A Mouse Fetal Skin Modell av scarless Wound Repair

Introduction

Foster huden sår leges raskt og scarlessly før sent i svangerskapet ^1. Føtalt scarless reparasjon sår er kjennetegnet ved regenerering av normalt vev arkitektur og funksjon. Overgangen fra en scarless til arrdannelse fenotype oppstår i tredje trimester av svangerskapet hos mennesker og rundt embryonale dag 18 (E18) i mus ^2,3. I forhold til voksen, er føtal reparasjon såret karakterisert ved hurtig epithelialization, bindevev avsetning, og fibroblast migrasjon.

Mange studier har tilbudt mulige forklaringer på fenomenet scarless sårtilheling under tidlig fosterutvikling. Betennelse er en fundamental del av voksen reparasjon såret; imidlertid føtale sår kjennetegnet ved en mangel på akutt inflammasjon ^4. Hvorvidt dette er et resultat av den funksjonelle umodenhet av immunsystemet i løpet av foster faser forblir uklar. En fersk studie antydet at forskjeller i overflod, matteile sikkerhetssitu, og funksjon av mastceller i E15 vs. E18 fosterets hud kan være ansvarlig for overgangen fra en scarless fenotype, i hvert fall i musen ^tre. Andre studier posit at forskjeller i egenskaper og overflod av føtale og voksne makrofager sår er ansvarlig for reformasjon av normal ekstracellulære matrise (ECM) under foster såret reparasjon ^fem.

Forskjeller i miljøfaktorer under utvikling foster og voksne kan også påvirke sår reparasjon. Longaker og medarbeidere viste at såret fluid fra fosteret besitter høye nivåer av hyaluronsyre-stimulerende aktivitet, sammenlignet med ingen i voksen sårvæske ^6. Følgelig kan høyere nivåer av hyaluronsyre, et glykosaminoglykan som fremmer en mikromiljøet bidrar til cellemotilitet og spredning, i foster sårmiljø være ansvarlig for scarless fenotype sett under tidlig fosterutvikling. Andre linjer av bevis peker på det faktum at fetal såret miljø er relativt hypoxemic og nedsenket i sterile fostervann rik på vekstfaktorer ^7. Imidlertid har ingen fasitsvar blitt gitt for en kritisk hendelse eller faktor under embryogenese som utløser overgangen fra scarless regenerering til fibrotisk reparasjon.

Forstå mekanismene ansvarlig for scarless healing hos fosteret nødvendiggjør en presis og reproduserbar modell. Her vi detalj en reproduserbar modell av foster scarless sårtilheling i ryggen E16.5 (scarless) og E18.5 (arrdannelse) museembryoer. I tillegg kan små variasjoner av denne modellen benyttes til å utføre en rekke videre studier, for eksempel analyse av genuttrykk av føtale sår og hud ^8,9. Gitt at nettopp tidsbestemte svangerskap er avgjørende for vellykket gjentagelse av denne foster scarless sårtilheling modell, vi også detalj vår protokoll for superovulering timet svangerskap.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer som er beskrevet i denne artikkelen er utført i henhold til retningslinjer fastsatt av Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC).

1. Tidsbestemt svangerskap - superovulation Teknikk (figur 1)

MERK: Nøyaktig timing gestasjonsalder museembryoer for fosterkirurgi ved E16.5 og E18.5 er av avgjørende betydning. I denne delen vi detalj vår protokoll for timing muse svangerskap hjelp gravid hopper serum (PMS) og humant choriongonadotropin (HCG) injeksjoner for å indusere superovulering.

1. Injisere hunnmus (<5 per bur) intraperitonealt (IP) med 3,0 til 5,0 internasjonale enheter (IE) PMS i et volum på 100 ul PBS 01:00 til 15:00 for dag 1.
2. Mellom 12:00 og 14:00 på dag 3 (førtifem til 47 timer etter PMS injeksjon), injiserer hunnmus IP med 3,0 til 5,0 IE HCG i et volum på 100 ul PBS.
   MERK: HCG injeksjon induserer eggløsning ca 12 timer etter injeksjon.
3. Umiddelbart etter HCG injeksjoner, kompis kvinner med menn i alderen 8-16 uker.
   MERK: Vi vanligvis plassere to kvinner i et bur av individuelle menn.
4. Separate kvinner fra menn på morgenen dag 4 (06:00 til 10:00) og posten som fosterets alder E0.5.
   MERK: Vaginal plugger kan sjekkes på denne tiden; imidlertid ikke observasjon av en vaginal plug ikke garantere graviditet og hunnene kan bli gravid når ingen pluggen er observert. Gitt at graviditet er vanligvis observerbar ved visuell inspeksjon og / eller palpasjon ved svangerskaps aldre E16.5 og E18.5, sjekker for vaginal plugger på morgenen dag 4 er strengt tatt ikke nødvendig. I vår erfaring, og avhengig av belastning, ca 30-50% av super-eggløsning kvinner blir gravide ved hjelp av teknikken beskrevet her.

