Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.
Estudios de enfermedades respiratorias típicamente implican el uso de modelos murinos como sistemas sustitutos. Sin embargo, hay diferencias fisiológicas significativas entre el murino y los sistemas respiratorios humanos, especialmente en sus vías respiratorias superiores (URT). En algunos modelos, estas diferencias en la cavidad nasal murino pueden tener un impacto significativo sobre la progresión de la enfermedad y la presentación en el tracto respiratorio inferior (LRT) cuando se utilizan técnicas de instilación intranasal, limitando potencialmente la utilidad del modelo de ratón para estudiar estas enfermedades. Por estas razones, sería ventajoso desarrollar una técnica para inculcar bacterias directamente en los pulmones del ratón con el fin de estudiar la enfermedad LRT en ausencia de afectación de la URT. Hemos denominado este mediada por la intubación intratraqueal técnica de entrega (IMIT) la instilación específica del pulmón. Esta técnica no invasiva minimiza el potencial para la instilación en el torrente sanguíneo, lo cual puede ocurrir durante traditi más invasivaonal enfoques quirúrgicos intratraqueales infección, y limita la posibilidad de entrega tracto digestivo incidental. IMIT es un proceso de dos pasos en el que los ratones son intubados primero, con un paso intermedio para asegurar la colocación correcta del catéter en la tráquea, seguido por la inserción de una aguja roma en el catéter para mediar la entrega directa de las bacterias en el pulmón. Este enfoque facilita una eficacia> 98% de la ejecución en los pulmones con una excelente distribución de reactivo de todo el pulmón. Por lo tanto, IMIT representa un nuevo enfoque para estudiar la enfermedad LRT y suministro terapéutico directamente en el pulmón, la mejora de la capacidad de utilizar los ratones como sustitutos para estudiar la enfermedad respiratoria humana. Además, la exactitud y reproducibilidad de este sistema de administración también hace que sea susceptible de Normas de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP), así como la entrega de una amplia gama de reactivos que requieren la entrega de alta eficiencia en el pulmón.
Los ratones se han utilizado para modelar numerosas manifestaciones de enfermedades humanas, incluyendo una gran variedad de enfermedades respiratorias. Modelos de enfermedades sustitutos son a menudo incapaces de recapitular todos los aspectos de una enfermedad modelado, por lo general debido a la fisiológica importante o diferencias inmunológicas en los dos modelos de acogida. Por lo tanto, un objetivo de la mejora de los sistemas de modelo es el desarrollo de métodos que permitan a los sustitutos reflejan más de cerca un proceso de enfermedad o de acogida que la respuesta observada en el sistema host original. Hay varias diferencias fisiológicas clave entre ratones y seres humanos en el mecanismo por el que se inspiran aire. Se incluyen en estas diferencias son diferencias significativas en el tamaño radiométricos entre la URT y LRT. Se ha estimado que los ratones que poseen> 100 veces el área de superficie URT relativa a los seres humanos, normalizado contra el total de la capacidad pulmonar 1,2. Por lo tanto, los cornetes nasales del ratón permiten más extensa de filtrado de aire inspirado para facilitar una mayor tasa de breathing, que puede tener un impacto significativo en los estudios de neumonía si la infección de la cavidad nasal juega un papel importante en la progresión de la enfermedad.
