Abstract
B اللمفاويات المناعي السلسلة الثقيلة (IGH) إعادة التركيب تبديل فئة (CSR) هو عملية حيث أعرب في البداية الغلوبولين المناعي بالتبديل إلى isotypes IGH أخرى، مثل ايغا، فريق الخبراء الحكومي الدولي ومفتش. قياس IGH CSR في المختبر هو الطريقة الرئيسية لدراسة عدد من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين إعادة التركيب وإصلاح الحمض النووي لجوانب علم المناعة الجزيئية والخلوية. في المختبر CSR فحص ينطوي على تدفق cytometric سطح قياس التعبير IG على خلايا B تفعيلها. في حين قياس ايغا ومفتش فرعية واضح ومباشر، وقياس إيج بواسطة هذه الطريقة هو إشكالية بسبب ذوبان فريق الخبراء الحكومي الدولي ملزم لFcεRII / أعرب CD23 على سطح خلايا B تفعيلها. نحن هنا وصف الإجراء فريدة من نوعها لقياس دقيق لإيج المنتجة للخلايا فأر B التي خضعت المسؤولية الاجتماعية للشركات في الثقافة. وتستند هذه الطريقة على بوساطة التربسين الانقسام المجمعات إيج-CD23 على سطوح الخلايا، مما يسمح للكشف عن إيج المنتجة للخلايا B النسب التي كتبها قبرصيتلطيخ toplasmic. يقدم هذا الإجراء حلا ملائما لتحليل تدفق cytometric من المسؤولية الاجتماعية للشركات لفريق الخبراء الحكومي الدولي.
Introduction
خلال المناعي السلسلة الثقيلة (IGH) إعادة التركيب تبديل فئة (CSR) في الفئران والبشر، وIGH μ يتم حذف الإكسونات المنطقة ثابتة (Cμ) والاستعاضة عن واحدة من عدة مجموعات من المصب الإكسونات المنطقة ثابتة (C H ق) (على سبيل المثال Cγ، Cε، وCα)، مما أدى إلى التحول من إنتاج الغلوبولين المناعي لإنتاج الطبقات الإيج أخرى (على سبيل المثال مفتش، فريق الخبراء الحكومي الدولي، أو ايغا). يحدث CSR داخل التبديل (S) المناطق، والتي هي 1-10 متواليات كيلوبايت تقع 5 'إلى كل مجموعة من C H ق 1. انزيم تفعيل الناتج عن سيتيدين نازعة أمين (AID) يبدأ CSR عبر النشاط سيتيدين نزع الأمين.
فريق الخبراء الحكومي الدولي هو الوسيط الرئيسي من أمراض الحساسية (2) وفهم أكبر لكيفية إنتاج إيج وينظم قد فتح الأبواب أمام طرق علاجية جديدة لمرض الجلد التأتبي. في الفئران والبشر، فريق الخبراء الحكومي الدولي هو الإيج نمط إسوي ينظم الأكثر بإحكام. تم الكشف عن فريق الخبراء الحكومي الدولي عادة عند مستويات الآلاف من تيموفاق أقل من غيرها من IGH isotypes 3، ولكن يمكن أن تكون مرتفعة للغاية في الحالات المرضية 4. ومع ذلك، المسؤولية الاجتماعية للشركات لفريق الخبراء الحكومي الدولي وغير مفهومة تماما. في المختبر تنشيط خلايا B يستخدم IL-4 في تركيبة مع أي من مكافحة CD40 أو LPS، يدفع المسؤولية الاجتماعية للشركات على حد سواء IgG1 وفريق الخبراء الحكومي الدولي 5. خلايا B تفعيلها تعبر عن وجهة منخفضة تقارب إيج مستقبلات FcεRII / CD23 2،6، الذي يربط ذوبان إيج يفرز في الثقافة بعد CSR. لذلك عند تحليل مع التدفق الخلوي، الخلايا البائية مع مستقبلات محددة إيج وصمة عار على نحو مماثل لB الخلايا معربا عن التطور الطبيعي إيج 7. في حين أنه من المعروف أن الفأر B خلايا تعبر عن وجهة تقارب منخفضة مفتش مستقبلات FcγRIIB1 (CD32) 8، في تجربتنا أنه لا يبدو أن تتداخل مع قياس درجة التحول إلى IgG1. ومع ذلك، عند قياس إيج التبديل بعد تنشيط الخلايا B في الثقافة، وفريق الخبراء الحكومي الدولي ملزمة أرض غير محددة قد تحجب التحليل. مع أساليب تلطيخ المشتركة، والخلايا غير إيج-التعبير عن وصمة عار إيجابيا لفريق الخبراء الحكومي الدولي.