pg "/>
Figur 1. Skjematisk for superovulation Technique. Skjematisk viser prosedyren for superovulering timet svangerskap hos mus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. Muse Fetal Surgery (Dorsal såret) på E16.5 og E18.5 embryo (figur 2)

1. Før prosedyren, rengjøre alle overflater av operasjonsstuen og utstyr med 70% isopropylalkohol. I tillegg, sterilisere alle kirurgiske instrumenter og utstyr som skal brukes i fremgangsmåten ved autoklavering av dem. Noen institusjoner kan tillate at påfølgende bruk av varmt vulst sterilisering. Per bruk, bruk sterile pakker som inkluderer gasbind og kirurgiske instrumenter.
2. Indusere anestesi hos gravide mødre (fetal alder E16.5 eller E18.5) under 2,5% isofluran / oksygen blanding på 2 liter per min etterfulgt av vedlikeholdsanestesi ved 1 l pr min.
3. Å lurefast riktig anesthetization, sikre de dype pedal reflekser av musen er undertrykt og plasserer musen i liggende stilling.
4. Påfør en veterinær oftalmisk salve som Puralube å hindre irritasjon eller tørrhet under prosedyren.
5. Forberede magen ved å administrere en lett påføring av Hårfjerningskrem for ikke lenger enn 30 sek (Figur 2A).
6. Forberede magen for aseptisk kirurgi med povidon-jod og alkohol (figur 2B og 2C).
7. Utfør midtlinjen laparotomi henhold mikroskop bruker mikro saks (Figur 2D og 2E).
8. Forsiktig utsette livmor og foster valgt for kirurgi (figur 2F).
9. Skyll kirurgiske felt med varm (38 ° C) fosfatbufret saltvann (PBS) ved anvendelse av en butt-spiss nål
   MERK: Man kan fremstilles ved omhyggelig å bøye spissen av en grov nål. (Figur 2G og 2H).
10. Plasser fosteret på en måte som gjør ats full tilgang til ryggen.
11. Passere en veske streng sting ved hjelp av 7-0 nylon sutur gjennom livmoren liggende området for tiltenkt rygg såret (figur 2I). Posisjon vesken strengen over et område av fotens rygg til venstre eller høyre av ryggmargen, og i et område av livmorveggen blottet for store blodkar.
12. Gjøre en 3 mm snitt gjennom livmorveggen og fostervann sac i sentrum av vesken streng (Figur 2J).
13. Vanne innsnitt området med varmt (38 ° C) PBS.
14. Ved hjelp av mikro saks, skjære et enkelt full-tykkelse excisional sår, ca. 1 mm i lengde, i dorsum av fosteret.
15. Forsiktig blot innsnitt området tørke med bomull-tip applikator.
16. Injisere tre fil volum tusj subkutant i sårstedet å markere plassering av såret (Figur 2K).
17. Skyll med varmt (38 ° C) PBS for å sikre blekket er beholdt innenfor sårstedet.
18. Har kirurgisk assistent inject varm (38 ° C) PBS gjennom butte tuppen 10 G sprøyten inn i amnion som vesken strengen er stengt (figur 2L). Trekke sprøyten som vesken streng nedleggelse nærmer seg ferdigstillelse (figur 2M).
19. Forsiktig tilbake livmor inn i bukhulen (figur 2 N).
20. Evert hud og bukhinne.
21. Har kirurgisk assistent vanne bukhulen med varm (38 ° C) PBS.
22. Lukk magen raskt ved å stifte hud og bukhinne lukket (Figur 2o). Standarden lukningen er utført i to lag; peritoneum og magemusklene i ett lag, subkutant vev og hud i det andre laget. For umiddelbar offer og høsting av fosteret, viser vår demonstrasjons nedleggelse i ett lag.
23. Plasser dyret under observasjon i en varm inkubator innstilt ved 37 ° C i 30 minutter eller inntil dyret gjenvinner bevisstheten tilstrekkelig til å opprettholde sternum recumbency.
24. Ikke returne dyret til selskap med andre dyr før det er fullstendig restituert fra prosedyren.
25. Når man våkner fra anestesi og under den etterfølgende 48 timer, administreres subkutant injeksjon av buprenorfin (0,05 mg / kg) hver 12. time for analgesi etter behov, basert på smerte vurdering. Administrere carprofen (5 mg / kg) via subkutan injeksjon for ekstra postoperativ smertelindring etter behov.
26. Retur dyr til buret og gi dem med mat og vann ad libitum.
27. Følge nøye med for manifestasjoner av smerte.
28. 48 timer etter operasjonen, ofre gravid mor med en overdose av isofluran og høste såret fosteret. For å gjøre dette, justere isofluran konsentrasjon til 5% eller høyere og opprettholde eksponering for 1 min etter pustestans. Bekreft eutanasi med halshugging. Høste en unwounded embryo for alders matchet kontrollgruppe. Sene embryo bør ha en egen metode for aktiv dødshjelp i samsvar med IACUC anbefalinger som for eksempel decapitation, cervical forvridning, eller kjemisk injeksjon.

