Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Prøvepreparering Strategier for massespektrometri Imaging av 3D-Cell Kultur Modeller

Published: December 5, 2014 doi: 10.3791/52313
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre Dame, 2Harper Cancer Research Institute, University of Notre Dame

Summary

Udødeligkreftcellelinjer kan dyrkes som 3D cellekulturer, en verdifull modell for biologisk forskning. Denne protokollen beskriver massespektrometri avbildning av 3D cellekulturer, inkludert forbedringer i prøveopparbeidelse plattformen. Målet med denne protokollen er å instruere brukere å forberede 3D cellekulturer for massespektrometri bildeanalyse.

Protocol

1. 3D Cell Kultur og forberedelse til Imaging

  1. Kultur en passende cellelinje, det vil si, HCT116 colon carcinoma cellelinje, i todimensjonale, monolagskultur.
  2. Vokser HCT 116 celler i en T-25-kolbe med McCoys 5A medium + 10% føtalt bovint serum i en 5% CO2-inkubator inntil 50-70% konfluens, som vanligvis tar et par dager.
  3. Slipp celler med 0,25% trypsin-EDTA-oppløsning og telle en porsjon av cellene ved hjelp av et hemocytometer og Trypan blå farging for å kontrollere celle-densiteten og levedyktighet.
  4. Etter telling, fortynn cellene med komplett medium for å oppnå en passende seeding densitet på 6000 celler / brønn, eller 30,000 celler / ml.

2. Forbered agaroseovertrukne 96 brønners plater

  1. Legg til 0,19 g agarose i 10 ml av standard media i en 50 ml konisk rør (1,5% agarose-løsning i mediet 10). Sikre inkorporering av forsiktig omrøring. Autoklaver agarose i et vannbadi 20 min.
  2. Ved hjelp av en multikanal pipette, aspirer 50 ul av agarose + media blandingen i 60 sentrale brønner på flatbunnet 96-brønners plate kulturplate. Ettersom brønnene på ytterkantene av platen har litt høyere fordampningshastigheter, tilsett 200 pl 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) i stedet for agarose til disse kanter.
  3. Når agarose blanding har blitt lagt til de indre brønner, sett platen til side for å avkjøles til ~ 37 ° C før tilsetningen av cellene.

3. Seed og Pleier det Tredimensjonal Kultur

MERK: Flere eller færre celler kan bli utsådd avhengig av kravene i kultur som er involvert, men det er blitt bestemt at disse forhold resulterer i 3D-cellekultur strukturer av ca. 1 mm i diameter etter 10 til 14 dager i kultur (data ikke vist) .

  1. Tilsett 200 ul av den passende celleløsning (fortynnet til å inneholde ~ 6000-celler) til agarose-overtrukket96-brønners plate. Dekk plate og satt i fuktig inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C for cellevekst.
  2. Endre celle media minimum hver 48 time, eller når media ser ut til å endre farge.
    1. Endre mediet ved forsiktig å aspirere den gamle mediet fra rundt den lille 3D cellekultur (synlig for det blotte øye etter dag 2) ved bunnen av agarose. Tilsett 200 mL av fersk media forsiktig over 3D-cellekultur.
    2. (Valgfritt trinn) I løpet av disse medie endringer, legge kjemoterapeutika eller andre rusmidler for testing. Fortynne stoffet valgfrihet til den endelige konsentrasjonen med komplett media og legge de nødvendige 200 fil til hver brønn.
    3. Overvåke 3D cellekulturvekst ved optisk mikroskop, til 3D-cellekulturer er omtrent 1 mm i diameter.

4. Harvests 3D cellekulturer

  1. Bruk en 2 ml serologisk pipette til å forsiktig fjerne 3D cellekultur fra agarose seng.
    2. <li> Vask 3D cellekulturer med PBS ved forsiktig pipettering dem i ca 1 ml PBS i en ventende 24 brønners plate.
  2. Transfer høstet 3D cellekulturer via serologisk pipette til sentrifugerør for protein eller metabolitt utvinning, eller legge dem i en skjæring medium for å bistå i slicing for bildebehandlingsprogrammer.

