Introduction
פצעים בעור עוברי לרפא במהירות וscarlessly עד מאוחר בהריון 1. תיקון פצע צלקות עוברי מתאפיין בהתחדשות של מבנה רקמה תקין ותפקוד. המעבר מצלקות לפנוטיפ הצטלקות מתרחש בשליש השלישי של הריון בבני אדם וסביב יום עוברי 18 (E18) בעכברים 2,3. בהשוואה למבוגרים, תיקון פצע עוברי מתאפיין בepithelialization המהיר, בתצהיר רקמות חיבור, ונדידת פיברובלסטים.
מחקרים רבים הציעו הסברים אפשריים לתופעה של ריפוי פצע צלקות במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. דלקת היא מרכיב בסיסי של תיקון פצע מבוגר; עם זאת, פצעים עובריים מתאפיינים בחוסר דלקת חריפה 4. בין אם זה היא תוצאה של חוסר בגרות הפעילות של המערכת החיסונית בשלבים עובריים עדיין לא ברורה. מחקר שנערך לאחרונה הציע כי הבדלים בשפע, המחצלתurity, ותפקוד של תאי פיטום בE15 לעומת עור עוברי E18 עשוי להיות אחראים למעבר מפנוטיפ צלקות, לפחות בעכבר 3. מחקרים אחרים מניחים כי הבדלים בתכונות והשפע של מקרופאגים פצע העובריים והבוגרים אחראים ליצירה מחדש של מטריצה הנורמלית תאית (ECM) במהלך תיקון פצע עוברי 5.
הבדלים בגורמים סביבתיים במהלך התפתחות עוברית ובוגרת עשויים להשפיע גם על תיקון פצע. Longaker ועמיתיו הראו כי נוזל פצע מהעובר הוא בעל רמות גבוהות של פעילות גירוי-חומצה היאלורונית בהשוואה לאף אחד במבוגרי פצע נוזל 6. כתוצאה מכך, רמות גבוהות יותר של חומצה היאלורונית, glycosaminoglycan שמקדם מייקרו-סביבה תורם לתנועתיות של תאים והתרבות, בסביבת הפצע העוברית יכולות להיות אחראית לפנוטיפ הצלקות ראה במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. קווים אחרים של נקודת ראיות לכך שפטהסביבת פצע l היא יחסית hypoxemic ושקוע בנוזל מי שפיר סטרילי עשיר בגורמי גדילה 7. עם זאת, אין תשובה סופית כבר סיפקה לאירוע קריטי או גורם בעובר שמפעיל את המעבר מהתחדשות צלקות לתיקון fibrotic.
הבנת המנגנונים אחראים לריפוי צלקות בעובר מחייבת מודל מדויק ושחזור. כאן אנו פירוט מודל לשחזור של ריפוי צלקות עוברי פצע בdorsum של E16.5 (צלקות) ועוברי E18.5 עכבר (הצטלקות). בנוסף, שינויים קלים של מודל זה יכול להיות מנוצל כדי לבצע מספר מחקרים נוספים, כגון ניתוח ביטוי גנים מפצעים עובריים ו8,9 עור. בהתחשב בכך שהריונות בעיתוי המדויק הם קריטיים לסיכום מוצלח של מודל ריפוי זו עוברי צלקות פצעים, אנחנו גם פירוט הפרוטוקול שלנו להריונות superovulation מתוזמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל ההליכים המתוארים במאמר זה מבוצעים על פי הנחיות שנקבעו על ידי סטנפורד המנהלי הלוח במעבדת טיפול בבעלי חיים (APLAC).
1. מתוזמן הריונות - טכניקת Superovulation (איור 1)
הערה: תזמון מדויק גיל ההריון של עוברי עכבר לניתוח עוברי בE16.5 וE18.5 היא בעל חשיבות קריטית. בפירוט שסעיף זה הפרוטוקול שלנו לתזמון הריונות עכבר תוך שימוש בסרום בהריון סוסות (PMS) וזריקות גונדוטרופין כוריוני האנושי (HCG) כדי לגרום לsuperovulation.