Figur 2. Skjematisk for murine Fetal Surgery. Generelle trinn for rygg såret i E16.5 og E18.5 mus embryoer. (A) Hårfjerning av mus magen. (B og C) Fremstilling av mus magen. (D) mikroskop brukes for kirurgisk prosedyre. (E) Midline laparotomi. (F) Eksponering av livmor. (G) Opprettelse av sløv-spiss nål. (H) Vanning av livmor med varmt saltvann. (I) Opprettelse av vesken streng sutur. (J) Snitt gjennom livmor vegg og en mm full tykkelse excisional generasjon såret. (K) Subkutan injeksjon av India blekk. (L og M) Lukking av vesken streng sutur. (N og O)Nedleggelse av magen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representative Results

For histologisk analyse, bør kutane sår i rygghuden av E16.5 og E18.5 mus embryoer høstes 48 timer etter såret, fiksert i 4% PFA, og parafininnleiret. I fluorescerende transgene modeller, kan nedfrysing med oktober være hensiktsmessig. Det er flere flekker som kan anvendes til å visualisere cellulære og bindevev arkitektur. Hematoxylin og eosin er en to-farge flekken som flekker atomkjerner blå og eosinofile strukturer (ie., Cytoplasma og ekstracellulært kollagen) ulike nyanser av rødt, rosa og oransje. Mallory s Trichrome er en tre-farge-flekk bestående av anilin blå, syre fuschin og orange G, best egnet for å skille cellene fra omgivende bindevev.

Figur 3. Histologi av scarless E16.5 Foster Wounds. (A) hematoksylin og eosin flekken reveals komplett reepithelialization og en mild økning i antall betennelsesceller til stede (piler). (100x, bar = 100 mikrometer) (B) eosin flekken viser India blekk (pilspisser) rundt regenererende hårsekkene (pil) (400x, bar = 25 . um) (C) Mallory s Trichrome flekken avslører en fin retikulære dermalt collagen mønster med tilstedeværelse av en hårsekken (400x; bar = 25 um). Gjengitt med tillatelse fra Colwell et al. ¹⁰ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Hvis rygg Excisional sår er av passende størrelse (1 mm) og dybde (full-tykkelse), vil hematoxylin og eosin-farging viser at E16.5 huden leges med minimal arrdannelse, komplett reepithelialization, og kun en liten økning i antallet inflammatoriske celler (figur 3A). Dessuten, disse wounds skal leges med tilnærmet normal hud arkitektur og inneholder regenererende hårsekkene innen skadestedet (piler, figur 3B). Riktig bruk av india blekk til nyopprettet såret bør resultere i blekk deponering på stedet av skade (pilspisser, figur 3B). Til slutt bør Trichrome flekker avslører en fin retikulære dermal kollagen mønster karakteristisk for unscarred dermis (Figur 3C).