5. Legge 3D cellekulturer i Gelatin

  1. Forbered en løsning av ~ 175 mg / ml gelatin i høy renhet vann (18 Megohm foretrekkes). 22,23 Bland gelatin kraftig. Observere løsningen blir tyktflytende og vanskelig å manipulere. Plasser gelatin-inneholdende konisk rør i et vannbad ved ~ 60 ° C og varm til løsningen blir klar og lett å aspirere.
    MERK: Den varme gelatin løsning stivner raskt som den kjøler, så utføre alle de følgende trinnene raskt før frysing.
  2. Etter at den er varmet opp, ta gelatin umiddelbart til hetten cellekultur. Hold røret med gelatin i en beaker med forvarmet vann på ca 60 ° C for å unngå herding av gelatinoppløsning.
  3. Ved hjelp av en 2 ml serologisk pipette, setter 0,6 ml av den varme gelatinoppløsning ned i brønnen på en 24 flatbunnet plate. Dette volum er tilstrekkelig til å dekke bunnen i et tynt lag. Forsiktig avsette 3D-cellekulturer umiddelbart på toppen av gelatinlaget ved hjelp av en annen 2 ml pipette for å unngå sprekker 3D-strukturen.
    MERK: Man må passe på dette stadiet ikke å plassere PBS inn i gelatin. Hvis dette skjer, men fjerner PBS fra toppen av gelatin ved hjelp av en 200 ul pipette.
  4. Etter 3D-cellekulturer er plassert på overflaten av gelatinlaget, nøye pipettere ytterligere 0,6 ml av den varme gelatinblanding over 3D-cellekulturer, for slik å ikke forstyrre stillingen av kulturene. Etter at det andre lag er plassert, fryse gelatin-innleiret 3D-cellekulturer ved -80 ° C.

6. Slice og Thaw Mount the Gelatin-embedded 3D cellekulturer for massespektrometrisk Imaging

  1. Fjern 24-brønners plate inneholdende 3D-cellekulturer fra fryseren. Varm bunnen av tallerkenen med varmen fra hånden til en pinsett eller skalpell vil gli forsiktig ned på siden av brønnen.
  2. Jevnt skyv pinsett eller skalpell, frigjøre gelatin uten tining sentrum. Ta en dråpe vann til kryostaten støtte og bruke dette til å overholde den gelatin disken til støtte.
    1. 3D-cellekulturer innebygd i gelatin er mest mottagelig for kutting ved -30 ° C. Rengjør kryostat blad og glass med 70% etanol før bruk. Bruk en annen del av bladet eller et nytt blad for hver 3D cellekultur-gelatin plate for å hindre dulling av bladet.
  3. Bruke kryostat, forsiktig ansiktet av overflødig gelatin til 3D-cellekulturer blir synlige.
  4. På dette punktet sakte skjære 3D cellekulturer med en jevn bevegelse i 12-16 mikrometer seksjoner.
    MERK: Kritiske faktorer til kutting omfatter avstanden av glasset til bladet, bladvinkelen, temperaturen av kryostaten, og vinkelen av skiven på bæreren, slik at alle disse må kontrolleres for å sikre konsekvente resultater.
  5. Nøye tine skivene og montere dem på indium titan oksid (ITO) -belagte glass merket på riktig måte og lagre den i en eksikkator. Bruk stykker så raskt som mulig for å oppnå maksimal kvalitet.

