Abstract
Bリンパ球の免疫グロブリン重鎖（IgH遺伝子）クラススイッチ組換え（CSR）は、最初のIgMなどのIgA、IgE及びIgGのような他ののIgHアイソタイプ、に切り替わり表現方法である。 in vitroでのIgH CSRの測定は、分子および細胞免疫学の観点にDNA組換えおよび修復の範囲の生物学的プロセスの数を研究するための重要な方法である。 インビトロ CSRアッセイは、活性化B細胞のフローサイトメトリー測定表面Igの発現を含む。 IgAおよびIgGサブクラスの測定は簡単であるが、この方法によるIgEの測定はFcεRIIはへの結合により、可溶性IgEへの問題がある/ CD23は、活性化B細胞の表面に発現。ここでは、培養液中でCSRを受けたIgE産生マウスB細胞の正確な測定のためのユニークな手順を説明します。方法は、cyのによるIgE産生B系統細胞の検出を可能にする、細胞表面上のIgE-CD23複合体のトリプシン媒介開裂に基づくtoplasmic染色。この手順は、IgEに対するCSRのフローサイトメトリー分析のための便利なソリューションを提供しています。
Introduction
マウスおよびヒトの免疫グロブリン重鎖（IgH遺伝子）クラススイッチ組換え（CSR）の間に、IgH遺伝子は 、定常領域エクソン（Cμ）が削除され、下流の定常領域エクソンのいくつかのセットの一つ（CのH秒 ）（ 例えば、Cγで置換されているμ他のIgクラス（ 例えば IgGを、IgEの、またはIgA）の産生に対するIgMの生産からスイッチになりCε、およびCα）、。 CSRは、C H 1のそれぞれの組の5 '側に位置する1〜10キロバイト配列であるスイッチ（S）領域内で起こる。活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）酵素は、シチジン脱アミノ化の活動を通じてCSRを開始します。
IgEはアレルギー疾患2の重要なメディエーターおよびIgEが産生され、アトピー性疾患への新しい治療的アプローチへの扉を開くことが規制されている方法の理解である。マウスとヒトでは、IgEが最も厳密に調節Igアイソタイプである。 IgEのは、通常、ティムのレベル数千で検出されるエス他のIgH未満は3アイソタイプが、高度に疾患状態4に上昇させることができる。しかし、IgEに対するCSRが完全には理解される。B細胞のインビトロ活性化を抗CD40またはLPSのいずれかと組み合わせてIL-4を使用して、IgG1およびIgEの5の両方にCSRを誘導する。活性化されたB細胞は、可溶性IgEがCSR後の培養中に分泌結合し、低親和性IgE受容体FcεRIIは/ CD23 2,6を 、表現する。フローサイトメトリーで分析する場合、したがって、受容体結合IgEとB細胞は、内因的なIgE 7を発現するB細胞にも同様に染色する。それは、マウスB細胞は、低親和性のIgG受容体FcγRIIB1（CD32）8を発現することが知られているが、我々の経験では、IgG1へのクラススイッチの測定を妨害しないようである。培養物中のB細胞活性化後のIgE切り替えを測定する場合しかし、非特異的表面結合IgE分析を不明瞭にすることができる。一般的な染色方法では、非IgEの発現細胞は、IgEのために積極的に染色する。
11 -ここで概説はCSRアッセイを実施し、マウス9から真のIgEを発現するB細胞を検出するために利用されている戦略である。トリプシンで活性化されたB細胞の治療は、一般的なラボの試薬は、タンパク質を消化するために、cytophylicおよび膜の両方に結合した表面IgEは削除されます。細胞質のIgEに対するその後の透過処理と染色は、このように真のIgE産生細胞を明らかにする。
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Protocol
注：ここで説明するすべての実験は、施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインに従ったと動物研究小児病院（ARCH）、ボストン、マサチューセッツによって承認。
試薬の調製
- 1,000倍IL-4ストック：H 2 O、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）中に20μg/ mlにまで希釈IL-4サイトカイン。 -20℃で1.5 mlマイクロチューブやストアに200μlのアリコートで分注する。