Figur 4. Histologi av arrdannelse E18.5 Foster Wounds. (A) Hematoxylin og eosin flekken avslører en økning i eosin flekker i dermis på stedet av skader (piler). (200x, bar = 50 mikrometer) (B) Mallory sin Trichrome flekken viser tett dermal kollagen (piler) (400x; bar = 25 um). Gjengitt med tillatelse fra Colwell et al.¹⁰

I forhold til sår gjort på E16.5, hematoxylin og eosin farging av rygg sår gjort på E18.5 og høstet 48 timer etter såret bør avsløre en tett arr med tap av normal hud arkitektur på stedet av skade (Figur 4A). Tilsvarende, avslører Trichrome flekker et tett mønster av uorganisert kollagen deponering (piler, figur 4B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den kirurgiske protokollen presenteres her beskriver en excisional modell av foster murine scarless healing først publisert i 2006 av vårt laboratorium ^10. I tillegg til andre etablerte modeller av excisional såret ^11, operasjonssåret modeller av foster murine scarless healing eksistere så vel ^12,13. Undersøkelser av fosterets scarless sårtilheling i ape, lam, kanin, pungrotte, og rotter har blitt rapportert ^14-17. Men mus representerer en ideell modell for å utforske foster healing scarless såret på grunn av sin relativt lav pris per diem bur kostnader og godt karakterisert genom. Videre kan tids- og steds genetisk tap / gevinst på funksjon oppnås under embryonal utvikling ved hjelp av mus transgene systemer som tilbyr muligheter til nettopp tyde mekanismene for scarless reparasjon.

Til tross for disse fordelene, presentere mus visse tekniske utfordringer under fosterkirurgi på grunn av sin lille størrelse. Gittstresset av anestesi på en gravid mor, bør det utvises stor forsiktighet for å overvåke nivået av isofluran / oksygen som blir administrert. En blanding av 2,5% isofluran / oksygen på 2 liter per minutt, fulgt av vedlikehold av anestesi på en l pr min bør være nøye overholdt. Avvik eller svingninger i denne kritiske faktoren kan ha betydelig innvirkning sykelighet. Riktig plassering av vesken strengen sutur representerer den mest teknisk utfordrende aspekt ved operasjonen. Unnlatelse av å plassere denne masken riktig vil føre til lekkasje av fostervann og PBS etter stengetid. En utilstrekkelig mengde væske i livmoren, vil resultere i trauma til embryoene, og kan fremkalle for tidlig livmoren. Av denne grunn, er utskifting av fostervann tapt ved åpning av livmoren også et kritisk trinn i denne kirurgisk modell. Hensyn må tas til kontinuerlig å løse ut varm PBS som vesken strengen er lukket. Disse faktorene som kreves betydelig feilsøking og vi legger vekt på at oppmerksomhet til disse detaljenevil øke sannsynligheten for en vellykket operasjon. Men selv de med erfarne kirurgiske hender bør planlegge for en sykelighet rate på ca 40% i E16.5 fostre.

Forstå foster healing scarless såret har verdi for translasjonell medisin rettet mot in vivo modulering av fibrogenic oppførsel under voksne stadier av utviklingen. I forhold til voksen hud, har fosterets hud et utviklings dermis, redusert strekkfasthet, begynnende hårsekkene, og ulike ECM komponenter ^2,4. Føtal hud har en forhøyet forhold av kollagen type III til type I sammenlignet med voksen hud, færre og mindre modne mastceller, ekspresjon av keratin 8 og 19, og høyere nivåer av hyaluronsyre i forhold til voksen hud ^4,9. Ved å tyde mekanismene bak scarless healing hos fosteret, kan vi begynne å styre de molekylære og cellulære trasé ansvarlige for fibrose i den voksne mot en regenerativ fenotype. Fremveksten of avstamning sporing og andre genetiske verktøy i mus har åpnet lovende nye veier for undersøkelse av fosterets scarless sårtilheling. Gitt de iboende høy forekomst av sykelighet og for tidlig livmor sammentrekning forbundet med fosterkirurgi, undersøkelser av foster scarless hud sårtilheling in vivo krever en presis og repeterbare kirurgisk modell. Her vi detalj en reproduserbar modell av foster scarless sårtilheling i ryggen E16.5 (scarless) og E18.5 (arrdannelse) museembryoer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9 mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058