7. Matrix Søknad og Prøvepreparering for MALDI Imaging

  1. Før MALDI bildebehandling, forberede skiver med riktig matrise.
    1. For lite molekyl analyse, er ingen vasketrinn vanligvis nødvendig. For intakt proteindeteksjon, vaskes skivene i kald 100% aceton, til Carnoy s fluid, eller 70% / 95% isopropanol fjerne små molekyler slik som lipider som kunne maskere signalet 24 -. 26
    2. Vask forsiktig for ikke mer enn 30 sek på en gang. Ikkeå forstyrre noen skiver.
  2. Forbered matrise i en løsning av organisk løsningsmiddel og vann, med 0,1% TFA. For lite molekyl slik som α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA), bruker 60% ACN: 40% H2O: 0,1% TFA (10 mg / ml). For protein deteksjon som sinapic syre (30 mg / ml), bruke samme løsemiddel løsning. For optimal oppløselighet av sinapic syre, oppløses først i acetonitril før tilsetning av TFA: H2O løsning. Andre matrikser kan anvendes etter ønske.
    MERK: Matrix kan anvendes med en rekke forskjellige metoder, men det bør legges merke til noen matriser har blitt funnet å co-crystalize med gelatin, som for eksempel ferulsyre, slik at prøven kan brukes. Små krystaller gir mer konsistent massespektra, slik at for flere molekylære arter som skal påvises, og tilbakeføres til biologiske forskjeller i stedet for matrise effekter.
  3. Påfør matrise ved handspotting metode.
    1. Bruk en tynn sprøyte for å søke 0,5 mL av matrix løsning på 3D-cellekultur skive og la matriksen crystalize.
  4. Alternativt kan du bruke airbrush metoden. Fyll en kommersiell karakter airbrush med matrisen løsning.
    1. Hold sprøyta 8-12 inches unna raset, sikte en fin spray på skive. I mellom passerer, at matrisen tørke i 1 min for å tillate den beste krystalldannelse. Opp til 10 til 20 passeringer av airbrush er nødvendig for å produsere et optimalt lag av matrisen 22.
  5. Alternativt kan du bruke den sublime metoden beskrevet andre steder. 25,27
  6. Tørre glir i en eksikator i minst 30 min før MALDI-MSI, uavhengig av fremgangsmåten for matrise søknad. 25

8. MALDI-MSI analyse ved hjelp av et MALDI-TOF System (dvs. autoflex III)

MERK: Denne delen inneholder instruksjoner og råd for innstilling av parametere for et MALDI-TOF bildebehandling eksperiment. Avhengig av instrument produsent og programvare som benyttes, kan prosessen variere.

  1. Monter lysbilder i en adapter laget for å sikkert holde 75 mm x 25 mm lysbilder til bilde 3D cellekultur skiver festet til ITO belagt lysbilder. Laste raset adapter inn i instrumentet.
  2. Forberede instrument for MALDI-MSI ved å velge en passende kalibrering standard for masse utvalg i spørsmålet. For utspørring av små molekyler, de signaler som detekteres som svarer til matrisen som brukes, α-CHCA, er en vanlig gruppe calibrants. For analyse av proteiner, er kjent for proteinstandarder (dvs., ubiquitin, trypsinogen) i masseområdet av interesse velges og flekket tilstøtende til 3D-cellekulturer som calibrants. Kalibrere instrumentet før du fortsetter med metodeutvikling.
  3. Før bildebehandling, utvikle datainnsamlingsmetoder for masse rekke valg med programvaren som leveres av instrumentprodusenten. Se figurene 1 og 2 forlite molekyl og protein bildebehandling. For lite molekyl bildebehandling, bruke reflectron modus for den høyeste masse oppløsning.
    1. Juster masse utvalg for lite molekyl datainnsamling mellom 100-1.000 m / z og for proteiner mellom 8,000- 25.000 m / z. Juster masseområdet til å omfatte området for valg samtidig som det gir den høyeste masse mulig oppløsning med instrumentet.
    2. Juster laser makt, hyppighet, antall laserskudd og spot størrelse ved hjelp av kalibreringsløsning og en nærliggende "offer '3D cellekultur skive. Observere disse innstillingene i hovedinstrumentet kontroll programvare. Bruk følgende innstillinger som en anbefalt utgangspunkt: 60% strøm, 400 laserskudd, ultra liten flekk størrelse. Disse innstillingene vil variere på tvers av instrumenter og metoder, så optimalisere instrumentparametre for å gi den høyeste kvalitet spektra for hvert enkelt instrument. Andre parametre som kan justeres inkludere detektoren gevinst, samplingsfrekvens, og elektronisk gevinst. Save denne metoden for bruk i bildebehandlingsprogrammer (ie., AutoExecute Method at FlexImaging vil trekke på).
      MERK: Undertrykk ioner under masseområdet av interesse (igjen funnet i instrumentkontroll), slik at den ikke interfererer med påvisning.
    3. Utvikle protein datainnsamlingsmetoder for masse rekke valg. Følg de samme trinnene ovenfor, men for de mid-til-høy masseklasser, over ca 3 kDa, bruke lineær modus.
      MERK: Innstillinger vil avvike fra de som brukes for små molekyl metoder.
  4. Oppsett spesifikke MS instrument parametere ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer levert av instrumentprodusenten, som FlexImaging for Bruker MALDI-TOF systemer.
    1. Opprett en ny bilde fil og mappe, ved hjelp av metoder utviklet før og lagret. Velg de instrumentparametre som raster spot størrelse (endring fra standard ca 200 mikrometer til 50 mikrometer), sette opp instrumentet kontrollmetode (oppsett i trinn 8.3.2 eller 8.3.3), og posisjon hvor du skal skanne over 3D cellekultur.
    2. Velg tre aktuelle teach poeng på prøven, flytte laseren til hver etter tur. Skaff den optiske fotografi fra MALDI-TOF laserkontroll programvare ved hjelp av "print screen".
      MERK: Mange bildebehandlingsprogrammer krever en optisk bilde av prøven å "lære" programvaren hvor laseren er plassert, som kan fås med en skanner eller ofte instrumentet kamera.
  5. Start deretter bildeprosessen fra bildebehandlingsprogrammer (ikke instrumentkontroll) og skaffe massespektra fra hver skive. Observere de fleste massene over hele 3D cellekultur og andre lokalisert til bestemte områder.