- להזריק נקבות עכברים (<5 לכלוב) intraperitoneally (IP) עם 3.0-5.0 יחידות בינלאומיות (IU) של PMS בהיקף של 100 μl PBS 1:00-15:00 ליום 1.
- בין שעתי 12:00 ו14:00 יום 3 (ארבעים וחמישה עד 47 שעות לאחר הזרקת PMS), להזריק נקבות עכברי IP עם 3.0-5.0 IU של HCG בהיקף של 100 μl PBS.
הערה: גורמת הזרקת HCG ביוץ לאחר הזרקה כ 12 שעות. - מייד לאחר זריקות HCG, להזדווג עם נקבות גברים בגילים 8-16 שבועות.
הערה: אנחנו בדרך כלל למקם את שתי נקבות לכלוב של זכרים בודדים. - נקבות נפרדות מזכרים בבוקרו של יום 4 (6:00-10:00) ושיא כE0.5 גיל העובר.
הערה: ניתן לבדוק תקעי הנרתיק בזמן הזה; עם זאת, ההתבוננות בתוסף נרתיק אינה מבטיחה הריון ונקבות יכולות להיכנס להריון כאשר אין תקע הוא ציין. בהתחשב בכך שההריון הוא בדרך כלל נצפים על ידי בדיקה ו / או מישוש חזותי בE16.5 וE18.5 גילאי הריון, בדיקה לתקעי נרתיק בבוקרו של יום 4 הוא לא הכרחי. מניסיוננו, ובהתאם לזן, כ 30-50% מהנשים-בייץ סופר להריון תוך שימוש בטכניקה שתוארה כאן.
pg "/>
איור 1. סכמטי לטכניקת Superovulation. הליך מראה סכמטי להריונות superovulation מתוזמן בעכברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. ניתוח Murine העוברי (הגבי פציעה) על E16.5 וE18.5 עוברים (איור 2)
- לפני ההליך, לנקות את כל המשטחים של חדר הניתוח וציוד עם 70% אלכוהול איזופרופיל. בנוסף, לעקר את כל הציוד כירורגי ומכשירים שישמש בהליך על ידי המעוקר. מוסדות מסוימים עשויים לאפשר השימוש הבא של עיקור חרוז חם. לפעולה, להשתמש בחבילות סטרילי הכוללות גזה ומכשירי ניתוח.
- לגרום הרדמה באמהות בהריון (E16.5 גיל העובר או E18.5) תחת 2.5% תערובת isoflurane / חמצן ב2 ליטר לדקה ואחריו הרדמה תחזוקה בL 1 לדקה.
- להונותהרדמה ראויה משרד, להבטיח את הרפלקסים של הדוושה העמוקה של העכבר מדוכאים ומניח את העכבר בעמדה נוטה.
- החל משחת עיני וטרינר כגון Puralube כדי למנוע גירוי בעיניים או יובש במהלך ההליך.
- הכן בטן על ידי מתן יישום אור של קרם מקריח לא יותר מ -30 שניות (איור 2 א).
- הכן בטן לניתוח ספטית עם povidone- יוד ואלכוהול (איור 2 ו2C).
- בצע laparotomy קו האמצע מתחת למיקרוסקופ באמצעות מספריים מייקרו (איור 2 ד ו 2E).
- בעדינות לחשוף רחם והעובר שנבחר לניתוח (איור 2F).
- להשקות שדה ניתוח עם חם (38 מעלות צלזיוס) פוספט שנאגרו מלוח (PBS) באמצעות מחט בוטה, קצה
הערה: אחת יכול להתבצע על ידי כיפוף קצה מחט גדול נשא בזהירות. (איור 2G ו2H). - מקם את העובר באופן שיאפשרזה גישה מלאה לdorsum.
