Abstract
B-lymfocyter immunglobulin tung kedja (IgH-) klassbytesrekombination (CSR) är en process där en början uttryckte IgM växlar till andra IgH isotyper, såsom IgA, IgE och IgG. Mätning av IgH CSR in vitro är en viktig metod för att studera ett antal biologiska processer, från DNA-rekombination och reparation till aspekter av molekylär och cellulär immunologi. In vitro CSR-analys involverar flödescytometrisk mätytan Ig uttryck på aktiverade B-celler. Medan mätning av IgA- och IgG-subklasser är okomplicerad, är mätningar av IgE med denna metod problematisk på grund av löslig IgE-bindning till FceRII / CD23 uttrycks på ytan av aktiverade B-celler. Här beskriver vi en unik procedur för noggrann mätning av IgE-producerande mus B-celler som har genomgått CSR i kultur. Metoden är baserad på trypsin-medierad klyvning av IgE-CD23-komplexen på cellytor, vilket möjliggör detektion av IgE-producerande B-celler genom cytoplasmic färgning. Detta förfarande erbjuder en bekväm lösning för flödescytometrisk analys av CSR till IgE.
Introduction
Under immunglobulin tung kedja (IgH-) klassbytesrekombination (CSR) i möss och människor, μ IgH konstant regionexoner (Cμ) utgår och ersätts med en av flera uppsättningar nedströms konstant regionexoner (C H s) (t.ex. Cy, Ce och Ca), vilket resulterar i en övergång från produktion av IgM till produktion av andra Ig klasser (t.ex. IgG, IgE, eller IgA). CSR sker inom omkopplare (S) regioner som 1-10 kb sekvenser belägna 5 'till varje uppsättning av C H s 1. Aktiverings-Induced cytidindeaminas (AID) enzym initierar CSR via cytidin deaminering aktivitet.
IgE är en viktig förmedlare av allergisk sjukdom 2 och en större förståelse för hur IgE produceras och regleras kan öppna dörrar till nya terapeutiska strategier mot atopisk sjukdom. Hos möss och människor, är IgE den mest hårt reglerad Ig isotyp. IgE normalt upptäcks vid nivåer tusentals times mindre än andra IgH isotyper 3, men kan vara mycket förhöjda i sjukdomstillstånd 4. Emellertid CSR till IgE är ofullständigt känd. In vitro-aktivering av B-celler med användning av IL-4 i kombination med antingen anti-CD40 eller LPS, inducerar CSR både IgG1 och IgE 5. Aktiverade B-celler uttrycker låg affinitet IgE-receptorn FcsRII / CD23 2,6, som binder lösligt IgE utsöndras i kultur efter CSR. Därför när man analyserar med flödescytometri, B-celler med receptorbundet IgE fläck på liknande till B-celler endogent uttrycker IgE 7. Även om det är känt att musen B-celler uttrycker låg affinitet IgG-receptor FcγRIIB1 (CD32) 8, i vår erfarenhet det verkar inte störa mätningen av klassväxling till IgG1. Men när man mäter IgE växling efter B-cellsaktivering i kultur, kan ospecifika ytbundet IgE skymma analysen. Med vanliga färgningsmetoder, icke-IgE-uttryckande celler färgas positivt för IgE.
Skiss här är en strategi som har använts för att genomföra CSR-analyser och upptäcka verkliga IgE-uttryck B-celler från möss 9-11. Behandling av aktiverade B-celler med trypsin, till en gemensam labb reagens smälta protein, avlägsnar både cytophylic och membranbundna yta IgE. Efterföljande permeabilisering och färgning för cytoplasma IgE avslöjar därmed de verkliga IgE-producerande celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla experiment som beskrivs här var i enlighet med de institutionella Djurvård och användning kommittén (IACUC) riktlinjer och godkänts av Animal Research Barnsjukhus (ARCH), Boston, Mass.
1. Beredning av reagens
- 1,000x IL-4 Lager: Späd IL-4 cytokin till 20 | ig / ml i H2O eller 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Fördela i 200 pl alikvoter till 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C.
- 1,000x anti-CD40: Skaffa från tillverkaren vid 1,0 mg / ml, förvara vid 4 ° C.