9. Valgfrie data analysemetoder

  1. For målrettet analyse, utføre manuell analyse av spektra ved å klikke en masse i mellom spekteret, eller la bildebehandlingsprogrammer å automatisk plukke massene over en bestemt terskel (f.eks., Topper abOve topp 20% terskel). For kvalitetskontroll, undersøke fordelingen av matrise topper eller den midlere spektrum.
  2. Utføre statistiske analyser med utvunnet datasett i matematisk programvare som R eller Matlab.
    1. Eksport enkelt spektra i ASCII-format, en lesbar tekstfil, til lasting i programvaren av valget.
    2. Konvertere den enkelte spektra til ASCII, mzXML, av mzML format for lesing av flere forskjellige programmer, 28 -. 31 eller eksportere dataene som en Analyser (.img) format fil, et felles format som brukes for andre bildebehandlingsprogrammer som for eksempel MR 32 to open-source alternativer for analyse er MSiReader og BioMap 32,33.
    3. Når filene er eksportert til et format som kan leses av programvaren, legger datasettet via instruksjonene i de respektive programvare. Etter lasting, utføre post-oppkjøpet behandling, for eksempel baseline fjerning og normalisering.
    4. Med dette datasettet, utføre statistical behandlinger som prinsipal komponent analyse av hierarkisk clustering enten ved hjelp av egendefinerte skript eller bygget i algoritmer i programvare som Matlab 18.

Representative Results

MSI avbildning har potensial til å avsløre mange forskjellige molekylfordeling i 3D-cellekulturer. Ved hjelp av fremgangsmåten som er skissert ovenfor, kan arter fra små molekyler (figur 1) til store proteiner (figur 2) spores over kulturen. Disse resultater viser visualiseringen av et enkelt ion med den frie verktøyet MSiReader. 32 Resultatene kan analyseres for enkle ioner av interesse over hele 3D cellekultur med visualisering enten i et område av interesse, eller hele den skannede område. I tillegg mest programvaren vil automatisk visualisere ioner over en viss terskel satt av brukeren, som kan hjelpe forskning innsats. Når enkelt ion kart er innhentet, inkluderer det meste programvare en evne til å legge over bildene for å se colocalization av ioner. Enten i oppdagelsesbaserte tilnærminger eller på en målrettet måte, er massespektrometri avbildning et kraftig verktøy for å analysere 3D-cellekulturer.