- לעבור תפר מחרוזת ארנק באמצעות תפר 7-0 ניילון דרך הרחם מעל האתר של פציעת גב המיועד (איור ט 2). מחרוזת עמדת ארנק מעל אזור של dorsum לשמאל או לימין של עמוד השדרה, ובאזור של קיר הרחם נטול כלי דם גדולים.
- לעשות חתך 3 מ"מ דרך דופן רחם וצק מי שפיר במרכז מחרוזת הארנק (איור י 2).
- להשקות אתר חתך עם חם (38 מעלות צלזיוס) PBS.
- בעזרת מספריים מייקרו, חתך פצע בודד בעובי מלא excisional, 1 מ"מ בערך באורך, בdorsum של העובר.
- בעדינות אתר חתך כתם יבש עם המוליך כותנה-טיפ.
- להזריק תת עורי דיו 3 μl נפח הודו לאתר הפצע כדי לסמן את המיקום של פצע (איור 2K).
- להשקות עם חם (38 מעלות צלזיוס) PBS כדי להבטיח דיו נשמר בתוך אתר פצע.
- יש לי עוזר כירורגיתnject החם (38 מעלות צלזיוס) PBS באמצעות בוטה, קצה 10 מזרק G לצק מי השפיר כמחרוזת הארנק סגור (איור 2L). לחזור בו מזרק כמו סגירת מחרוזת ארנק מתקרבת להשלמה (איור 2M).
- בעדינות לחזור רחם לתוך חלל הבטן (איור 2N).
- עור אוורט והצפק.
- האם עוזר כירורגית להשקות חלל בטן עם חם (38 מעלות צלזיוס) PBS.
- בטן לסגור במהירות על ידי הידוק עור הצפק סגורה (איור 2 טו). הסגירה סטנדרטית מתבצעת בשתי שכבות; הצפק ושרירי בטן בשכבה אחת, רקמה התת עורית ועור בשכבה השנייה. להקרבה וקציר של העובר מיידיים, ההפגנה שלנו מראה סגירה בשכבה אחת.
- מניחים את החיה תחת השגחה בחממה חמה נקבעה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או עד שהחיה להכרתו מספיק כדי לשמור על כיבה sternal.
- אל מילכד בעלי החיים לחברה של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש לחלוטין מההליך.
- על התעוררות מהרדמה ובמהלך שעות 48 לאחר מכן, לנהל הזרקה תת עורית של עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם) כל 12 שעות לשיכוך כאבים לפי צורך בהתבסס על הערכת כאב. לנהל carprofen (5 מ"ג / קילוגרם) באמצעות הזרקה תת עורית להקלה על כאב לאחר ניתוח נוסף לפי צורך.
- חזור בעלי חיים לכלוב ולספק להם כרצונך מזון ומים.
- לפקח על גילויי כאב מקרוב.
- לאחר ניתוח 48 שעות, להקריב את אמא בהריון עם מנת יתר של isoflurane והעובר קציר נפצע. כדי לעשות זאת, להתאים ריכוז isoflurane עד 5% ומעלה, ולשמור על חשיפת דקות 1 לאחר הפסקת הנשימה. לאשר המתת חסד עם נקע בצוואר הרחם. קציר עובר unwounded לביקורת שווה גיל. עוברים המאוחר צריכים שיטה נפרדת של המתת חסד בקנה אחד עם המלצות IACUC, כגון deהקפיטציה, נקע בצוואר הרחם, או הזרקה כימית.