- B-cellstimulering media: Till 425 ml av RPMI-1640-medium, tillsätt 75 ml av färskt tinade fetalt kalvserum (FCS), 10 ml av 1,0 M HEPES-buffert, 5 ml L-glutamin lager, 5 ml penicillin: Streptomycin lager, 5 ml Minimum Essential Medium Icke-essentiella aminosyror (MEM-NEAA), och 3,5 pl 2-merkaptoetanol. Håll medier vid 4 C i upp till en vecka. Lägg IL-4 (20 ng / ml) och anti-CD40 (1,0 Mg / ml) omedelbart före användningendast till volymen av media som krävs.
- 2% FCS-FACS buffert: Tillsätt 10 ml FCS till 490 ml 1 x PBS. Förvara vid 4 ° C.
- 2x trypsin-EDTA-lösning: Späd 5 ml av 10x trypsin-EDTA-stamlösning (5,0 g trypsin, 2,0 g EDTA per liter) under 20 ml 1 x PBS. Butiks trypsin-EDTA i 2x arbets alikvoter vid 4 ° C. Låt värmas till rumstemperatur före användning.
- Fetalkalvserum: Håll upptinade FCS vid 4 C i upp till två veckor. Placera på is 15 min innan den cytoplasmatiska färgningsproceduren.
- Neutral formalin: Bered en 10% formalinlösning (3,7% paraformaldehyd). Formalin är giftig och därför hantera det under ett laboratorium dragskåp samtidigt bär lämplig skyddsutrustning. Butiks formalin vid rumstemperatur i en kemisk förvaringsskåp.
- Metanol: Store absolut metanol (100%) vid -20 ° C tills cellerna är redo att permeabiliseras. Observera att metanol är brandfarligt och bör förvaras i en lämplig frys.
2.Rening och aktivering av B-celler
- Från en nyligen skördade musmjälte, förbereda en enda cellsuspension genom att försiktigt trycka på orgeln genom ett 70 ìm cell sil med kolven i en 3 ml spruta. I en 15 ml koniskt centrifugrör, samla cellerna i 10 ml 1 x PBS och centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml röda blodkroppar lyseringsbuffert under 5 min. Neutralisera med 13,5 ml 1 x PBS och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter.
- (Valfritt) Magnetiskt separera B-celler med användning av anti-CD45R (B220) -märkta kulorna, efter MACS reningsprotokollet enligt tillverkarens instruktioner.
- Stimulera renade B-celler vid 1,0 x 10 6 celler / ml i värmde B-cellstimulering media innehållande IL-4 (20 ng / ml) och anti-CD40 (1,0 | ig / ml) under 5 dagar vid 37 ° C. Börja med 8 ml odlings uppdelade i två brunnar i en 6-brunnars odlingsplatta (4 ml vardera).
- Kontrollera Culture dagligen för att hålla vid 1,0 x 10 6 celler / ml. Justera koncentrationen genom att dela in i andra brunnar och späda kulturen med B-cellsstimulering medier som innehåller färsk IL-4 och anti-CD40.
3. Trypsinering, Fixering, och Permeabilization
- Trypsinering
- Samla upp till 1,0 x 10 7 av odlade celler i ett 15 ml koniskt rör, centrifugera vid 300 xg under 5 min och dekantera supernatanten.
- Tvätta med 10 ml PBS för att avlägsna kvarvarande proteinet från cellen insamling media. Upprepa centrifugeringssteget och dekantera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i restvolymen efter dekantering (omkring 100 | il).
- Tillsätt försiktigt 800 pl av rumstemperatur 0,1% (2x) trypsin-EDTA till cellerna. Fördela långsamt i 45 ° vinkel längs sidan av den koniska röret.
- Förslut röret och blanda försiktigt genom att luta röret så vätskan löper längs längden av röret 5-6 tids. En trådiga, vit fällning kan bildas i lösningen. Begränsa trypsinization tid att i en min.
- Släck trypsinering reaktionen med 1 ml kall FCS. Späd FCS omedelbart genom tillsats av 10 ml kall PBS.
- Centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C, sedan dekantera supernatanten och åter rören till is.
- Fixering
- Resuspendera cellerna i residualvolymen efter dekantering. Om det behövs, ta volym upp till 100 l med kall PBS.
