Abstract
B lenfosit immünoglobulin ağır zinciri (IgH) sınıf anahtarı rekombinasyon (CSR) ilk olarak, IgM IgA, IgE ve IgG olarak diğer IgH izotiplerinden geçer ifade edildiği bir süreçtir. In vitro IgH CSR ölçümü, moleküler ve hücresel immünoloji yönlerine DNA yeniden birleştirmesinden ve onarım kadar biyolojik süreçlerin bir dizi çalışma için bir temel yöntem. In vitro CSR deney aktive B hücreleri üzerindeki akış sitometrik ölçüm yüzey Ig ifade içerir. IgA ve IgG alt sınıflarının ölçümü kolay olmakla birlikte, bu yöntemle IgE ölçümü, çözünür IgE FcεRII bağlanma nedeniyle sorunludur / CD23 aktive B hücrelerinin yüzeyi üzerinde ifade edilmiştir. Burada kültür CSR geçirmiş fare B hücreleri, IgE üreten doğru bir şekilde ölçülmesi için benzersiz bir işlem tarif eder. yöntem cy ile sağlanan B tipi hücrelerin IgE üreten tespiti için izin hücre yüzeyleri üzerindeki IgE-CD23 komplekslerinin tripsin-sebepli bölünme dayanırtoplasmic lekelenmesi. Bu prosedür IgE KSS akış sitometri analizi için uygun bir çözüm sunuyor.
Introduction
Fare ve insan immünoglobulin ağır zinciri (IgH) sınıf anahtarı rekombinasyon (CSR) sırasında, IgH, sabit bölge ekzon (Cμ) silindi ve aşağı doğru sabit bölge eksonların çeşitli kümelerinin bir (Cı lH ler) (örneğin, Cγ değiştirilir μ Ig sınıflarına (örneğin, IgG, IgE ya da IgA) üretimine IgM üretimi ile ilgili bir anahtar elde Cε ve Ca'sına). CSR CH s, 1 her bir grubu için 5 'bölgesinde yer 1-10 kb sekansları anahtarı (s) bölgeleri içinde gerçekleşir. Aktivasyon Bağlı Sıtıdın Deaminaz (AID) enzim sitidinin deaminasyon etkinliği yoluyla CSR başlatır.
IgE allerjik hastalık 2 anahtar arabulucu ve IgE üretilen ve atopik hastalığı için yeni tedavi yaklaşımları kapılarını açabilir düzenlenir nasıl büyük bir anlayıştır. Farelerde ve insanlarda olarak IgE, en sıkı bir şekilde düzenlenmiş Ig izotiptir. IgE normal tim düzeyleri binlerce tespit edilires diğer IgH daha az 3 isotypes, ama çok hastalık durumlarında 4 yükselmiş olabilir. Bununla birlikte, IgE CSR tam olarak anlaşılamamıştır. B hücrelerinin in vitro aktivasyonu, IL-4, anti-CD40 veya LPS ile kombinasyon halinde her iki IgG1 ve IgE 5 CSR indükler kullanılmıştır. Aktive B hücreleri çözünebilir IgE CSR sonra kültür salgılanan bağlayan düşük afiniteli IgE reseptörü FcεRII / CD23 2,6, ifade eder. Akış sitometrisi ile analiz, bu nedenle, reseptör bağlı IgE lekesi ile B hücreleri benzer endojen IgE 7 sentezleyen B hücreleri için. O fare B biliniyor olsa da hücreler IgG1 sınıf anahtarlama ölçümü ile müdahale görünmüyor deneyimlerimiz düşük afinite IgG reseptörü FcγRIIB1 (CD32) 8, ifade eder. Kültür içinde, B hücresi aktivasyonu sonrası IgE geçiş ölçüm Ancak, spesifik olmayan yüzeyine bağlı IgE analizi gizleyebilir. Yaygın boyama yöntemleriyle olmayan IgE ifade eden hücreler IgE için pozitif leke.
Burada özetlenen fareler 9 arası gerçek IgE ifade B hücreleri KSS tahlilleri yapmak ve tespit etmek için kullanılmıştır bir stratejidir - 11. Tripsin ile aktive B hücrelerinin tedavisi, ortak bir laboratuar reaktif protein sindirimi, cytophylic ve membran hem de bağlı yüzey Ig kaldırır. Sitoplazmik IgE için sonraki permeabilization ve boyama, böylece gerçek IgE üreten hücreleri ortaya koymaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Burada açıklanan tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) kurallarına uygun olarak ve Hayvancılık Araştırma Hastanesi Çocuk (ARCH), Boston, Mass tarafından onayladı.
