Abstract
B-лимфоцит тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) коммутатор класса рекомбинации (КСО) является процесс, в котором изначально выразил IgM переключается на другие IgH изотипами, таких как IgA, IgE и IgG. Измерение IgH КСО в пробирке является основным методом для изучения ряда биологических процессов, начиная от рекомбинации ДНК и ремонт, чтобы аспектах молекулярной и клеточной иммунологии. В пробирке КСО анализ включает измерительной поверхности Ig выражение проточной цитометрии на активированных В-клеток. В то время как измерение IgA и IgG подклассов проста, измерение IgE с помощью этого метода является проблематичным в связи с растворимыми IgE связывания с FcεRII / CD23 экспрессируется на поверхности активированных В-клеток. Здесь мы опишем уникальная процедура для точного измерения IgE-продуцирующих мыши В-клетки, которые прошли КСО в культуре. Метод основан на трипсина-опосредованного расщеплени IgE-CD23 комплексов на поверхности клеток, что обеспечивает обнаружение IgE-продуцирующих В клональные клеток путем CYtoplasmic окрашивание. Эта процедура предлагает удобное решение для проточной цитометрии анализа КСО IgE.
Introduction
Во время тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) коммутатор класса рекомбинации (КСО) у мышей и людей, IgH μ постоянные экзоны область (cz М) удаляются и заменяются одним из нескольких наборов вниз по течению постоянных экзонов области (C H) (например Cγ, с £ и Са), в результате чего переход от производства IgM к производству других классов Ig (например, IgG, IgE, IgA или). КСО происходит в течение переключатель (S) регионов, которые 1-10 кб последовательности, расположенные 5 'к каждому набору C H S 1. Вызванные активацией цитидиндеаминаза (AID) фермент инициирует КСО с помощью цитидиновое дезаминирования деятельности.
IgE является ключевым медиатором аллергических заболеваний 2 и более глубокое понимание того, как IgE производится и регулируется может открыть двери для новых терапевтических подходов к атопическим заболеванием. У мышей и человека, IgE является наиболее жестко регулируется Ig изотипа. IgE, как правило, обнаруживается на уровнях тысяч ТимаES меньше, чем другие изотипы IgH 3, но может быть значительно выше у болезненных состояний 4. Тем не менее, КСО IgE не полностью поняты. В пробирке активации В-клеток с помощью IL-4 в комбинации с любой анти-CD40 или LPS индуцирует КСО как IgG1 и IgE 5. Активированные В-клетки выразить низким сродством IgE рецептор FcεRII / CD23 2,6, который связывает растворимый IgE, секретируемый в культуре после КСО. Поэтому при анализе с проточной цитометрии, В-клетки с рецептором IgE связаны пятна аналогично B клетки, эндогенно экспрессирующих IgE 7. Хотя известно, что мыши B-клетки экспрессируют низкое сродство рецептора IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, в нашем опыте это не по всей видимости, мешает измерению класса переключение на IgG1. Тем не менее, при измерении переключение IgE после активации В-клеток в культуре, неспецифический поверхностно-св занный IgE может скрывать анализ. С общими методами окрашивания, не-IgE-экспрессирующие клетки окрашиваются положительно для IgE.
Изложенные здесь стратегия, которая была использована для проведения КСО анализов и выявления истинных IgE-выражения В-клеток у мышей, 9 - 11. Лечение активированных В-клеток с трипсином, общий лаборатории реагент, чтобы переварить белок, устраняет как cytophylic и мембраной поверхность IgE. После пермеабилизации и окрашивание цитоплазмы IgE, таким образом, показывает истинное IgE-продуцирующих клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты, описанные здесь, были в соответствии с институциональными Комитет Уход за животными и использование (IACUC) руководящие принципы и одобрен Animal Research детской больницы (арку), Бостон, штат Массачусетс.
1. Подготовка реагентов
- 1,000x ИЛ-4 на складе: Развести IL-4, цитокин с 20 мкг / мл в H 2 O и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Не включать в 200 мкл аликвоты по 1,5 мл микроцентрифужных труб и хранить при -20 ° С.
- 1,000x анти-CD40: Получить от производителя по 1,0 мг / мл, хранят при 4 ° С.