איור 2. סכמטי לכירורגיה Murine עוברי. צעדים כלליים לגב פצעו בE16.5 ועוברי עכברי E18.5. () אפילציה של בטן עכבר. (B ו- C) הכנה של בטן עכבר. (ד) מיקרוסקופ ניתוחי המשמשת ל חתך יצירת הליך. (E) קו האמצע laparotomy. (F) חשיפה של רחם. בריאה (G) של מחט קהה קצה. (H) השקיה של רחם עם מי מלח חמים. (I) של תפר מחרוזת ארנק. (J) דרך רחם מ"מ קיר ודור 1 פצע מלא עובי excisional. (K) הזרקה תת עורית של דיו הודו. (L ו- M) סגירת תפר מחרוזת ארנק. (N ו- O)סגירת הבטן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לניתוח היסטולוגית, פצעי cutaneous בעור הגב של עוברי עכברי E16.5 וE18.5 צריכים להיות שנקטפו לאחר פציעה-48 שעות, קבוע PFA 4%, ו- מוטבע פרפין. במודלים מהונדסים ניאון, הקפאה עם אוקטובר עשויה להיות מתאימה. יש כמה כתמים שעשויים לשמש כדי לחזות מבנה רקמת חיבור סלולארי ו. Hematoxylin ו eosin הוא כתם בשני צבעים שמכתים גרעינים כחולים ומבני eosinophilic (כלומר., ציטופלסמה וקולגן תאי) בגוונים שונים של וכתום אדום, ורוד,. Trichrome של מאלורי הוא כתם שלושה צבעים בהיקף של אנילין כחול, fuschin חומצה וכתום G, מתאים ביותר להבחנה תאים מרקמות חיבור.
איור 3. היסטולוגיה מפצעי צלקות E16.5 העוברי. () Hematoxylin וכתם eosin מחדשveals reepithelialization מלא ועלייה מתונה במספר התאים דלקתיים הנוכחיים (חיצים). (100x; בר = 100 מיקרומטר) כתם (B) Eosin תערוכות דיו הודו (ראשי חץ) סביב זקיקי שיער התחדשות (חץ) (400x; בר = 25 . מיקרומטר) (כתם Trichrome C) של מאלורי מגלה דפוס משובח רשתי קולגן עורי עם הנוכחות של זקיק שיער (400x; בר = 25 מיקרומטר). הודפס מחדש באישור מet al המחקר קולוול. 10 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אם פצעי excisional גב הם בגודל המתאים (1 מ"מ) והעומק (עובי מלא), מכתים hematoxylin ו eosin יגלה שמרפא עור E16.5 עם צלקות מינימליות, reepithelialization מלא, ועלייה קטנה בלבד במספר דלקתי תאים (איור 3 א). יתר על כן, woun אלהds צריך לרפא עם ארכיטקטורת עור כ נורמלית ומכיל התחדשות זקיקי שיער באתר של פציעה (חיצים; איור 3). יישום נכון של דיו הודו לפצע הטרי שנוצר צריך לגרום לתצהיר דיו באתר של פציעה (ראשי חץ; איור 3). לבסוף, Trichrome מכתים צריך לחשוף מאפיין דפוס קולגן קנס עורי רשתי של הדרמיס ללא צלקות (איור 3 ג).
איור 4. היסטולוגיה מפצעי הצטלקות E18.5 העוברי. Hematoxylin () וכתם eosin מגלים עלייה בצביעת eosin בדרמיס באתר של פציעה (חיצים). (200x; בר = 50 מיקרומטר) (ב) כתם Trichrome של מאלורי תערוכות קולגן הצפוף עורי (חיצים) (400x; בר = 25 מיקרומטר). הודפס מחדש באישור מאל המחקר קולוול et.10
בהשוואה לפצעים שנעשו בE16.5, hematoxylin והכתים eosin מפצעי גב שנעשה בE18.5 וקצרו 48 לאחר פציעה-hr צריך לחשוף צלקת צפופה עם הפסד של אדריכלות עור רגילה באתר של פציעה (איור 4 א). באופן דומה, Trichrome צביעה מגלה דפוס צפוף של תצהיר קולגן לא מאורגן (חיצים; איור 4). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול כירורגית המוצג כאן מתאר מודל excisional של ריפוי צלקות עכבריות העוברי שפורסם לראשונה בשנת 2006 על ידי המעבדה שלנו 10. בנוסף למודלים מבוססים אחרים של פציעת excisional 11, מודלים incisional של ריפוי צלקות עכברי עוברי קיימים גם 12,13. חקירות של ריפוי פצע צלקות עוברי בקוף, הכבש, ארנב, האופוסום, והעכברוש דווחו 14-17. עם זאת, עכברים מייצגים מודל אידיאלי לחקר ריפוי פצע צלקות עוברי בשל עלותם הנמוכה יחסית ל- דיאם כלוב והגנום מאופיין היטב. יתר על כן, הפסד / רווח גנטי של זמן ומרחב של פונקציה יכול להיות מושגים במהלך התפתחות עוברית באמצעות הזדמנויות הנפקת מערכות מהונדסים עכבריות לפענח בדיוק את מנגנוני תיקון צלקות.