Reaktifler 1. Hazırlık
- 1,000x, IL-4 Stok: H 2, O ya da% 0.1 bovin serum albümini (BSA) içinde 20 ug / ml olacak şekilde seyreltin, IL-4, sitokin. -20 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine ve saklamak için 200 ul alikolar içinde dağıtın.
- 1,000x anti-CD40: 4 ° C 'de, 1.0 mg / ml arasında, mağazada üreticisinden elde edilir.
- B hücre uyarılmasını ortamı: RPMI-1640 ortamı içinde 425 ml'lik, ekleme 75 taze çözülmüş fetal buzağı serumu mi (FCS), 1.0 M HEPES tamponunda, 5 ml L-glutamin stokunun 10 mi, 5 ml Penisilin: Streptomisin stoku, 5 2-merkaptoetanol mi Asgari Temel Ortam Aslî Olmayan Amino Asitler (MEM-NEAA) ve 3.5 ul. Bir haftaya kadar 4 ˚C Ortamı tutun. IL-4 (20 ng / ml) ve anti-CD40 (1.0 ug / ml), kullanılmadan hemen önce eklemesadece gerekli ortamın hacmi.
- % 2 FCS-FACS Tampon: 1x PBS 490 ml FCS, 10 ml ilave edilir. 4 ° C'de tutun.
- 2x tripsin-EDTA çözeltisi: 1x PBS, 20 ml 10 x tripsin-EDTA stok çözeltisi (5.0 gr, tripsin, litre başına 2.0 g EDTA) 5 ml seyreltin. Mağaza tripsin-EDTA 2x 4 ° C'de alikotları çalışma. Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
- Cenin buzağı serumu: en fazla iki hafta boyunca 4 ° C'de eritilmiş FCS tutun. Sitoplazmik boyama prosedürü önce buz 15 dk yerleştirin.
- Nötr-tamponlu formalin:% 10 formalin solüsyonu (% 3.7 paraformaldehid) hazırlayın. Formalin toksik ve uygun KKD giyerek bu nedenle laboratuar davlumbaz altında tutun. Bir kimyasal depolama kabini oda sıcaklığında saklayın formalin.
- Metanol: -20 ° C'de saklayın mutlak metanol (% 100) hücreleri geçirgenleştirildi hazır olana kadar. Bu, metanol yanıcı ve uygun bir dondurucuda saklanabilir gerektiğine dikkat ediniz.
2.Saflaştırılması ve B hücrelerinin aktivasyonu
- Taze hasat fare dalak kaynaktan, dikkatli bir şekilde 3 ml lik bir enjektör pistonuna sahip 70 mikron hücre süzgecinden organı basarak tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. 15 ml konik santrifüj tüpü içinde, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de 1x 10 ml PBS hücrelerin ve santrifüj toplar.
- 5 dakika boyunca alyuvar parçalanması Tamponu, 1 ml yüzer madde ve tekrar süspansiyon pelet süzün. 5 dakika boyunca 300 xg'de 13.5 1x PBS ml ve santrifüj ile nötralize edin.
- (İsteğe bağlı) Manyetik üreticinin talimatlarına göre MACS arıtma protokolü takip edilerek, boncuklar, anti-CD45R (B220) ile B hücreleri -etiketli ayırın.
- 37 ° C 'de, IL-4 (20 ng / ml) ve 5 gün boyunca bir anti-CD40 (1.0 ug / ml) ihtiva eden ısıtılmış B hücre uyarılmasını ortam içinde 1.0 x 10 6 hücre / ml'de, saflaştırılmış B hücrelerini stimüle eder. 6 oyuklu bir kültür plakasına (4 mL) içinde 2 kuyu ayrılmıştır kültür 8 ml ile başlar.
- Cultu edin1.0 x 10 6 hücre / ml'de korumak için günlük olarak tekrar. Diğer kuyulara bölme ve taze IL-4 ve anti-CD40 ihtiva eden B hücre uyarılmasını ortamı ile kültür seyreltilerek konsantrasyonu ayarlayın.
3. tripsinizasyonu, Fiksasyon ve Permeabilization
- Trypsinization
- 5 dakika boyunca 300 xg'de, 15 ml konik tüp içinde santrifüj kültür hücrelerinin kadar 1.0 x 10 7 toplayın, ve süpernatant süzün.