- I ett dragskåp till 800 pl av 10% neutral buffrad formalinlösning till cellerna och pipettera upp och ned. Röret kommer att värma vid tillsats av formalin. Inkubera vid 37 ° C under 10 min.
- Permeabilisering
- Sätt upp en bänk virvelblandare vid en försiktig skakning hastighet.
- Rita 9 ml kall (-20 ° C) metanol i en 10 ml serologisk pipett.
- Håll röret med cellerna över virvelblandare och försiktigt börja shaking cellerna.
- Lägg kall metanol till röret så att den faller droppvis på cellerna medan röret fortfarande skakar så att metanolen kontinuerlig blandning. Efter de första 2 ml metanol dispenseringshastigheten kan ökas till en långsam ström.
- Låt röret stå på is under 30 min för att slutföra permeabilisering. Alternativt kan cellerna lagras vid -20 ° C i upp till en månad.
4. Fluorescens Färgning för IgG1 och IgE klass-switchning
- Centrifugera provet vid 300 xg under 5 minuter och dekanmetanollösningen. En vit fällning kan pelle med cellerna.
- Lägg 10 ml rumstempererat 1x PBS och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter för att tvätta cellerna. Upprepa en gång. Notera: Att tvätta pelleten med rumstemperatur PBS löser extra fällning som kan bildas efter steg 4.1.
- Utför ytterligare en tvätt med 10 ml 2% FCS-FACS buffert.
- Fördela prov till en 96-brunnars rundbottnad plattaoch centrifugera vid 300 xg under 5 minuter. Dekantera supernatanten och sätta plattan på is.
- Fläck i 60 pl 2% FCS-FACS buffert per brunn med följande spädantikropps: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200
- Efter 5 min av färgning, tvätta plattan med 150 ul av 2% FCS-FACS-buffert och centrifugera under 5 min vid 300 x g.
- Resuspendera i 400 pl 2% FCS-FACS buffert och pipett genom en 40 pm nylon cell sil i en 5 ml FACS rör.
5. Använd följande Gating Strategi:
- Isolera CD45R (B220) positiva celler från sprängning lymfocytpopulationen ligger på FSC / SSC plot (Figur 1).
- Från B220 positiva celler använder IgE och IgG1 komplott för att avslöja de motsvarande populationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta förfarande har genomförts framgångsrikt att studera CSR IgE i mus B-celler. För att demonstrera effektiviteten vid mätning CSR, stimulerade vi mus mjält-B-celler med anti-CD40 och IL-4 som beskrivits tidigare 11. Efter fem dagars stimulering uppsamlades celler och bearbetas med användning av ovan beskrivna protokoll och färgades med fluorescensmärkt IgM, lgG1, IgE och B220 (CD45R) antikroppar. Gated på sprängnings lymfocyter (Figur 1), en tydlig population av IgE + celler kan inte rent diskriminerade utan trypsinbehandling (figur 2a). Emellertid trypsinering av celler före fixering och permeabilisering möjliggör separation av de IgE-producerande celler (figur 2B) på grund av avlägsnandet av yt-bundet IgE.
Figur 1: du Altard vs sidospridning FACS plot av mus mjälten B-celler efter 5 dagars stimulering i kultur med IL-4 och anti-CD40. Blästring lymfocyter utgör 63% av de totala förvärvade händelser.
Figur 2:. Effekt av trypsin på cytoplasmatisk färgning av IgE och IgG 1 i aktiverade B-celler (a, b) FACS tomter (ovan) och histogram (nedan) gated på sprängning mjälten B-celler från 129 / B6 blandade bakgrunds möss efter aktivering i kultur för 5 dagar med anti-CD40 och IL-4. Fixering och metanol permeabilization enbart (a) och med tillsats av trypsin (b) är visade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stimulering av mus mjält-B-celler i odling med anti-CD40 och IL-4 kommer att simulera T-hjälpar typ 2 (T H2) interaktioner, uppmuntrande klass-switchning till IgG1 och IgE 5. B-celler kan aktiveras för CSR i samband med total splenocyter 12 eller så renade mjälte B-celler 11. Som påpekas i protokollet (steg 2.3), är B-cell anrikning tillval, och är efter bedömning av försöksledaren att bestämma om det skulle fördelaktigt. Positiv magnetisk separation av B-celler som använder CD45R (B220) -märkt pärlor utnyttjas här. Efter separation, är det rekommenderat att kontrollera cell renhet genom FACS, så att B-cellkoncentrationen kan justeras till 1,0 x 10 6 celler / ml för korrekt cytokin och antikropp stimulering. Det bör också noteras att IL-4-proteinet som har genomgått frysning / upptiningscykler kan ha minskad aktivitet.