למרות יתרונות אלה, עכברים להציג אתגרים טכניים מסוימים במהלך ניתוח עוברי בשל גודלם הקטן. בהתחשב בלחץ של הרדמה על אמא בהריון, יש לנקוט בזהירות רבה כדי לפקח על רמת isoflurane / חמצן להיות מנוהל. תערובת של 2.5% isoflurane / חמצן ב2 ליטר לדקה ואחריו הרדמה תחזוקה בL 1 לדקה צריכה להיות דבקה בזהירות ל. סטיות או תנודות בגורם קריטי זה יכול להשפיע באופן משמעותי לתחלואה. מיקום נכון של תפר מחרוזת הארנק מייצג את ההיבט ביותר מבחינה טכנית המאתגר של הניתוח. כישלון למקום התפר הזה בצורה נכונה יגרום לדליפה של מי שפיר ולאחר סגירת PBS. נפח מספק של נוזל ברחם יגרום לטראומה לעוברים ועלול לגרום להתכווצות רחם מוקדמת. מסיבה זו, החלפת הנוזל מי שפיר איבד עם פתיחה של הרחם היא גם שלב קריטי במודל זה כירורגית. יש להקפיד להוציא הרף PBS החם כמו מחרוזת הארנק סגורה. גורמים אלה נדרשים לפתרון בעיות משמעותיות ואנו מדגישים את תשומת לב שלפרטים אלהיגדיל את הסבירות לניתוח מוצלח. עם זאת, גם לאלה עם ידיים כירורגית מנוסים צריכים לתכנן לשיעור תחלואה של כ -40% בעוברים E16.5.
הבנת ריפוי פצע צלקות עוברית מחזיקה ערך עבור רפואת translational במטרה אפנון in vivo של התנהגות fibrogenic בשלבים בוגרים בפיתוח. בהשוואה לעור מבוגר, יש לו עור של העובר הדרמיס פיתוח, כוח מופחת מתיחה, זקיקי שיער המתהווים, ורכיבי ECM שונים 2,4. יש עור עוברי יחס גבוה של קולגן סוג III להקליד אני בהשוואה לעור מבוגר, תאי פיטום פחות ופחות בוגרים, ביטוי של Keratins 8 ו -19, ורמות גבוהות יותר של חומצה היאלורונית בהשוואה ל4,9 עור בוגרים. על ידי פענוח מנגנוני ריפוי צלקות בעובר, אנו יכולים להתחיל לנווט את המסלולים המולקולריים ותאיים האחראים לסיסטיק במבוגרים כלפי פנוטיפ משובי. O ההופעהשושלת f התחקות וכלים גנטיים אחרים בעכבר פתחו אפיקים חדשים ומבטיחים לחקירה של ריפוי צלקות עוברי פצע. בהתחשב בשיעורים הגבוהים מיסודו של תחלואה והתכווצות רחם מוקדמת הקשורים לניתוח עוברי, חקירות של עור צלקות עוברי ריפוי פצע in vivo דורש מודל כירורגית מדויק ודיר. כאן אנו פירוט מודל לשחזור של ריפוי צלקות עוברי פצע בdorsum של E16.5 (צלקות) ועוברי E18.5 עכבר (הצטלקות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק מNIH מענק R01 GM087609 (לHPL), מתנות מאינגריד Lai וביל שו לכבוד אנתוני שו (לHPL), HL099776 U01 מענק NIH (לMTL), המעבדה Hagey ל ילדים רפואת רגנרטיבית וקרן האלון (לMTL וHPL). GGW נתמכה על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד, תכנית הכשרת המדען הרפואי סטנפורד, וGM07365 מענק הכשרת NIGMS. MSH נתמכה על ידי CIRM קליני עמית הדרכת גרנט TG2-01159. WXH נתמכה על ידי מימון מסארנוף הלב וכלי דם הקרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-O MONOSOF Suture | eSuture | SN-1647G | |
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Autoclip 9 mm | Texas Scientific Instruments | 205060 | |
| Insulin Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-272-382 | |
| Black Pigment | AIMS | 242 | |
| BD Safety-Lok 3 ml Syringe | BD Biosciences | 309596 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| OPMI-MD Surgical Microscope | Carl Zeiss Surgical Inc | ||
| Pregnant Mares Serum (PMS) | Millipore | 367222 | |
| Human Chorionic Gonadotropin (HCG) | Sigma-Aldrich | CG10 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 |