Figur 1. Representative resultatene av 3D cellekultur vekst og seksjonering. Venstre) Optisk bilde av en intakt kolorektal HCT-116 3D cellekultur struktur som vises på dag 14 før høsting. Høyre) Optisk bilde av en ca ekvatoriale bit av en kolorektal 3D cellekultur tine montert på en ITO-belagt lysbilde for bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Representative resultater av lite molekyl MALDI-MSI av en ekvator delen av en 3D-cellekultur. Top) Gjennomsnittlig massespektra oppnådd med α-CHCA i lav masse (lite molekyl) rekkevidde. Bunn) Representative bilder aven enkelt masse: 327,8 m / z hovedsakelig lokalisert til det indre av 3D-cellekultur og 429,7 m / z hovedsakelig lokalisert til kanten av 3D-cellekultur. Stiplede linjen viser omtrent kanten av spheroid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representative resultatene av protein avbildning av MALDI-MSI av en ekvator delen av en 3D-cellekultur. Top) Gjennomsnittlig massespektra oppnådd med sinapic syre i høyere (protein) masse utvalg. Bunn) Representative bilder av en enkelt masse: 10 871 m / z hovedsakelig lokalisert til kanten av den sfæroide, og 12184 m / z lokalisert mer mot det indre av den sfæroide. Stiplet linje indikerer den omtrentlige kant av den sfæroide. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Ved hjelp av metodene som er skissert ovenfor, kan 3D-cellekulturer dyrkes og analysert med MALDI-MSI. Mange udødeligcellelinjer vil danne 3D-strukturer når de dyrkes på riktig måte. 9,10 Det må utvises forsiktighet for å dyrke celler som ikke har gått for mange ganger, det er, har lav passasje tall. Generelt er celler med passasje antall av ti og lavere er optimale for dyrking av 3D-cellekulturer. Voksende 3D cellekulturer i en tradisjonell agarose støtte gir en kostnadseffektiv måte for forskningsgrupper som er interessert i 3D cellekultur for å prøve dette systemet. Denne metoden benytter få deler som ikke allerede er i de fleste pattedyrcellekultur laboratorier. Nøye oppmerksomhet må betales til utarbeidelsen av agaroseplater for vekst, slik at 3D-cellekulturer er konsekvente i størrelse og form; noen aspekter som krever nøye oppmerksomhet er kontroll av at ingen luftbobler innesluttes i blandingen, og at en riktig menisk dannes på bunnen av hver well. Hvis menisken ikke dannes korrekt, kan cellene vokse i ikke-sfæroide former eller i små klumper. Dessuten må man passe på å ikke plassere PBS inn i gelatin med kulene. Hvis dette skjer, må du fjerne PBS fra toppen av gelatin ved hjelp av en 200 mL pipette. Hvis prisen er ikke en faktor, ultra-lave bindende runde bunnplater er kommersielt tilgjengelige og tilbyr forenkling av disse trinnene. Mens andre vev innebygging metoder kan også være kostbart og ikke-massespektrometri kompatibel har gelatin-innebygging blitt vist å være både billig og allsidig. Forberedelse strategier skissert ovenfor har blitt optimalisert for 3D-cellekulturer for å oppnå de høyeste kvalitetsdata. Selv om gelatin-forankring har vist seg å være kompatibel med massespektrometri-analyse, gjør denne fremgangsmåte å begrense de tilgjengelige matriser på grunn av ko-krystallisering. Når frosset, 3D-cellekulturer er stabile i flere måneder, så lenge de ikke er fryse-tint. Gelatinen blir ugjennomsiktig når frosset, og 3D-cellekulturer er av en lignende farge, så det er tilrådelig før frysing for å dokumentere 3D cellekultur plassering for å hjelpe til med slicing.

Ved fremstilling av objektglass, kan matrisen bli anvendt med en rekke forskjellige metoder, men det bør bemerkes at noen matriser har blitt funnet å co-crystalize med gelatin, som for eksempel ferulsyre, slik at prøven kan brukes. Mindre matrix krystaller produsere mer konsekvent massespektra. Mens handspotting er den enkleste metoden for matrise søknad, kan den større løsemiddel volum resultere i større krystall størrelser og betydelig analyse migrasjon.