- В стимуляции клеток носитель: до 425 мл средой RPMI-1640, добавить 75 мл свежей талой фетальной телячьей сыворотки (FCS), 10 мл 1,0 М HEPES буфера, 5 мл L-глутамина на складе, 5 мл пенициллина: Стрептомицин складе, 5 мл минимально необходимой среды Non-незаменимые аминокислоты (MEM-NEAA) и 3,5 мкл 2-меркаптоэтанола. Храните носители при 4 ° С в течение недели. Добавить IL-4 (20 нг / мл) и анти-CD40 (1,0 мкг / мл) непосредственно перед использованиемтолько с объемом сред, необходимых.
- 2% FCS-FACS буфера: Добавить 10 мл FCS в 490 мл 1х PBS. Хранить при 4 ° С.
- 2x трипсина-ЭДТА раствор: развести 5 мл 10х трипсина-ЭДТА маточного раствора (5,0 г трипсина, 2,0 г ЭДТА на литр) в 20 мл 1x PBS. Магазин трипсин-ЭДТА в 2 раза работы аликвот при 4 ° С. Дайте нагреться до комнатной температуры перед использованием.
- Эмбриональной телячьей сыворотки: Держите размороженные ФТС, при 4 ° С на срок до двух недель. Место на льду 15 мин до цитоплазматической процедуры окрашивания.
- Обычный-буферный формалин: Подготовка 10% раствор формалина (3,7% параформальдегида). Формалин является токсичным, и поэтому справиться с этим в лабораторных вытяжкой при ношении соответствующие средства индивидуальной защиты. Магазин формалина при комнатной температуре в корпусе химического хранения.
- Метанол: Хранить абсолютный метанол (100%) при температуре от -20 ° С до тех пор, пока клетки готовы быть проницаемыми. Следует отметить, что метанол является горючим и должны быть сохранены в соответствующем морозильной камеры.
2.Очистка и активация В-клеток
- С свеже-заготовленной селезенки мыши, подготовить суспензии отдельных клеток, слегка нажав орган через сито 70 мкм клетки с плунжера 3 мл шприца. В 15 мл коническую центрифужную пробирку, собрать клетки в 10 мл 1x PBS и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
- Декантировать супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл красных кровяных клеток лизиса буфера в течение 5 мин. Нейтрализовать с 13,5 мл 1x PBS и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин.
- (Необязательно) Магнитное разделение В-клеток с использованием анти-CD45R (B220) меченных бусы, после очистки протокола MACS согласно инструкциям производителя.
- Стимулирование очищенные В-клетки в 1,0 × 10 6 клеток / мл в нагретой стимуляции В-клеток среде, содержащей IL-4 (20 нг / мл) и анти-CD40 (1,0 мкг / мл) в течение 5 дней при 37 ° С. Начнем с 8 мл культуры, разделенных на две лунки культурального планшета (4 мл каждый) 6-а.
- Проверьте cultuповторно каждый день, чтобы поддерживать в 1,0 × 10 6 клеток / мл. Регулировка концентрации путем разделения в другие лунки и разбавления культуры при стимуляции В-клеток свежую среду, содержащую IL-4 и анти-CD40.
3. трипсинизации Фиксация и пермеабилизирующего
- Трипсинизации
- Собрать до 1,0 х 10 7 культивируемых клеток в 15 мл коническую трубку, центрифуги при 300 мкг в течение 5 мин и сливают надосадочную жидкость.
- Промыть 10 мл PBS для удаления остаточного белка из коллекции клеточных сред. Повторите шаг центрифугирования и декантируют супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в остаточного объема после декантации (около 100 мкл).
- Осторожно добавьте 800 мкл комнатной температуре 0,1% (2x) трипсина-ЭДТА в клетки. Не включать медленно под углом 45 ° вниз по боковой стороне коническую трубку.
- Закройте трубку и осторожно перемешать, наклоняя трубку так, жидкость проходит по длине трубки 5-6 разс. Волокнистые, белый осадок, могут образовывать в растворе. Ограничьте время трипсинизации в рамках мин.
- Гасят реакцию трипсином с 1 мл холодного FCS. Развести FCS сразу же путем добавления 10 мл холодной PBS.
- Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, затем декантируют супернатант и возврата трубки в лед.
- Фиксация
- Ресуспендируют клеток в остаточного объема после декантации. Если необходимо, довести объем до 100 мкл с холодным PBS.