- 1,000倍の抗CD40：4℃で1.0 mg / mlの、店でメーカーから入手します。
- B細胞刺激培地：ストレプトマイシンストック、5：RPMI-1640培地425mlの、新たに解凍したウシ胎児血清（FCS）を75mlを追加し、10ミリリットルの1.0 M HEPES緩衝液5mlのL-グルタミンストック5mlのペニシリンへ2-メルカプトエタノールの溶液最小必須培地非必須アミノ酸（MEM-NEAA）、及び3.5μlの。週間まで4℃でメディアを保管してください。 IL-4（20ng / ml）および抗CD40（1.0μg/ ml）を使用直前に加える唯一必要なメディアの容量に。
- 2％FCS-FACSバッファ：1X PBSの490ミリリットルにFCSの10ミリリットルを追加します。 4℃で保管してください。
- 2×トリプシン-EDTA溶液：1×PBS 20mlに5ミリリットル10xのトリプシンEDTAストック溶液（5.0グラムトリプシン、リットル当たり2.0グラムのEDTA）で希釈する。 4℃で一定分量の作業2倍に保管してトリプシン-EDTA。使用前に室温に温める。
- ウシ胎児血清：2週間まで4で解凍FCSしてください。細胞質の染色手順の前に氷の15分に置きます。
- 中性緩衝ホルマリン：10％ホルマリン溶液（3.7％パラホルムアルデヒド）を準備します。ホルマリンは毒性があり、適切なPPEを装着したまま、したがって実験室ヒュームフードの下でそれを処理する。化学収納キャビネット内に室温で保存ホルマリン。
- メタノール：細胞は透過化される準備が整うまで-20℃で無水メタノール（100％）を保管してください。メタノールは可燃性で、適切な冷凍庫で保存する必要があることに注意してください。
2。精製およびB細胞の活性化
- 収穫したてのマウスの脾臓から、静かに3ミリリットルの注射器のプランジャーで70μmのセルストレーナーを通して臓器を押すことにより、単一細胞懸濁液を準備します。 15ミリリットルコニカル遠心管では、4℃で5分間300×gで1×PBSと遠心機の10ミリリットルで細胞を集める。
- 5分間の赤血球細胞溶解緩衝液1mlに上清と再懸濁ペレットをデカント。 5分間300×gで13.5 1X PBS mlの遠心で中和。
- （オプション）磁気（B220）抗CD45Rを用いB細胞を分離、製造業者の説明書に従ってMACS精製プロトコルに続いて、ビーズを標識。
- 37℃で5日間、IL-4（20ng / ml）および抗CD40（1.0μgの個/ ml）を含有する加温し、B細胞刺激培地中1.0×10 6細胞/ mlの精製されたB細胞を刺激する。 6ウェル培養プレートの2ウェル（各4ml）に分割し、培養を8mlで始まる。
- cultuチェック1.0×10 6細胞/ mlで維持するために毎日再。他のウェルに分割し、新鮮なIL-4および抗CD40を含有するB細胞刺激培地で培養を希釈して濃度を調整します。
3.トリプシン処理、固定、および透過
- トリプシン処理
- 、15ミリリットルコニカルチューブで培養した細胞の1.0×10 7まで収集5分間300×gで遠心分離し、上清をデカント。
- 細胞回収メディアから残留タンパク質を除去するために10mlのPBSで洗ってください。遠心分離工程を繰り返し、上清をデカント。
- （約100μl）をデカントした後の残存量の細胞ペレットを再懸濁します。
- 慎重に細胞に室温800μlの0.1％（2倍）、トリプシンEDTAを追加します。円錐管の側を下に45°の角度でゆっくりと分注する。
- チューブを閉じ、液体がチューブ5-6時間の長さに沿って走るようにチューブを傾けることによって穏やかに混合S。糸、白色沈殿物が溶液中に形成することができる。分の下にトリプシン処理時間を制限する。
- 冷たいFCSの1ミリリットルとのトリプシン処理反応を停止。冷PBSを10mlを加えることによって直ちにFCSを希釈する。
- 4℃で5分間300×gで遠心分離し、その後上清を除去し、氷にチューブを返す。
- 固定
- デカンテーション後の残留量の細胞を再懸濁。必要であれば、冷PBSで100μlにボリュームを起動します。
- ドラフト内で、細胞を10％中性緩衝ホルマリン溶液800μlを添加し、上下にピペッティング。チューブは、ホルマリンを添加すると暖めます。 10分間37℃でインキュベートする。
- 透過化
- 緩やかに振盪速度でベンチトップボルテックスミキサーを設定します。