På massespektrometer, fremskritt i MALDI-MSI teknologi har redusert den kompetansen som kreves for begynnelsen analyser. Datainnsamling og analyse er grei på de fleste systemer, slik at selv en nybegynner å få informasjon av høy kvalitet fra ITO-belagt lysbilder. Nøye utvalg av de instrumentparametre, optimalisert på nærliggende non-image verdig 3D celle cultures, er avgjørende for å skaffe data av høy kvalitet. For eksempel kan øke laser makt øke peak intensitet, men avtagende laser makt kan forbedre oppløsning og gi mer symmetriske peak former. 3D-cellekulturer bør brukes raskt etter å ha klippet for å sikre optimal prøvekvalitet. Nedbrytning av proteinsignal kan sees på mindre enn en uke uten riktig lagring (dessikator / -80 ° C fryser), særlig i høy masse region (over 20 kDa). På grunn av økende etterspørsel, har mange forskjellige visualisering programmer er utviklet og står fritt til forskning publikum. De fleste bilde massespektrometre har installert nødvendig programvare for å visualisere enkelt massene med de proprietære formatene som brukes på hvert instrument. Disse programmer kan anvendes for å tilveiebringe enkelt-massebilder og eksportere dataene. De fleste programmer vil også tillate overlapping av to eller flere masser av interesse. I tillegg er mange forskjellige seere for MSI data er gratis å laste ned, for eksempel MSiReader end BioMap 32,33 De massespektrometri data innhentet kan også bli behandlet etter oppkjøpet med letthet, og bringer mer nyttig informasjon i forkant..