- Hücre toplama ortamından artık proteinin ayrılması için 10 ml PBS ile yıkayın. Santrifüj adımı tekrarlayın ve süpernatant süzün.
- (Yaklaşık 100 ul) boşaltılarak sonra rezidüel hacim hücre pelletini.
- Dikkatlice hücreler, oda sıcaklığında,% 0.1 (2x) tripsin-EDTA, 800 ul ilave edin. Konik tüp tarafında aşağı 45 ° açıyla yavaşça koyun.
- Tüp kapatın ve sıvı tüp 5-6 kez uzunluğu boyunca uzanan bu yüzden tüp eğerek hafifçe karıştırıns. Bir tel, beyaz bir çökelti çözeltisi içinde meydana gelebilir. Bir dakika altındaki trypsinization zamanı sınırlayın.
- Soğuk FCS, 1 ml tripsinizasyon reaksiyonu söndürün. Hemen soğuk PBS 10 ml ilave etmek suretiyle FCS ile seyreltilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj, ardından süpernatan süzün ve buz tüpleri döndürür.
- Tespit
- Boşaltılarak sonra rezidüel hacim hücrelerin tekrar. Gerekirse, soğuk PBS ile 100 ul hacmi getirmek.
- Bir çeker ocak içinde, hücrelere% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi 800 ul ve yukarı ve aşağı pipetleme ve. Tüp formalin ilavesi üzerine sıcak olacak. 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
- Permeabilizasyon
- Hafif sallayarak hızında bir tezgah üstü vorteks karıştırıcı ayarlayın.
- 10 ml'lik bir serolojik pipet içine soğuk (-20 ° C) metanol içinde 9 ml çizin.
- Vorteks mikser üzerinde hücreleri içeren tüp tutun ve yavaşça sallıyor başlangıçg kadar hücre.
- Tüp hala çok titriyor metanol sürekli karıştırma olduğunu iken hücreleri üzerine damla damla düşer, böylece tüp soğuk metanol ekleyin. Metanol ilk 2 ml sonra dağıtma hızı yavaş bir akışla kadar arttırılabilir.
- 30 dk permeabilization tamamlamak için tüp buz üzerinde bekletin. Seçenek olarak ise, hücreler, bir aya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
IgG1 ve IgE sınıf değiştirme 4. Floresan Boyama
- Santrifüj 5 dakika boyunca 300 xg'de örnek ve metanol çözüm süzün. Beyaz bir çökelti hücreleri ile pelet olabilir.
- 5 dakika Hücreleri yıkamak için 300 x g'de oda sıcaklığında PBS 1x ve santrifüj 10 ml ilave edilir. Kez tekrarlayın. Not: oda sıcaklığı PBS ile pelet yıkanması adım 4.1 sonra oluşabilecek ekstra çökelti çözer.
- % 2 FCS-FACS tamponu 10 ml ek yıkama yapın.
- Yuvarlak tabanlı plaka 96 çukurlu numuneleri dağıtmave 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatant süzün ve buz üzerinde tabak koydu.
- Aşağıdaki antikor seyreltmeleri ile oyuk başına% 2 FCS-FACS tamponu 60 ul Leke: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-lgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP Cy5.5 @, 1: 200
- Boyama 5 dakika sonra, 300 x g, 5 dakika boyunca% 2 FCS-FACS tamponu ve santrifüj 150 ul plakayı yıkayın.
- 5 ml'lik bir FACS tüpü içine, bir 40 um naylon hücre süzgecinden% 2 FCS-FACS tamponu ve pipet 400 ul içinde süspanse.
5. Aşağıdaki Yolluk Strateji kullanın:
- FSC / SSC arsa (Şekil 1) bulunan patlatma lenfosit nüfus CD45R (B220) pozitif hücreleri izole.
- B220 pozitif hücrelerden, ilgili popülasyonları ortaya IgE ve IgG1 arsa kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu prosedür başarıyla fare B hücrelerinde IgE CSR çalışma uygulamaya konmuştur. Daha önce tarif edildiği gibi 11 CSR ölçüm etkinliği tespit etmek için, anti-CD40 ve IL-4 ile birlikte fare dalak B hücreleri stimüle. Stimülasyon beş gün sonra, hücreler toplandı ve protokol floresan-etiketli IgM, IgG1, IgE ve B220 (CD45R) antikorlar ile, yukarıda tarif edilen ve lekeli kullanılarak işlenmiştir. (Şekil 1), IgE + hücrelerin net bir nüfusu temiz tripsin tedavi (Şekil 2a) olmadan ayrımcılık olamaz patlatma lenfositler üzerinde kapı. Bununla birlikte, tespit ve geçirgenliği öncesinde hücrelerin tripsinizasyon, yüzey bağlanan IgE çıkarılması IgE üreten hücreler (Şekil 2b) ayrılmasını sağlar.