المبين هنا هو الاستراتيجية التي تم استخدامها لإجراء فحوصات CSR وكشف عن خلايا B-التعبير عن فريق الخبراء الحكومي الدولي الحقيقية من الفئران 9-11. علاج الخلايا B تفعيلها مع التربسين، كاشف مختبر مشترك لهضم البروتين، ويزيل سطح كل من cytophylic وغشاء ملزمة الجلوبيولين. permeabilization لاحق وتلطيخ للحشوية إيج بالتالي يكشف عن الخلايا المنتجة للإيج الحقيقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: جميع التجارب الموصوفة هنا كانت وفقا للمبادئ التوجيهية لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) والتي وافقت عليها مستشفى البحوث الحيوانية للطفولة (ARCH)، بوسطن، ماساشوستس.
1. إعداد الكواشف
- 1،000x IL-4 المخزون: تمييع IL-4 خلوى إلى 20 ميكروغرام / مل في H 2 O أو 0.1٪ ألبومين المصل البقري (BSA). الاستغناء في 200 مكل إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 ° C.
- 1،000x مكافحة CD40: الحصول من الشركة المصنعة في 1.0 ملغ / مل، وتخزينها في 4 ° C.
- B سائل الإعلام تحفيز الخلايا: ل425 مل من المتوسط RPMI-1640، إضافة 75 مل من إذابة حديثا مصل العجل الجنين (FCS)، و 10 مل من 1.0 M HEPES العازلة، 5 مل-L الجلوتامين الأسهم، 5 مل البنسلين: الأسهم الستربتومايسين، 5 مل الحد الأدنى الأساسية المتوسطة غير الضرورية الأحماض الأمينية ميكرولتر (MEM-NEAA)، و 3.5 من 2 المركابتويثانول. حافظ على وسائل الإعلام في 4 مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. إضافة IL-4 (20 نانوغرام / مل)، ومكافحة CD40 (1.0 ميكروغرام / مل) على الفور قبل الاستخدامفقط لحجم وسائل الاعلام المطلوبة.
- 2٪ FCS-FACS العازلة: إضافة 10 مل من FCS إلى 490 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الحفاظ على 4 درجات مئوية.
- 2X التربسين-EDTA الحل: تمييع 5 مل من 10X التربسين-EDTA حل سهم (5.0 غرام التربسين، 2.0 غ EDTA لكل لتر) في 20 مل من برنامج تلفزيوني 1X. متجر التربسين-EDTA في 2X مأخوذة العمل في 4 درجات مئوية. السماح لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- الجنين مصل العجل: حافظ FCS إذابة عند 4 مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. ضع على الجليد لمدة 15 دقيقة قبل الإجراء تلطيخ حشوية.
- محايدة مخزنة الفورمالين: إعداد محلول الفورمالين 10٪ (3.7٪ امتصاص العرق). الفورمالين مادة سامة، وبالتالي التعامل معها في ظل مختبر غطاء الدخان في حين يرتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة. متجر الفورمالين في درجة حرارة الغرفة في خزانة تخزين المواد الكيميائية.
- الميثانول: مخزن الميثانول المطلق (100٪) في -20 درجة مئوية حتى الخلايا جاهزة للpermeabilized. لاحظ أن الميثانول هو قابل للاشتعال ويجب أن يتم تخزين في الفريزر المناسب.
2.تنقية وتنشيط خلايا B
- من الطحال الماوس المقطوع حديثا، إعداد تعليق خلية واحدة عن طريق الضغط بلطف الجهاز من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر مع المكبس من حقنة 3 مل. في 15 مل مخروطي أنبوب الطرد المركزي، وجمع الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- صب وطاف و resuspend بيليه في 1 مل من خلايا الدم الحمراء الناشر العازلة لمدة 5 دقائق. تحييد مع 13.5 مل من برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- (اختياري) فصل مغناطيسيا خلايا B استخدام الألغام المضادة للCD45R (B220) -labeled الخرز، وبعد بروتوكول تنقية MACS وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تحفيز خلايا B المنقى عند 1.0 × 10 6 خلية / مل في درجة حرارة سائل الإعلام B تحفيز الخلية التي تحتوي IL-4 (20 نانوغرام / مل)، ومكافحة CD40 (1.0 ميكروغرام / مل) لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية. تبدأ مع 8 مل من ثقافة مقسمة إلى 2 آبار لوحة الثقافة 6-جيدا (4 مل لكل منهما).