- В вытяжном шкафу, добавить 800 мкл 10% нейтральном формалине с буфером раствора к клеткам и пипетки вверх и вниз. Трубка будет нагреваться при добавлении формалина. Инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин.
- Пермеабилизирующего
- Настройка настольный вихревой смеситель на осторожном встряхивании скорости.
- Draw 9 мл холодной (-20 ° C) метанола в 10 мл серологической пипеткой.
- Держите пробирку, содержащую клетки на вихревом смесителе и осторожно начать Шакинг клетки.
- Добавить холодным метанолом в трубе, так что по капле падает на клетках в то время как трубка все еще встряхивания, так что метанол непрерывном перемешивании. После первых 2 мл метанола скорость дозирования может быть увеличена в медленном потоке.
- Пусть трубка сидеть на льду в течение 30 мин, чтобы завершить пермеабилизации. Кроме того, эти клетки могут храниться при температуре -20 ° С в течение месяца.
4. флуоресценции окрашивания для IgG1 и IgE класса Переключение
- Центрифуга образца при 300 мкг в течение 5 мин и декантируют раствора метанола. Белый осадок может гранул с клетками.
- Добавить 10 мл комнатной температуре 1x PBS и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин, чтобы вымыть клетки. Повторить один раз. Примечание: Промывка осадка с водой комнатной температуры PBS растворяется дополнительный осадок, который может образоваться после шага 4.1.
- Выполнение дополнительного Промыть 10 мл 2% FCS FACS буфера.
- Распределить образцы в 96-луночных круглодонных пластиныи центрифуге при 300 х г в течение 5 мин. Слейте супернатант и поставил тарелку на льду.
- Пятно в 60 мкл 2% FCS FACS буфера на лунку со следующими антител разведений: Анти-IgM НПП / Cy7, 1: 200, анти-IgG1 ПЭ, 1: 600, анти-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
- Через 5 мин окрашивания, промыть пластины с 150 мкл 2% FCS, буфер-FACS и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г.
- Ресуспендируют в 400 мкл 2% FCS, буфер-FACS и пипеткой через сито нейлона клеток 40 мкм в 5 мл FACS трубы.
5. Используйте следующие Gating стратегии:
- Изолировать CD45R (B220) положительных клеток из популяции взрывных лимфоцитов, расположенной на FSC / SSC участка (рис 1).
- Из B220 положительных клеток, используйте IgE и IgG1 заговор с целью выявить соответствующие группы населения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта процедура была успешно реализована для изучения КСО IgE у мышей В-клеток. Чтобы продемонстрировать эффективность при измерении CSR, мы стимулировали мыши В-клетки селезенки с анти-CD40 и IL-4, как описано выше 11. Через пять дней после стимуляции, клетки были собраны и обработаны с использованием протокола, описанного выше и окрашивали флуоресцентно-меченного IgM, IgG1, IgE и В220 (CD45R) антител. Комплекс закрытого типа на взрывных лимфоцитов (рис 1), очевидно, население IgE + клеток не может быть чисто дискриминационный без обработки трипсином (Рис 2а). Тем не менее, трипсинизации клеток перед фиксацией и проницаемости обеспечивает разделение IgE-продуцирующих клеток (Фигура 2В) за счет удаления поверхностного связанного IgE.
Рисунок 1: ForwARD против бокового рассеяния FACS участок В-клеток мыши селезенки после 5 дней стимуляции в культуре с IL-4 и анти-CD40. Взрывные лимфоциты составляют 63% от общего объема приобретенного событий.
Рисунок 2:. Влияние трипсина на цитоплазматической окрашивания IgE и IgG1 в активированных В-клеток (б) FACS участки (вверху) и гистограммы (ниже) с воротами на подрыв селезенки В-клетки от 129 / B6 смешанного происхождения мышей после активации в культуре в течение 5 дней с анти-CD40 и IL-4. Фиксация и метанола пермеабилизации одна (а) и с добавлением трипсина (б) показаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стимуляция мыши селезенки В-клеток в культуре с анти-CD40 и IL-4 будет имитировать Т-хелперов 2-го типа (T H 2) взаимодействие, поощрение переключение класса для IgG1 и IgE 5. В-клетки могут быть активированы для КСО в контексте общего спленоцитов 12 или в очищенных В-клеток селезенки 11. Как отмечено в протоколе (этап 2.3), обогащение В-клеток не является обязательным, и, по усмотрению экспериментатора, чтобы определить, было бы полезно. Положительный магнитной сепарации В-клеток с использованием CD45R (B220) меченных бусы здесь используют. После разделения, рекомендуется, чтобы проверить на чистоту с помощью FACS клеток таким образом, что концентрация В-клеток может быть настроен на 1,0 × 10 6 клеток / мл для надлежащего цитокинов и стимуляции антител. Кроме того, следует отметить, что ИЛ-4 белок, который претерпел замораживания / оттаивания циклов, возможно, снижение активности.