- 10ミリリットルの血清学的ピペットに冷たい（-20℃）メタノールの9ミリリットルを描画します。
- ボルテックスミキサーを介して細胞を含有するチューブを握り、ゆっくりとシャキーンを開始gの細胞。
- メタノールを連続的に混合されるように、管がまだ揺れている間に、それが細胞上に滴下して落下ようにチューブに冷メタノールを追加します。メタノールの最初の2ミリリットルの後に分注速度が遅いストリームに増加させることができる。
- チューブは透過処理を完了するために、30分間氷上で座ってみましょう。あるいは、細胞は、月まで-20℃で保存することができる。
IgG1およびIgEのクラススイッチ4.蛍光染色
- 5分間300×gで遠心サンプルおよびメタノール溶液をデカント。白色沈殿物を細胞ペレットを得る。
- 細胞を洗浄するために5分間300×gで10 PBS 1X室温mlの遠心分離器を追加します。一回繰り返します。注：室温PBSでペレットの洗浄は、ステップ4.1の後に形成することができる余分な沈殿物を溶解する。
- 2％FCS-FACS緩衝液10mlの追加の洗浄を行います。
- 96ウェル丸底プレートにサンプルを分配する5分間300×gで遠心する。上清を除去し、氷上にプレートを置く。
- 以下の抗体希釈でウェルあたり2％FCS-FACS緩衝液60μlの中でステイン：抗IgM RPE / Cy7は、1：200、アンチIgG1のPE、1：600、抗IgE FITC、1：100、抗CD45R（B220）PerCPを-のCy5.5、1：200
- 染色の5分後、300×gで5分間、2％FCS-FACSバッファーと遠心150μlでプレートを洗浄する。
- 5ミリリットルのFACSチューブに40μmのナイロン細胞ストレーナーを通して2％FCS-FACS緩衝液とピペット400μlの中で再懸濁します。
5.次のゲーティング戦略を使用してください：
- FSC / SSCプロット（ 図1）上にあるブラストリンパ球集団からCD45R（B220）陽性細胞を分離します。
- B220陽性細胞からは、対応する集団を明らかにしたIgEおよびIgG1プロットを使用しています。
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Representative Results
この手順が正常マウスB細胞におけるIgEへのCSRを研究するために実施されている。先に説明したように11 CSRの測定効率を実証するために、我々は、抗CD40及びIL-4、マウス脾臓B細胞を刺激した。刺激の5日後、細胞を回収し、プロトコル蛍光標識されたIgM、IgG1を、IgEの、およびB220（CD45R）抗体を用いて上記の染色を用いて処理した。ブラストリンパ球（ 図1）にゲート、明確なIgEの人口+細胞がきれいにトリプシン処理（ 図2a）なしで識別することができません。しかし、固定および透過前の細胞のトリプシン処理は、表面結合IgEの除去にIgE産生細胞（ 図2b）の分離を可能にします。
図1：FORWIL-4および抗CD40とともに培養における刺激の5日後、マウスの脾臓B細胞の側方散乱FACSプロット対アード。ブラストリンパ球総数取得イベントの63％を占める。
図2：活性化したB細胞におけるIgEおよびIgG1の細胞質染色に対するトリプシンの効果（a、b）の培養物中で活性化した後に129 / B6混合バックグラウンドマウスから脾臓B細胞をブラストにゲートをFACS（上記）のプロット及びヒストグラム（下）抗CD40およびIL-4とともに5日間培養した。単独で固定し、メタノール透過性（a）およびトリプシン（b）は添加して示されている。
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Discussion
抗CD40およびIL-4とともに培養中のマウス脾臓B細胞の刺激は、IgG1およびIgE 5へのクラススイッチを促進し、Tヘルパー2型（T H 2）の相互作用をシミュレートする。 B細胞は、総脾臓細胞12または精製された脾臓B細胞11の文脈においてCSRのために活性化することができる。プロトコル（段階2.3）で述べたように、B細胞の濃縮は、任意であり、それは有益だろうかどうかを決定するために、実験者の判断である。 CD45R（B220）を使用して、B細胞の正の磁気分離は、ビーズが、ここで利用される標識。分離した後、それはB細胞濃度が適切なサイトカインおよび抗体刺激のための1.0×10 6細胞/ mlに調整することができるようにFACSにより細胞の純度を確認することが推奨される。また、それは、凍結/解凍サイクルを経たIL-4タンパク質は活性が低下したかもしれないことに留意すべきである。