Şekil 1: forwIL-4 ve anti-CD40 ile kültür içinde uyarma 5 gün sonra, fare dalak B hücrelerinin yana saçılım FACS karşılaştırılmaktadır ard. Püskürtme lenfositler, elde edilen toplam olayların% 63 oluşturur.
Şekil 2:. Aktive edilmiş B hücrelerinde IgE ve IgG1 sitoplazmik leke üzerinde tripsin etkisi (a, b) kültürde aktivasyondan sonra 129 / B6 karışık arka farelerinden gelen dalak B hücreleri patlatma kapılanmış FACS (yukarıda) grafikleri ve histogram (aşağıda) Anti-CD40 ve IL-4 ile 5 gün karıştırılmıştır. Tek başına Sabitleme ve metanol permeabilizasyon (a) ve tripsin (b) 'nin eklenmesi ile gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anti-CD40 ve IL-4 ile kültürde fare dalak B hücreleri uyarımı IgG1 ve IgE 5, T yardımcı tip 2 (Th2) etkileşimi teşvik edici sınıf değiştirme simule eder. B hücreleri, toplam splenositler 12 ya da saflaştırılmış ve splenik B hücrelerinin 11 bağlamında CSR etkinleştirilebilir. Protokol (adım 2.3) de belirtildiği gibi, B hücresi zenginleştirme isteğe bağlıdır, ve yararlı olurdu olmadığını belirlemek için deneyci takdirine bağlıdır. CD45R (B220) kullanılarak B hücrelerinin pozitif manyetik ayırma boncuk burada kullanılır -etiketli. Ayrıldıktan sonra, bu, B hücresi konsantrasyonu uygun şekilde sitokin ve antikor stimülasyonu için 1.0 x 10 6 hücre / ml olacak şekilde ayarlanabilir, böylece FACS hücre saflığını kontrol etmek için önerilmektedir. Ayrıca donma / çözülme devrelerine tabi tutulmuştur, IL-4, protein aktivitesi azalmış olabilir unutulmamalıdır.
Önce tespit ve permeabilization hücrelerin trypsinization Accur sağlar(Şekil 2) akış sitometri yoluyla sınıf değişimi ölçümü yedik. Hücrelerin düzgün trypsinization bu prosedürün başarılı bir uygulama için hayati önem taşımaktadır. FCS tripsin önleme gibi, 1x PBS yıkama öncesi tripsinizasyon aşamasından gerçekleştirilir. Bu, oda sıcaklığında, 30 saniyelik bir kuluçka tamamlandıktan sindirim için yeterli bulundu. Uzun süreler belirgin hücre canlılığını etkileyebilir.
Analizinden önce, bu iz, metanolün çıkması için PBS ile hücreleri birkaç kez yıkanması gereklidir. Metanol devir 13 bağlayıcı antikor değiştirebilir ve aşağı akım sitometri analizi 14 kullanılan FCS gelen proteinleri hızlandırabilir. Bu bağlamda, diğer permeabilizasyon yöntemleri (örneğin saponin) metanol kullanılarak bir alternatif olabilir. Metanol deterjanlar membran bütünlüğünü bozabilir 15 ise, membran lipitleri çözünür bir organik çözücüdür. Metanol permeabilization bir yararı genişletilmiş depolama yeteneği-20 ° 14 ° sabit hücre.
Bu yordamı kullanırken akılda tutulması gereken bazı sınırlamalar vardır. Böler, protein artıkları tripsin Çünkü, bazı FACS lekeleri tedavi sonrası farklı görünebilir, ya da tamamen epitopları hedef bağlanma yeteneğini kaybedebilir. Buna ek olarak, tripsin muameleden sonra hücre sayısında bir kayıp meydana gelebilir. Bireysel hibridoma klonlarının 11 antikor salgılar ölçme toplanan sınıf anahtarlama verilerine açıkça karşılaştırılabilir olması için bu yöntemi bulduk Ancak, bu IgE KSS ölçümlerin doğruluğunu etkiler görünmüyor.