References
- Larson, B. J., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Scarless fetal wound healing: a basic science review. Plastic and reconstructive surgery. 126, 1172-1180 (2010).
- Wilgus, T. A. Regenerative healing in fetal skin: a review of the literature. Ostomy/wound management. 53, 16-31 (2007).
- Wulff, B. C., et al. Mast cells contribute to scar formation during fetal wound healing. The Journal of investigative dermatology. 132, 458-465 (2012).
- Lorenz, H. P., Adzick, N. S. Scarless skin wound repair in the fetus. The Western journal of medicine. 159, 350-355 (1993).
- Longaker, M. T., et al. Wound healing in the fetus. Possible role for inflammatory macrophages and transforming growth factor-beta isoforms. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 2, 104-112 (1994).
- Longaker, M. T., et al. Studies in fetal wound healing. IV. Hyaluronic acid-stimulating activity distinguishes fetal wound fluid from adult wound fluid. Annals of surgery. 210, 667-672 (1989).
- Colombo, J. A., Napp, M., Depaoli, J. R., Puissant, V. Trophic influences of human and rat amniotic fluid on neural tube-derived rat fetal cells. International journal of developmental neuroscience : the official journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 11, 347-355 (1993).
- Colwell, A. S., Longaker, M. T., Peter Lorenz, H. Identification of differentially regulated genes in fetal wounds during regenerative repair. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16, 450-459 (2008).
- Hu, M. S., et al. Gene expression in fetal murine keratinocytes and fibroblasts. The Journal of surgical research. , (2014).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. An in vivo mouse excisional wound model of scarless healing. Plastic and reconstructive surgery. 117, 2292-2296 (2006).
- Wilgus, T. A., et al. The impact of cyclooxygenase-2 mediated inflammation on scarless fetal wound healing. The American journal of pathology. 165, 753-761 (2004).
- Iocono, J. A., Ehrlich, H. P., Keefer, K. A., Krummel, T. M. Hyaluronan induces scarless repair in mouse limb organ culture. Journal of pediatric surgery. 33, 564-567 (1998).
- Chopra, V., Blewett, C. J., Krummel, T. M. Transition from fetal to adult repair occurring in mouse forelimbs maintained in organ culture. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 5, 47-51 (1997).
- Adzick, N. S., Longaker, M. T. Animal models for the study of fetal tissue repair. The Journal of surgical research. 5, 47-51 (1991).
- Block, M. Wound healing in the new-born opossum (Didelphis virginianam). Nature. 187, 340-341 (1960).
- Longaker, M. T., Dodson, T. B., Kaban, L. B. A rabbit model for fetal cleft lip repair. Journal of oral and maxillofacial surgery : official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 48, 714-719 (1990).
- Longaker, M. T., et al. A model for fetal cleft lip repair in lambs. Plastic and reconstructive surgery. 90, 750-756 (1992).