Se han empleado varios enfoques diferentes para infundir bacterias en los pulmones de ratones para estudiar la enfermedad respiratoria similar a la humana. El más común de estos enfoques es la inoculación intranasal, en el que se aplica una suspensión líquida en uno o ambos orificios nasales de un ratón. Aunque es relativamente sencillo, advertencias, como el volumen de la instilación y el tipo de anestesia que se utiliza puede afectar la eficiencia de la instilación en la LRT a través de la inoculación intranasal 3-5. Específicamente, Miller et al. han mostrado que la instilación intranasal de Francisella tularensis en los volúmenes de menos de 50 l no dio lugar a la instilación de las bacterias en la LRT 6. Observaron además mejor instilación LRT al utilizar isoflurano inhalado en lugar de inyectar ketamina / xilacina para la anestesia. Sin embargo, nuestra experience con Yersinia pestis inoculación intranasal indica la inoculación más consistente se puede lograr usando ketamina / xilacina en comparación con isoflurano (MBL, datos no publicados). Estas diferencias podrían atribuirse a patógeno utilizado o a la variación en los procedimientos de laboratorio, pero importante destacar la variabilidad potencial en esta técnica. Además, los pulmones cosechadas poco después de la instilación intranasal muestran que un porcentaje relativamente bajo del inóculo bacteriano inicial alcanza el pulmón (en el caso de Y. pestis, sólo el 10% se recuperaron 1 hr después de la instilación 7), lo que sugiere que un gran número de bacterias podría ser retenido en la URT (o se ingiere en el tracto gastrointestinal). En ciertos modelos de enfermedad, esta deposición significativa de bacterias en la mucosa URT puede confundir nuestra comprensión de la evolución de la enfermedad si el organismo es capaz de colonizar la cavidad nasal murino de manera incompatible con la enfermedad humana. Por ejemplo, el uso in vivo </ Em> de imágenes, se ha observado que Burkholderia pseudomallei, que no colonizan la URT humano, causa una infección oportunista abrumadora de la cavidad nasal murino cuando se entrega por el método de la instilación intranasal 8.
Otros métodos para inculcar bacterias en los pulmones de ratones también se han empleado en investigación de enfermedades infecciosas. Sin embargo, en comparación con la instilación intranasal estos métodos tienden a requerir más conocimientos técnicos y / o un equipo costoso, sin eliminar el potencial para la iniciación de la infección en múltiples sitios (por ejemplo, aerosol [URT y LRT]; transoral [tracto digestivo y LRT]; y intratraqueal quirúrgica [LRT y corriente de la sangre]). Dadas las complicaciones potenciales que podrían estar asociados con los sitios secundarios de la infección, hemos tratado de desarrollar un enfoque intratraqueal que no pasa por la URT y entrega patógeno directamente en los pulmones de ratones anestesiados, pero también limita inoculados inadvertidade iones en el torrente sanguíneo o en el tracto GI. Hacia este fin, intratraqueal (IMIT) instilación intubación mediada fue desarrollado como un procedimiento no quirúrgico que garantiza LRT instilación de inóculo mediante la inclusión de un paso intermedio para verificar la colocación del catéter adecuado antes de la instilación. Este método se describe usando el tinte de la instilación de demostrar visualmente amplia distribución del inóculo en todo el pulmón, y P. aeruginosa instilación para demostrar la entrega altamente eficaz (> 98% del inóculo) de este método para el pulmón. Es importante destacar que, mientras que originalmente desarrollado para la entrega bacteriana, IMIT también ofrece una herramienta eficaz para: i) la instilación de diferentes moléculas para el estudio de otros modelos de enfermedades respiratorias, ii) la entrega terapéutico-pulmonar específica, y iii) los estudios de función pulmonar básica, incluyendo dirigido siRNA entrega al pulmón.
IMIT instillation offers key improvements to existing respiratory disease models in the ability to reproducibly instill reagents directly into the lung. It is a rapid approach which is ideally situated for a team of two researchers, one of which manages the logistics of anesthesia and caging, and the other who performs the IMIT technique. Large studies may be conducted using IMIT with an average time commitment of 2 – 3 min per mouse. Because the approach makes use of isoflurane as an anesthetic, mice recover rapidly from the anesthesia, reducing the husbandry time of monitoring animals through recovery.
The most technically challenging aspect of the IMIT method is the initial step of intubating mice. Individuals learning to perform IMIT are able to focus on this first step of catheter placement and ensuring that intubation has been achieved through the visual confirmation of dye movement. The benefit of the approach is that lung-specific instillation is guaranteed through use of the confirmation of intubation, which increases the confidence of both the new researcher as well as the expert attempting to intubate a difficult animal. The key elements of optimizing the likelihood of a successful intubation are: i) achieving a deep sedation to allow sufficient working time, ii) correct placement of the specula in the mouth to allow good visualization of the epiglottis, iii) good depth placement of the specula so that the tongue remains retracted throughout the procedure, and iv) use of the tilting platform to support the researcher’s hands so that the procedure is conducted relaxed and with a steady approach.
