> 98% del inóculo) de este método para el pulmón. Es importante destacar que, mientras que originalmente desarrollado para la entrega bacteriana, IMIT también ofrece una herramienta eficaz para: i) la instilación de diferentes moléculas para el estudio de otros modelos de enfermedades respiratorias, ii) la entrega terapéutico-pulmonar específica, y iii) los estudios de función pulmonar básica, incluyendo dirigido siRNA entrega al pulmón.

Protocol

NOTA: Todos los procedimientos descritos aquí fueron revisados ​​y aprobados por la Universidad de Louisville Comité Institucional de Bioseguridad (protocolo # 13-056) e Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (protocolo # 13-064).

1. Preparación del Tinte

1. Diluir 0,1% (w / v) azul brillante de Coomassie en PBS y esterilizar filtro utilizando un filtro de jeringa de 0,45 mM.

2. Preparación de Pseudomonas aeruginosa Cultura

1. 15 horas antes de la instilación, se inoculan 3 ml de caldo de cultivo con una sola colonia bacteriana.
2. Crece la cultura hr 15 a 37 ° C en un agitador (200 rpm).
3. Centrifugar 1 ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml 12.000 xg durante 30 seg.
4. Retire el medio y volver a suspender el sedimento en 1 ml de PBS.
5. Diluir una alícuota de la suspensión bacteriana Stock 1:10 en PBS y medir el OD ₆₀₀ de la suspensión bacteriana diluida para determinar elconcentración bacteriana.
6. Diluir la suspensión bacteriana de valores en PBS a la concentración deseada de inóculo bacteriano, utilizando un volumen de entrega de 50 l para la inoculación IMIT.

3. IMIT instilación

1. Colocar un grupo de ratones en la cámara de inducción de anestesia con isoflurano y anestesiar utilizando un 2 - mezcla de isoflurano / oxígeno del 3%.
2. En el inicio de la sedación inicial, pescuezo del ratón, sostiene el ratón en posición vertical, y administrar 10 l de una solución de lidocaína al 2% en aguja de sonda a la parte posterior de la garganta y permitir que la solución fluya hacia abajo para la epiglotis. Devuelva el ratón a la cámara de la anestesia.
   1. Deje un mínimo de 5 minutos para permitir la lidocaína a surtir efecto completo como anestésico local.
3. Cuando los ratones han alcanzado el nivel deseado de sedación (tasa de ~ 60 bpm de respiración), reducir el isoflurano al 2% para mantener la sedación.
4. Precarga tinte o inóculo bacteriano en un 250 l hermética a los gasesen forma de jeringa de precisión con una aguja roma largo 22 G.
   1. En primer lugar la elaboración de 150 l de aire, medida por el émbolo de teflón de la jeringa. A continuación, la elaboración de 50 l de inóculo haciendo avanzar el émbolo de teflón de la marca de 150 l hasta la marca de 200 l en el cuerpo de la jeringa.
      NOTA: Cuando la muestra es expulsada en un ratón intubado, la suspensión 50 l será entregado primero, seguido por un cojín de aire 150 l que distribuirá el inóculo en todo el pulmón.
5. Retire un ratón desde la cámara de inducción y poner en posición supina sobre una plataforma de intubación. Asegure el ratón a la plataforma enganchando sus incisivos con una junta tórica adjunta a la tira de velcro, y asegurar el velcro a la plataforma. Levante el ratón a una inclinación de 45 °.
6. El uso de un aplicador de micro algodón, retraer la lengua con un movimiento de balanceo, utilizando la mano dominante.
7. Con la mano no dominante, utilice un ajuste otoscopio operando con un espéculos intubación tanto maintain retracción de la lengua y visualizar la glotis.
8. Con la mano dominante, utilice un alambre de guía roscada a través de un catéter de 20 G de intubar el ratón, asentar el catéter a una profundidad de 10 mm en la tráquea de ratón (catéter está en forma de un manguito de silicio con 10 mm de catéter expuesto). Retire el otoscopio / espéculos.
9. Confirmar que el ratón ha sido intubado correctamente por asegurar el catéter con la mano no dominante mientras se coloca brevemente una longitud conectado Luer de 1/16 "tubo transparente que contiene un colorante de color.
   NOTA: El tinte migrar rápidamente hacia atrás y adelante en respuesta a la respiración.
10. No continúe con los pasos siguientes, si la confirmación de la intubación no se ha establecido en este punto. Si la intubación intentado realizar falló, restablecer el alambre y catéter guía para un intento adicional en la intubación.
    NOTA: Es aconsejable intentar más de dos intubaciones de un ratón en una sesión sin causar traumatismo en el ratón.
11. Continuarasegurar el catéter con la mano no dominante, mientras que la inserción de la / aguja roma jeringa de precisión que contiene el amortiguador de suspensión líquido / aire.
12. Dispensar el líquido / aire directamente en el pulmón en un solo movimiento fluido y retire inmediatamente la aguja / catéter del ratón.
13. Devuelva el ratón a una jaula y permitir la recuperación de la anestesia.