- تحقق cultuإعادة يوميا للحفاظ على 1.0 × 10 6 خلية / مل. ضبط التركيز عن طريق تقسيم في الآبار الأخرى وتمييع الثقافة مع وسائل الإعلام تحفيز الخلايا B التي تحتوي على IL-4 الطازجة ومكافحة CD40.
3. Trypsinization، التثبيت، وPermeabilization
- Trypsinization
- جمع ما يصل إلى 1.0 × 10 7 من الخلايا المستزرعة في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وصب طاف.
- تغسل مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة البروتين المتبقية من وسائل الإعلام جمع الخلية. كرر الخطوة الطرد المركزي وصب طاف.
- Resuspend وبيليه الخلية في حجم المتبقي بعد الصب (حوالي 100 ميكرولتر).
- إضافة بعناية 800 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 0.1٪ (2X) التربسين-EDTA إلى الخلايا. الاستغناء ببطء في زاوية 45 درجة أسفل الجانب من أنبوب مخروطي الشكل.
- إغلاق أنبوب وتخلط بلطف عن طريق إمالة الأنبوب بحيث يعمل السائل على طول الوقت أنبوب 5-6الصورة. ربما يتكون مفتول العضلات، راسب أبيض في الحل. يحدد الوقت trypsinization إلى تحت دقيقة.
- إخماد رد فعل trypsinization مع 1 مل من FCS الباردة. تمييع FCS على الفور بإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
- الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ثم صب طاف والعودة الأنابيب إلى جليد.
- تثبيت
- resuspend الخلايا في حجم المتبقي بعد الصب. إذا لزم الأمر، وجلب حجم ما يصل الى 100 ميكرولتر مع PBS الباردة.
- في غطاء الدخان، إضافة 800 ميكرولتر من 10٪ محايد حل الفورمالين مخزنة على الخلايا والماصة صعودا وهبوطا. أنبوب سوف الحارة على إضافة الفورمالين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- Permeabilization
- انشاء خلاط دوامة الفوق في طيف سرعة اهتزاز.
- رسم 9 مل من البرد (-20 ° C) الميثانول إلى 10 مل الماصة المصلية.
- امسك الأنبوب الذي يحتوي على خلايا على مدى خلاط دوامة والبدء بلطف شاكينز الخلايا.
- إضافة الميثانول الباردة إلى الأنبوب حتى يسقط قطرة قطرة على الخلايا في حين أن أنبوب ما زال يهتز بحيث الميثانول هو خلط باستمرار. بعد مل 2 الأولى من الميثانول يمكن زيادة سرعة صرفها إلى دفق بطيئة.
- السماح للأنبوب الجلوس على الجليد لمدة 30 دقيقة لإتمام permeabilization. بدلا من ذلك، فإن الخلايا يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر.
4. الإسفار تلطيخ لIgG1 وإيج الدرجة التبديل
- عينة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق وصب الحل الميثانول. راسب أبيض قد بيليه مع الخلايا.
- إضافة 10 مل من درجة حرارة الغرفة 1X PBS وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق لغسل الخلايا. أكرر مرة واحدة. ملاحظة: غسل بيليه مع درجة حرارة الغرفة PBS يذوب راسب الإضافية التي قد تشكل بعد الخطوة 4.1.
- إجراء غسل إضافي مع 10 مل من 2٪ FCS-FACS العازلة.
- توزيع العينات إلى 96-جيدا جولة وحة أسفلوأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. صب طاف ووضع لوحة على الجليد.
- وصمة عار في 60 ميكرولتر من 2٪ FCS-FACS العازلة لكل بئر مع التخفيفات الأجسام المضادة التالية: مكافحة الغلوبولين المناعي RPE / Cy7، 1: 200، ومكافحة IgG1 PE، 1: 600، ومكافحة إيج FITC، 1: 100، المضادة لل CD45R (B220) PerCP-Cy5.5، 1: 200
- بعد 5 دقائق من تلطيخ، وغسل لوحة مع 150 ميكرولتر من 2٪ FCS-FACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
- resuspend في 400 ميكرولتر من 2٪ FCS-FACS العازلة والماصة خلال 40 ميكرون خلية النايلون مصفاة إلى 5 مل FACS الأنبوب.