One of the limitations of the IMIT procedure is related to frequency of IMIT instillation events. Due to the potential trauma associated with a missed intubation, it is not recommended that more than two intubation attempts be conducted in a single session (up to two misses). IMIT has an excellent potential in its ability to be used to deliver therapeutics into the murine lung, however therapeutic regimens which make use of very frequent delivery of reagent into the lung may not be suitable for IMIT. It may be possible that IMIT could be used daily to deliver reagents into a murine lung without causing significant trauma, but only when conducted by a highly skilled researcher, as the majority of trauma associated with intubation is thought to be associated with a missed intubation event. Such high-frequency IMIT should be discussed with local veterinarians and IACUC.
An additional potential limitation of IMIT is the size of the mouse which is being intubated. The IMIT procedure described above was developed using mice of approximately 17 – 22 g, where a 20 G catheter was found to be a suitable size for the trachea of mice in this size range. Larger catheters have been successfully used in older mice; the initial development of IMIT made use of an 18 G catheter in BALB/c mice which are >20 g. Importantly, if alternate catheter sizes are used, blunt needles should be sourced which fit the lumen of the catheter and are trimmed to a length that extends just 1mm beyond the catheter tip. Intubation of mice smaller than 17 g may be possible but is not recommended due to the expertise required, and would require use of smaller catheters and specula than are described above.
We have used IMIT for the delivery of several respiratory pathogens in addition to P. aeruginosa, including B. pseudomallei9 and Klebsiella pneumoniae10. The IMIT model has made important advances to our studies of B. pseudomallei respiratory disease, having identified that intranasal inoculation causes an early, URT-related morbidity of mice rather than the systemic disease endpoint observed in human disease9. B. pseudomallei is a Tier 1 select agent of biodefense impact, and as such, respiratory disease models are being developed for aerosol exposure which models a potential biodefense related route of entry for weaponized pathogens. Because current aerosol models result in infection of both the URT and LRT, the same potential early morbidity phenotypes we have identified for the intranasal model of B. pseudomallei respiratory disease may apply to the aerosol model. A future adaptation of the IMIT model could be an intubation-mediated aerosol delivery (IMAD), in which mice are intubated for target aerosol delivery only into the lung. Mechanical ventilators are currently available to maintain isoflurane anesthesia, which could be adapted to deliver an aerosolized, rather than liquid based, pathogen challenge.
IMIT was developed initially as an approach to optimize the delivery of bacteria to the lung, but also has application for the delivery of other reagents into the mouse lung. As discussed above, intranasal delivery of compounds into mice results in a low efficiency, highly variable delivery of reagents into the target organ of the lung. Intranasal delivery of Positron Emission Tomography (PET) imaging reagents to the murine lung yielded a 40% delivery efficiency11, whereas we have demonstrated that IMIT offers an excellent alternative to other lung delivery approaches with its >98% delivery efficacy and multilobar distribution. This improvement in targeted delivery to the lung has the potential to increase the reproducibility of therapeutic delivery for treatment of pulmonary disease. IMIT could similarly offer benefits to studies of: i) the impact of environmental pulmonary irritants, ii) lung cancer phenotypic studies, iii) lung-specific siRNA knock-down.
The authors have nothing to disclose.
The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC | 000A3467 | Base should be detached when working in a BSC |
Operating Otoscope Head | Welch Allyn | 21700 | |
Otoscope 3.5 V Li Battery | Welch Allyn | 71900 | |
Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
Incisor Loops | Hallowell EMC | 210A3490A | |
Cotton fine tip applicator | Puritan | 871-PC DBL | Used for tongue retraction |
I.V. Catheter, 20G | Exel Int | 26741 | Optional: fit a silicon sleeve with 10mm exposed catheter surface |
Gas tight syringe, 250ul | Hamilton | 81120 | Used for delivery of liquid inoculum by IMIT |
Blunt Needle, 22G | Hamilton | 91022 | Trim to length to protrude 1mm from 20G catheter |
Guide wire (Fiber optic wire, 0.5mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cut to 6" length: used as guide wire for intubation |
Tuberculin syringe, 1ml | Becton Dickinson | 309659 | Assemble with fiber optic wire as guide wire |
Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
Tygon tubing, 1/16" | Saint Gobain | ALC00002 | |
Male luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45503-22 | |
Female luer 1/16" barb | Cole Parmer | 45500-00 | |
Lidocaine, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0 |
Sample bag, 1oz | Whirl-Pak | B01067 | |
U-bottom 96 well plate, sterile | Greiner | 650161 |