Трипсином клетки до фиксации и проницаемости позволяет проявляться неели измерение переключения класса с помощью проточной цитометрии (Фиг.2). Правильное трипсинизации клеток имеет жизненно важное значение для успешного применения этой процедуры. Как FCS может ингибировать трипсин, 1X PBS стирки выполняется перед стадией обработки трипсином. Мы обнаружили, 30 сек инкубации при комнатной температуре является достаточным для полного переваривания. Более длинные длительности могут оказывать заметное влияние на жизнеспособность клеток.
Перед анализом, важно, чтобы промыть клетки несколько раз с PBS, чтобы удалить следы метанола. Метанол перенос может изменить связывание антитела 13 и может ускорить белки из ФТС, используемые в вниз по потоку анализа цитометрического 14. В связи с этим, другие методы проницаемости (т.е. сапонин) может быть альтернативой использованию метанола. Метанол является органический растворитель, который растворяет мембранных липидов, в то время как моющие средства нарушить целостность мембраны 15. Польза для метанола проницаемости является способность длительного храненияосновных клеток при -20 ° С 14.
Есть некоторые ограничения, чтобы иметь в виду при использовании этой процедуры. Потому что трипсин расщепляет белковые остатки, пятна FACS могут отличаться после лечения, или может потерять способность к связыванию с полностью нацелены эпитопы. Кроме того, потери в числе клеток после обработки трипсином может произойти. Тем не менее, это, кажется, не влияет на точность измерений IgE КСО, мы нашли этот метод, чтобы быть четко сопоставимы с данными переключения класса, полученных от измерения антител выделения отдельных клонов гибридом 11.
Другие способы были зарегистрированы для обнаружения IgE-продуцирующих В-клеток мыши. Один способ использует процедуру кислотной промывки, чтобы удалить рецептор-связанным IgE до окрашивания для мембранно-связанной IgE на IgE-экспрессирующих клеток 16 - 18. Другой способ использует моноклональное анти-IgE антитела блокировать все поверхности IgE до клеточной permeabilizвания и окрашивания внутриклеточных IgE из IgE-клеток, экспрессирующих 19. Кроме того, недавнее исследование профилированного восемь цвета FACS панель для определения IgE-Switched населения В-клеток в организме человека, исключая IgM +, IgD +, IgG + и IgA + В-клеток подмножества 20. По сравнению с этими другими способами, способ, описанный здесь, позволяет избежать использования денатурирующих моет кислоты, и избыток антитела не являются необходимыми.
Преимуществом этой процедуры является то, что он не предписывает специфических моноклональных антител для измерения КСО к IgE. Альтернативные анти-IgE моноклональные антитела, как было показано, чтобы обнаруживать только эндогенные молекулы IgE. Клон гибридомы R1E4 производит крысы-анти-мышиное моноклональное антитело, специфичное IgE только для эндогенных поверхностных молекул, не cytophilic IgE связан с CD23 21,22, но его нет в продаже. Протокол, описанный выше, является удобным и экономичным, поскольку он использует общую лабораторную reageНТС. Анти-IgE антитела, используемые здесь, скорее всего связывается с рецептором связано IgE на сайте, чувствительных к трипсина-опосредованной расщепления, потому что сигнал IgE-за cytophilic IgE снижается после лечения (Рисунок 2). Однако исследователи, осуществляющие этот протокол имеет свободу выбора из целого ряда коммерчески доступных клонов для экспериментов. Кроме того, понятие с помощью трипсина, чтобы удалить белки клеточной поверхности может быть продлен до обнаружения других маркеров клеток путем анализа FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DRW поддерживается за счет грантов НИЗ AI089972 и AI113217, а также слизистой оболочки иммунологии исследований группы, и имеет награду карьеры для ученых-медиков из Wellcome Фонда Burroughs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