Trypsinisering av celler före fixering och permeabilization möjliggör accuråt mätning av klass omkoppling via flödescytometri (figur 2). Korrekt trypsinisering av cellerna är avgörande för en framgångsrik tillämpning av detta förfarande. Som FCS kan inhibera trypsin, är en 1 x PBS tvätt utförs före trypsinering steget. Vi fann en 30 sek inkubation vid rumstemperatur är tillräckligt för fullständig digerering. Längre löptider kan märk påverka cellernas livskraft.
Före analys, är det viktigt att tvätta cellerna flera gånger med PBS för att avlägsna spår av metanol. Metanol överföring kan förändra antikroppsbindning 13 och kan fälla proteiner från FCS används i nedströms flödescytometrianalyser 14. I detta avseende kan andra permeabilization metoder (dvs saponin) vara ett alternativ till att använda metanol. Metanol är ett organiskt lösningsmedel som löser upp membranlipider, medan detergenter stör membranintegritet 15. En fördel till metanol permeabilization är förmågan hos långtidsförvaringav fasta celler vid -20 ° C 14.
Det finns vissa begränsningar för att tänka på när du använder den här proceduren. Eftersom trypsin klyver proteinrester kan vissa FACS fläckar se annorlunda efter behandling, eller kan förlora förmågan att binda till målet epitoper helt och hållet. Dessutom kan en förlust av cellantalet efter trypsin behandling uppstår. Men detta verkar inte påverka mätnoggrannheten IgE CSR som vi har funnit denna metod för att vara klart jämförbar med klassomkopplings data insamlade från att mäta antikropps sekret av individuella hybridomkloner 11.
Andra metoder har rapporterats för att detektera IgE-producerande mus B-celler. En metod använder en syratvätt förfarande för att avlägsna receptorbundet IgE före färgning för membranbundet IgE på IgE-uttryckande celler 16-18. En annan metod använder en monoklonal anti-IgE-antikropp att blockera all yta IgE före cell permeabilization och färgning för intracellulär IgE av IgE-uttryckande celler 19. Vidare profilerade en färsk studie en åtta-färg FACS panelen att identifiera IgE-switchade B cellpopulationer hos människor genom att utesluta IgM +, IgD +, IgG + och IgA + B-cellsundergrupper 20. Jämfört med dessa andra metoder, den här beskrivna metoden undviker användning av denaturerande syratvättar, och överskott antikroppar är inte nödvändiga.
En fördel med detta förfarande är att den inte föreskriver specifika monoklonala antikroppar för mätning av företagens sociala ansvar till IgE. Alternativa anti-IgE monoklonala antikroppar har visat att upptäcka bara endogena IgE-molekyler. Den hybridomklon R1E4 producerar en råtta-anti-mus monoklonal IgE antikropp specifik endast för endogena ytmolekyler, inte cytophilic IgE bundet till CD23 21,22, men inte är kommersiellt tillgänglig. Protokollet som beskrivs ovan är bekvämt och ekonomiskt, eftersom den använder vanliga lab reageNTS. Den anti-IgE-antikropp som används här sannolikt binder till receptorbundet IgE vid ett säte känslig för trypsin-medierad klyvning, eftersom IgE signal på grund cytophilic IgE reduceras efter behandling (Figur 2). Men forskare utför detta protokoll har friheten att välja från ett utbud av kommersiellt tillgängliga kloner för experiment. Dessutom kan begreppet användning av trypsin för att avlägsna cellyteproteiner utvidgas till detektion av andra cellmarkörer genom FACS-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DRW stöds av NIH bidrag AI089972 och AI113217, och av Mucosal Immunologi Studies Team, och har en karriär Award för Medicinska Forskare från Burroughs Wellcome fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S. Molecular mechanisms of IgE regulation. The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