5. استخدم استراتيجية المحاصرة وبعد:
- عزل CD45R (B220) خلايا إيجابية من السكان التفجير الخلايا اللمفاوية تقع على FSC / قطعة التعاون بين بلدان الجنوب (الشكل 1).
- من الخلايا إيجابية B220، استخدم فريق الخبراء الحكومي الدولي وIgG1 مؤامرة للكشف عن السكان المقابلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد تم تنفيذ هذا الإجراء بنجاح لدراسة CSR إلى إيج في خلايا فأر B. لإثبات كفاءة في قياس المسؤولية الاجتماعية للشركات، ونحن حفز الماوس خلايا B الطحال مع مكافحة CD40 وIL-4 كما هو موضح سابقا (11). بعد خمسة أيام من التحفيز، تم جمع الخلايا ومعالجتها باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه وملطخة fluorescently المسمى الغلوبولين المناعي، IgG1، فريق الخبراء الحكومي الدولي، وB220 (CD45R) الأجسام المضادة. بوابات على الخلايا الليمفاوية التفجير (الشكل 1)، عدد سكانها واضح لفريق الخبراء الحكومي الدولي + الخلايا لا يمكن التمييز نظيفة من دون علاج التربسين (الشكل 2A). ومع ذلك، trypsinization الخلايا قبل تثبيت وpermeabilization يمكن فصل الخلايا المنتجة للإيج (الشكل 2B) وذلك بسبب إزالة محددة سطح إيج.
الشكل 1: ForwARD مقابل الجانب مبعثر FACS مؤامرة من خلايا فأر الطحال B بعد 5 أيام من التحفيز في الثقافة مع IL-4 و مكافحة CD40. كما انتقد الخلايا الليمفاوية تشكل 63٪ من إجمالي المكتسبة الأحداث.
الشكل 2: تأثير التربسين على تلطيخ حشوية من فريق الخبراء الحكومي الدولي وIgG1 في خلايا B تفعيلها (أ، ب) المؤامرات FACS (أعلاه) ورسوم بيانية (أدناه) بوابات على التفجير خلايا B الطحال من 129 / B6 الفئران خلفية مختلطة بعد التنشيط في الثقافة لمدة 5 أيام مع مكافحة CD40 وIL-4. تثبيت والميثانول permeabilization وحدها (أ) و مع إضافة التربسين (ب) ترد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
سوف تحفيز الماوس الطحال خلايا B في الثقافة مع مكافحة CD40 وIL-4 محاكاة T نوع المساعد 2 (T H 2) التفاعلات، وتشجيع التحول فئة لIgG1 وفريق الخبراء الحكومي الدولي 5. خلايا B يمكن تفعيلها عن المسؤولية الاجتماعية للشركات في سياق من إجمالي splenocytes 12 أو خلايا B الطحال تنقيته الى 11. كما لوحظ في بروتوكول (الخطوة 2.3)، B تخصيب الخلية هو اختياري، وغير بناء على تقدير المجرب لتحديد ما إذا كان سيكون مفيدا. الفصل المغناطيسي الإيجابي للخلايا B باستخدام CD45R (B220) -labeled يستخدم حبات هنا. بعد الانفصال، فمن المستحسن للتحقق من نقاء الخلية FACS بحيث يمكن تعديل تركيز الخلية B إلى 1.0 × 10 6 خلية / مل لخلوى السليم وتحفيز الأجسام المضادة. كما تجدر الإشارة إلى أن IL-4 البروتين الذي خضع لتجميد / دورات ذوبان الجليد قد انخفض النشاط.
Trypsinization الخلايا قبل تثبيت وpermeabilization يسمح للaccurأكل قياس درجة التحول عن طريق التدفق الخلوي (الشكل 2). trypsinization السليم للخلايا هو أمر حيوي لنجاح تطبيق هذا الإجراء. كما FCS يمكن أن تمنع التربسين، يتم تنفيذ يغسل PBS 1X قبل الخطوة trypsinization. وجدنا الحضانة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة كافية لعملية الهضم الكامل. يمكن فترات أطول تؤثر بشكل ملحوظ بقاء الخلية.