Fra legemidler til lipider til proteiner, systemet som er beskrevet ovenfor gjør det mulig for rask innsamling av data for å vurdere fordelingen av molekyler av interesse på tvers av en 3D-cellekultur struktur. Seriesnitt kan tas til bilde hele 3D-struktur ved å bygge fra hver 2D-bilde av en bit av 3D cellekultur. Teknikker og notater i protokollen vil være til nytte for forskere som ønsker å begynne tredimensjonale cellekultur som en bro mellom enlagskultur og dyremodeller. Når mestret, kan disse teknikkene anvendes på flere typer av 3D-cellekulturer, vev og cellekulturer, slik at forskere til bilde hvilken prøvene de velger.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCT116 Cell line ATCC ATCC CCL-247 Potential hazard, handle with care
McCoy's 5A media Gibco 16600-108
Fetal Bovine serum HyClone SH30071.03
0.25% Trypsin-EDTA solution Gibco 25200-056
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Phosphate Buffered Saline Gibco 10010049
Gelatin, unflavored Knox Available at most grocery stores in single-packets
ITO-coated glass slides Delta Technologies, Limited CG-90IN-S115
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)  Sigma-Aldrich C8982
Sinapic Acid Sigma-Aldrich 85429
0.3 mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set RoyalMax Airbrush Many options available on sites such as Amazon.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single cell matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging. Anal Chem. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  2. Cornett, D., Frappier, S., Caprioli, R. MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue. Anal Chem. 80 (14), 5648-5653 (2008).
  3. Reyzer, M. L., Hsieh, Y., Ng, K., Korfmacher, W. a, Caprioli, R. M. Direct analysis of drug candidates in tissue by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J Mass Spectrom. 38 (10), 1081-1092 (2003).
  4. Reyzer, M. L., Chaurand, P., Angel, P. M., Caprioli, R. M. Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by MALDI imaging mass spectrometry. Methods Mol Biol. 656 (18), 285-301 (2010).
  5. Cornett, D., Reyzer, M., Chaurand, P., Caprioli, R. MALDI imaging mass spectrometry: molecular snapshots of biochemical systems. Nat Methods. 4 (10), 828-833 (2007).
  6. Guenther, S., et al. Histology by mass spectrometry: label-free tissue characterization obtained from high-accuracy bioanalytical imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (22), 3834-3838 (2010).
  7. Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology. Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).
  8. Kunz-Schughart, L. a, Kreutz, M., Knuechel, R. Multicellular spheroids: a three-dimensional in vitro culture system to study tumour biology. Int J Exp Pathol. 79 (1), 1-23 (1998).
  9. Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. a Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  10. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat Protoc. 4 (3), 309-324 (2009).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
  13. Fernandes, T. G., Kwon, S. -J., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
  14. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human cell culture in drug screening systems. Biomaterials. 33 (35), 9087-9096 (2012).
  15. Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
  16. Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Anal Chem. 83 (22), 8794-8801 (2011).
  17. Liu, X., Weaver, E. M., Hummon, A. B. Evaluation of Therapeutics in Three-Dimensional Cell Culture Systems by MALDI Imaging Mass Spectrometry. Anal Chem. 85 (13), 6295-6302 (2013).
  18. Ahlf, D. R., Masyuko, R. N., Hummon, A. B., Bohn, P. Correlated Mass Spectrometry Imaging and Confocal Raman Microscopy for Studies of Three-Dimensional Cell Culture Sections. Analyst. 139 (18), 4578-4585 (2014).
  19. Derda, R., Tang, S. K. Y., et al. Multizone paper platform for 3D cell cultures. PloS one. 6 (5), 18940 (2011).
  20. Imbeault, S., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. aL. Localizing protein in 3D neural stem cell culture: a hybrid visualization methodology. J Vis Exp. 2 (46), 2-7 (2010).
  21. He, W., Kuang, Y., et al. Proteomic Comparison of 3D and 2D Glioma Models Reveals Increased HLA-E Expression in 3D Models is Associated with Resistance to NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J Proteome Res. 13 (5), 2272-2281 (2014).
  22. Chen, R., Cape, S. S., Sturm, R. M., Li, L. Mass Spectrometric Imaging of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. Methods Mol Biol. 656, 451-463 (2010).
  23. DeKeyser, S. S., Kutz-Naber, K. K., Schmidt, J. J., Barrett-Wilt, G. A., Li, L. Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Decapod Crustacean Neuronal Tissues. J Proteome Res. 6 (5), 1782-1791 (2007).
  24. Van Hove, E. R. A., Smith, D. F., Fornai, L., Glunde, K., Heeren, R. M. An alternative paper based tissue washing method for mass spectrometry imaging: localized washing and fragile tissue analysis. J Am Soc Mass Spectrom. 22 (10), 1885-1890 (2011).
  25. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix Sublimation/Recrystalization for Imaging Proteins by Mass Spectrometry at High Spatial Resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2012).
  26. Seeley, E. H., Oppenheimer, S. R., Mi, D., Chaurand, P., Caprioli, R. M. Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections. J Am Soc Mass Spectrom. 19 (8), 1069-1077 (2008).
  27. Gemperline, E., Li, L. MALDI-mass spectrometric imaging for the investigation of metabolites in Medicago truncatula root nodules. J Vis Exp. 1 (85), 1-11 (2014).
  28. Deutsch, E. mzML: a single, unifying data format for mass spectrometer output). Proteomics. 8 (14), 2776-2777 (2008).
  29. Pedrioli, P. G. a, Eng, J. K., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research. Nat Biotechnol. 22 (11), 1459-1466 (2004).
  30. Lin, S., Zhu, L., Winter, A., Sasinowski, M., Kibbe, W. What is mzXML good for. Expert Rev Proteomics. 2 (6), 839-845 (2005).
  31. Orchard, S., Hoogland, C., Bairoch, A., Eisenacher, M., Kraus, H. -J., Binz, P. -A. Managing the data explosion. A report on the HUPO-PSI Workshop. August 2008, Amsterdam, The Netherlands. Proteomics. 9 (3), 499-501 (2009).
  32. Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. a, Muddiman, D. C. MSiReader: an open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. J Am Soc Mass Spectrom. 24 (5), 718-721 (2013).
  33. Andersson, M., Groseclose, M. R., Deutch, A. Y., Caprioli, R. M. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides 3D volume reconstruction. Nat Methods. 5 (1), 101-108 (2008).

Tags

Bioteknologi 3D cellekultur massespektrometri bildebehandling cellekultur prøveopparbeidelse sfæroidene
Prøvepreparering Strategier for massespektrometri Imaging av 3D-Cell Kultur Modeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahlf Wheatcraft, D. R., Liu, X.,… More

Ahlf Wheatcraft, D. R., Liu, X., Hummon, A. B. Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models. J. Vis. Exp. (94), e52313, doi:10.3791/52313 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter