Immortaliserede kræft cellelinjer kan dyrkes som 3D-cellekulturer, en værdifuld model for biologisk forskning. Denne protokol beskriver massespektrometri billeddannelse af 3D cellekulturer, herunder forbedringer i prøveforberedelse platform. Målet med denne protokol er at instruere brugerne at forberede 3D cellekulturer til massespektrometri billeddannelse analyse.
Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.
Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1–4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5–7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8–11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12–14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15–21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.
Ved anvendelse af fremgangsmåderne, der er skitseret ovenfor, kan 3D cellekulturer dyrket og analyseret med MALDI-MSI. Mange udødeliggjorte cellelinier vil danne 3D-strukturer, når de dyrkes på passende vis. 9,10 bør udvises forsigtighed for at dyrke celler, der ikke er blevet overvæltet for mange gange, der er, har et lavt antal passage. Generelt celler med tal passage af ti og lavere er optimale til dyrkning 3D cellekulturer. Dyrkning 3D cellekulturer i en traditionel agarose support giver en omkostningseffektiv måde for forskergrupper interesseret i 3D cellekultur til at prøve dette system. Denne metode udnytter få komponenter ikke allerede er i de fleste mammale cellekultur laboratorier. Omhyggelig opmærksomhed skal rettes til udarbejdelsen af agaroseplader for vækst, således at 3D-cellekulturer er konsekvente i størrelse og form; nogle aspekter, som kræver omhyggelig indbefatter kontrollere, at ingen luftbobler indesluttes til blandingen, og at en korrekt menisk dannes i bunden af hver well. Hvis menisken ikke danner ordentligt, kan cellerne vokse i ikke-sfæroide former eller i små klumper. Desuden skal man være omhyggelig ikke at placere PBS i gelatinen med sfæroiderne. Hvis dette sker, fjernes PBS fra toppen af gelatine ved anvendelse af en 200 pi pipette. Hvis omkostningerne ikke er en faktor, ultra-lav bindende rundbundede plader er kommercielt tilgængelige og tilbyder forenkling af disse trin. Mens andre væv indstøbningsmetoder også kan være dyrt og ikke-massespektrometri forenelige, gelatine-embedding vist sig at være både billig og alsidig. Forberedelse strategier skitseret ovenfor er blevet optimeret til 3D cellekulturer for at opnå den højeste datakvalitet. Mens gelatine-embedding har vist sig at være forenelige med massespektrometrianalyse denne proces gør indsnævre de tilgængelige matricer på grund af co-krystallisering. Når frosset, 3D cellekulturer er stabile i flere måneder, så længe de ikke er fryse-optøet. Gelatinen bliver uigennemsigtig når frosne, og 3D-cellekulturer er af en lignende farve, så det er tilrådeligt før frysning at dokumentere 3D cellekultur placering til støtte i udskæring.
Ved fremstilling af objektglas, kan anvendes matrix med flere forskellige metoder, men det skal bemærkes, at nogle matricer har vist sig at co-krystallisere med gelatinen, såsom ferulasyre, hvilket gør prøven ubrugelig. Mindre matrix krystaller producere mere konsistent massespektre. Mens handspotting er den enkleste metode til matrix ansøgning, kan den større solvens volumen resultere i større krystal størrelser og signifikant analyt migration.
På massespektrometer, fremskridt i MALDI-MSI teknologier har reduceret den nødvendige ekspertise til begyndelsen analyser. Indsamling og analyse af data er ligetil på de fleste systemer, der gør det muligt selv en nybegynder at få oplysninger af høj kvalitet fra ITO-coatede objektglas. Omhyggelig udvælgelse af instrumentets parametre optimeret på nærliggende non-image værdig 3D celle cultures, er afgørende for at opnå data af høj kvalitet. For eksempel kan øge laser magt øge peak intensitet, men faldende laser magt kan forbedre opløsning og give mere symmetrisk top figurer. 3D cellekulturer bør anvendes hurtigt efter udskæring for at sikre optimal prøve kvalitet. Nedbrydning af protein signal kan ses i mindre end en uge uden korrekt opbevaring (ekssikkator / -80 ° C fryser), især i den høje masse region (over 20 kDa). På grund af stigende efterspørgsel, har mange forskellige visualisering programmer blevet udviklet og er fri for den offentlige forskning. De fleste imaging massespektrometre har installeret den nødvendige software til at visualisere enkelt masserne med de proprietære formater, der anvendes på de enkelte instrumenter. Disse programmer kan anvendes til opnåelse af enkelt-masse og eksportere dataene. De fleste software vil også give overlejring af to eller flere masser af interesse. Derudover er der mange forskellige seere til MSI data er gratis at hente, f.eks MSiReader end BioMap. 32,33 massespektrometri data må også behandles efter overtagelsen med lethed, hvilket bringer flere nyttige oplysninger i forgrunden.
Fra lægemidler til lipider til proteiner, det ovennævnte system giver mulighed for hurtig indsamling af data til at vurdere fordelingen af molekyler af interesse på tværs af en 3D-cellekultur struktur. Serielle sektioner kan træffes for at afbilde hele 3D-struktur ved at bygge fra hver 2D billede af en skive af 3D cellekultur. De teknikker og noter i protokol vil være til gavn for forskere, der ønsker at begynde tredimensionel cellekultur som en bro mellem monolagskultur og dyremodeller. Når mestrer, kan disse teknikker anvendes på flere forskellige typer af 3D cellekulturer, væv og cellekulturer, så forskere til billedet alt efter hvad prøver de vælger.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
HCT116 Cell line | ATCC | ATCC CCL-247 | Potential hazard, handle with care |
McCoy's 5A media | Gibco | 16600-108 | |
Fetal Bovine serum | HyClone | SH30071.03 | |
0.25% Trypsin-EDTA solution | Gibco | 25200-056 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010049 | |
Gelatin, unflavored | Knox | — | Available at most grocery stores in single-packets |
ITO-coated glass slides | Delta Technologies, Limited | CG-90IN-S115 | |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
Sinapic Acid | Sigma-Aldrich | 85429 | |
0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set | RoyalMax Airbrush | — | Many options available on sites such as Amazon.com |