Diğer yöntemler, IgE üretiminde fare B hücreleri tespit etmek için rapor edilmiştir. 18 - bir yöntem hücreleri 16 IgE ifade ile zara bağlı IgE'ye lekeleme reseptör bağlı IgE önce uzaklaştırmak için bir asit, yıkama işlemini kullanır. Başka bir yöntem, hücre permeabiliz önce tüm yüzey IgE engellemek için bir monoklonal anti-IgE antikoru kullananIgE ifade eden hücrelerin 19, hücre içi IgE için tirme ve boyama. Ayrıca, yeni bir çalışma IgM +, IgD +, IgG ve IgA + + B hücre alt kümelerini 20 hariç insanlarda IgE anahtarlamalı B hücre popülasyonlarının tanımlamak için sekiz renkli FACS panelini profilli. Bu yöntemlere göre, burada tarif edilen yöntem, asit yıkama denatüre kullanılmasını önler ve fazla antikorlar gerekli değildir.
Bu prosedür için bir yararı, IgE'ye CSR ölçümü için spesifik monoklonal antikorlar öngörmez olmasıdır. Alternatif bir anti-IgE monoklonal antikorlar, sadece, endojen, IgE molekülleri tespit etmek için gösterilmiştir. Hibridom klon R1E4 değil cytophilic IgE CD23 21,22 bağlı sadece endojen yüzey molekülleri özgü bir sıçan-anti-fare monoklonal IgE antikoru üreten, ama ticari olarak mevcut değildir. ortak laboratuar reage kullandığı için, yukarıda tarif edilen protokol uygun ve ekonomiktirNTS. muhtemelen Burada kullanılan bir anti-IgE antikoru reseptöre bağlı nedeniyle cytophilic IgE, IgE sinyali işlemden sonra azalır çünkü, tripsin aracılı bölünmeye karşı duyarlı olan bir yerinde IgE (Şekil 2) bağlanır. Bu protokol yürütülmesi araştırmacılar deneyler için piyasada mevcut klonların bir dizi seçim özgürlüğüne sahip Ancak. Bundan başka, hücre yüzeyi proteinleri uzaklaştırmak için tripsin kullanılarak kavramı, FACS analizi ile başka hücre işaretlerinin tespiti için uzatılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
DRW NIH hibe AI089972 ve AI113217 tarafından ve Mukozal İmmünoloji Çalışmaları Ekibi tarafından desteklenen ve Burroughs Wellcome Fonu Tıbbi Bilimciler için Kariyer Ödülü tutar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Mouse IgE FITC | BD Pharmingen | 553415 | clone R35-72 |
| Rat Anti-Mouse IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | clone A85-1 |
| Methanol | BDH | BDH1135-4LP | Keep at -20 °C |
| Falcon Cell Strainer 40 µm Nylon | Corning | 352340 | |
| Falcon Cell Strainer 70 µm Nylon | Corning | 352350 | |
| Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | clone RA3-6B2 |
| anti-Mouse/Rat CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | clone HM40-3 |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| MACS purification column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | Reconstitute in water or 0.1% BSA |
| Formalin Solution, Neutral Buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 ml | 5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA•4 Na per Liter of 0.9% NaCl |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100 ml | 10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x) |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| 2-mercaptoethanol (99%) | Sigma Aldrich | M6250-100 ml | |
| Red cell lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | clone 1B4B1 |
| HyClone Fetal Calf Serum | Thermo | SH30910.03 | |
| B cell Stimulation media | B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine, 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 µg/ml), Beta-mercaptoethanol (7 µL/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 µg/ml) |
References
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).
- Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. Immunoglobulin E. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).
- Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. Primary immune deficiencies with aberrant IgE production. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).
- Bacharier, L. B., Geha, R. S.
- Yokota, A., et al. Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression. Cell. 55 (4), 611-618 (1988).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).
- Callen, E., et al. 53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions. Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).
- Wesemann, D. R., et al. Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).
- Wesemann, D., et al. Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct Sµ to Sε recombination. The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).
- Zarrin, A. A., et al. An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination. Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).
- Fan, G., et al. Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk. Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).
- Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, Clifton, NJ. 67-94 (2004).
- Jamur, M., Oliver, C.
- Ishizaka, T., Ishizaka, K. Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH. Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).
- Erazo, A., et al. Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo. Immunity. 26, 191-203 (2007).
- Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies. Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).
- Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition. Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).
- Berkowska, M. A., et al. Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways. The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).
- He, J. -S., et al. The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response. The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).
- Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI. Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).