4. Caracterización de las IMT Entrega

1. Después de la instilación IMIT, la eutanasia el ratón por asfixia de CO ₂ en un momento apropiado después de la inoculación.
2. Asegure el ratón sacrificados en un tablero de disección y tomar el pecho y el abdomen con EtOH al 70% utilizando una jeringa.
3. Si la evaluación de la distribución de un agente de imagen en todo el pulmón, eliminar los pulmones de los animales utilizando una técnica estéril y mostrar los pulmones en su caso para la imagen.
   NOTA:. Los pulmones pueden ser preparados por técnicas de tinción histológicas adicionales a través de la fijación o la criopreservación apropiado </ Li>
4. Si la evaluación de la carga bacteriana del tejido pulmonar infectado, eliminar los pulmones del animal utilizando una técnica estéril. Coloque los pulmones en un estéril, previamente pesado 1 oz bolsa de muestra. Pesar y registrar el peso de la bolsa de muestra + pulmones.
   1. Añadir 1 ml de PBS 1x estéril a cada bolsa de tejidos + muestra. Vuelva a sellar la bolsa de muestra.
   2. Homogeneizar los tejidos por una suave rodando 25 ml pipeta serológica sobre la bolsa de muestra + tejido.
   3. Generar diluciones seriadas del homogeneizado de pulmón en PBS estéril y placa en placa de agar (LB, o en su caso de las especies de bacterias en estudio):
      1. Llevar a cabo una dilución en serie de seis veces en una placa de fondo en U 96 por pipeta multicanal a continuación, la placa muestras por triplicado por multicanal en la placa de agar.
   4. Incubar las placas de agar durante la noche a 37 ° C y enumerar unidades formadoras de colonias al día siguiente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC	000A3467	Base should be detached when working in a BSC
Operating Otoscope Head	Welch Allyn	21700
Otoscope 3.5 V Li Battery	Welch Allyn	71900
Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable	Hallowell EMC	200A3589S
Incisor Loops	Hallowell EMC	210A3490A
Cotton fine tip applicator	Puritan	871-PC DBL	Used for tongue retraction
I.V. Catheter, 20 G	Exel Int	26741	Optional: fit a silicon sleeve with 10 mm exposed catheter surface
Gas tight syringe, 250 ul	Hamilton	81120	Used for delivery of liquid inoculum by IMIT
Blunt Needle, 22 G	Hamilton	91022	Trim to length to protrude 1 mm from 20 G catheter
Guide wire (Fiber optic wire, 0.5 mm)	TheFiberOpticStore.com	FOF .50	Cut to 6" length: used as guide wire for intubation
Tuberculin syringe, 1 ml	Becton Dickinson	309659	Assemble with fiber optic wire as guide wire
Brilliant Blue R (Coomassie)	Sigma	B0149
Tygon tubing, 1/16"	Saint Gobain	ALC00002
Male Luer 1/16" barb	Cole Parmer	45503-22
Female Luer 1/16" barb	Cole Parmer	45500-00
Lidocaine, USP	Spectrum	LI102	pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0
Sample bag, 1 oz	Whirl-Pak	B01067
U-bottom 96 well plate, sterile	Greiner	650161