事前の固定および透過に対する細胞のトリプシン処理をaccurが可能にフローサイトメトリー（ 図2）を介してクラススイッチの測定を食べた。細胞の適切なトリプシン処理は、この手順の適用が成功に不可欠です。 FCSは、トリプシンを阻害することができるように、1×PBS洗浄の前トリプシン処理工程に行われる。我々は、室温で30秒のインキュベーションは完全な消化のために十分であることを見出し。より長い時間が顕著に細胞の生存率に影響を与えることができる。
分析の前に、トレースのメタノールを除去するためにPBSで細胞を複数回洗浄することが不可欠である。メタノールのキャリーオーバーは13抗体結合を変化させることができ、下流のフローサイトメトリー分析14で使用FCSからタンパク質を沈殿させることができる。この点で、他の透過化方法（ すなわちサポニン）メタノールを使用する代わりにすることができる。界面活性剤は、膜インテグリティ15を破壊しながら、メタノールは、膜脂質を溶解する有機溶媒である。メタノール透過性の利点は、拡張ストレージの能力であるC 14 -20℃で固定した細胞の。
この手順を使用するときに心に留めておくべきいくつかの制限があります。切断するタンパク質残基をトリプシンので、いくつかのFACSの汚れは、治療後の異なる表示されたり、完全にエピトープを標的に結合する能力を失う可能性があります。さらに、トリプシン処理後の細胞数の損失が発生する可能性があります。我々は、個々のハイブリドーマクローン11の抗体の分泌を測定することから収集クラススイッチングデータを明らかに匹敵するこの方法を発見したしかし、これは、IgE CSR測定の精度に影響を与えるとは思われない。
他の方法は、IgE産生マウスのB細胞を検出することが報告されている。 18 -一つの方法は、IgE発現細胞16上の膜結合IgEについて染色する前に、受容体結合IgEを除去するために酸洗浄手順を使用する。別の方法は、細胞permeabiliz前にすべての表面のIgEをブロックするモノクローナル抗IgE抗体を使用してIgEの発現細胞19の細胞内IgEのためのATIONと染色。さらに、最近の研究のIgM +、IgDの+はIgG +およびIgA + B細胞サブセット20を除外して、ヒトにおけるIgEスイッチB細胞集団を同定するために、8色FACSパネルをプロファイリング。これらの他の方法に比べて、ここで説明する方法は、酸洗浄変性の使用を回避し、過剰な抗体が必要ではない。
この手順の利点は、IgEに対するCSRの測定のために特異的なモノクローナル抗体を規定していないということである。代替の抗IgEモノクローナル抗体は、内因性のIgE分子を検出することが示されている。ハイブリドーマクローンはR1E4ではなく、細胞親和性IgEがCD23 21,22に結合している唯一の内因性の表面分子に特異的なラット抗マウスモノクローナルIgE抗体が生成されますが、市販されていない。それは一般的なラボreageを使用しているため、上記のプロトコルは、便利で経済的です。NTS。による細胞親和性のIgEに対するIgE信号処理（ 図2）の後に減少するので、おそらくここで使用した抗IgE抗体は、トリプシン媒介性切断に感受性の部位で受容体結合IgEに結合する。しかし、このプロトコルを実行する研究者は、実験のために市販のクローンの範囲から選択する自由がある。さらに、細胞表面タンパク質を除去するためにトリプシンを使用する概念は、FACS分析により、他の細胞マーカーの検出に拡張することができる。
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Acknowledgments
DRWは、NIHの助成金AI089972とAI113217によってサポート、および粘膜免疫研究チームによると、バローズウェルカム基金からの医学者のためのキャリア賞を保持している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
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