قبل التحليل، فمن الضروري غسل الخلايا عدة مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة آثار الميثانول. الميثانول المرحل قد يغير الأجسام المضادة ملزمة 13 ويمكن أن يعجل من البروتينات FCS المستخدمة في تدفق المصب تحليل cytometric 14. في هذا الصدد، وأساليب permeabilization الأخرى (أي سابونين) قد يكون بديل لاستخدام الميثانول. الميثانول هو المذيبات العضوية أن يذوب الدهون غشاء، بينما المنظفات تعطيل غشاء سلامة 15. وهناك فائدة لالميثانول permeabilization هي قدرة التخزين الموسعةالخلايا الثابتة في -20 ° C 14.
هناك بعض القيود أن نأخذ في الاعتبار عند استخدام هذا الإجراء. لأن التربسين يشق بقايا البروتين، قد تظهر بعض البقع FACS مختلفة بعد العلاج، أو قد يفقد القدرة على ربط لاستهداف الحواتم تماما. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحدث خسارة في عدد الخلايا بعد العلاج التربسين. ومع ذلك، هذا لا يبدو أن تؤثر على دقة القياسات إيج CSR كما وجدنا هذا الأسلوب لتكون قابلة للمقارنة بوضوح إلى بيانات تم جمعها من الدرجة التبديل قياس الأجسام المضادة إفرازات من الحيوانات المستنسخة هجين الفردية 11.
وقد تم الإبلاغ عن طرق أخرى للكشف عن إيج المنتجة للخلايا فأر B. يستخدم أسلوب واحد إجراء غسل حمض لإزالة محددة مستقبلات إيج قبل تلطيخ لبغشاء إيج على الخلايا فريق الخبراء الحكومي الدولي، معربا عن 16-18. يستخدم طريقة أخرى لوحيدة النسيلة المضادة للإيج الأجسام المضادة لمنع كل سطح إيج قبل permeabiliz خليةأوجه وتلطيخ لفريق الخبراء الحكومي الدولي داخل الخلايا من الخلايا فريق الخبراء الحكومي الدولي، معربا عن 19. وعلاوة على ذلك، لمحة دراسة حديثة لجنة FACS ثمانية اللون لتحديد إيج تبديل B السكان الخلية لدى البشر من خلال استبعاد الغلوبولين المناعي +، الجمعية الإسلامية +، + مفتش وايغا + B فرعية خلية 20. مقارنة هذه الأساليب الأخرى، وطريقة وصفها هنا يتجنب استخدام تغيير طبيعة يغسل حامض، والأجسام المضادة الزائدة ليست ضرورية.
وهناك فائدة لهذا الإجراء هو أنه لا يصف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة محددة لقياس المسؤولية الاجتماعية للشركات لفريق الخبراء الحكومي الدولي. وقد ثبت لمكافحة فريق الخبراء الحكومي الدولي الاجسام المضادة بديلة للكشف عن جزيئات الوحيدة إيج الذاتية. استنساخ هجين R1E4 تنتج الفئران لمكافحة فأر وحيدة النسيلة فريق الخبراء الحكومي الدولي الأجسام المضادة المحددة فقط لجزيئات سطح الذاتية، وليس أليف للخلايا إيج بد أن CD23 21،22، ولكنها ليست متاحة تجاريا. بروتوكول الموصوفة أعلاه هو مريحة واقتصادية لأنه يستخدم reage مختبر مشتركاليلة. الأجسام المضادة لمكافحة إيج المستخدمة هنا المرجح بربط إيج في موقع حساس لبوساطة التربسين الانقسام، لأن إشارة فريق الخبراء الحكومي الدولي بسبب أليف للخلايا إيج يتم تقليل بعد المعاملة ملزمة مستقبلات (الشكل 2). لكن الباحثين تنفيذ هذا البروتوكول لها حرية الاختيار من بين مجموعة من الحيوانات المستنسخة المتاحة تجاريا لإجراء التجارب. وعلاوة على ذلك، فإن مفهوم استخدام التربسين لإزالة بروتينات سطح الخلية ويمكن تمديد للكشف عن علامات الخلايا الأخرى عن طريق تحليل FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ويدعم DRW من المنح NIH AI089972 وAI113217، وفريق الدراسات المناعة المخاطية، وحاصل على جائزة الوظيفي للعلماء الطب من صندوق ويلكوم بوروز.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
