Udødeligkreftcellelinjer kan dyrkes som 3D cellekulturer, en verdifull modell for biologisk forskning. Denne protokollen beskriver massespektrometri avbildning av 3D cellekulturer, inkludert forbedringer i prøveopparbeidelse plattformen. Målet med denne protokollen er å instruere brukere å forberede 3D cellekulturer for massespektrometri bildeanalyse.
Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.
Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1–4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5–7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8–11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12–14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15–21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.
Ved hjelp av metodene som er skissert ovenfor, kan 3D-cellekulturer dyrkes og analysert med MALDI-MSI. Mange udødeligcellelinjer vil danne 3D-strukturer når de dyrkes på riktig måte. 9,10 Det må utvises forsiktighet for å dyrke celler som ikke har gått for mange ganger, det er, har lav passasje tall. Generelt er celler med passasje antall av ti og lavere er optimale for dyrking av 3D-cellekulturer. Voksende 3D cellekulturer i en tradisjonell agarose støtte gir en kostnadseffektiv måte for forskningsgrupper som er interessert i 3D cellekultur for å prøve dette systemet. Denne metoden benytter få deler som ikke allerede er i de fleste pattedyrcellekultur laboratorier. Nøye oppmerksomhet må betales til utarbeidelsen av agaroseplater for vekst, slik at 3D-cellekulturer er konsekvente i størrelse og form; noen aspekter som krever nøye oppmerksomhet er kontroll av at ingen luftbobler innesluttes i blandingen, og at en riktig menisk dannes på bunnen av hver well. Hvis menisken ikke dannes korrekt, kan cellene vokse i ikke-sfæroide former eller i små klumper. Dessuten må man passe på å ikke plassere PBS inn i gelatin med kulene. Hvis dette skjer, må du fjerne PBS fra toppen av gelatin ved hjelp av en 200 mL pipette. Hvis prisen er ikke en faktor, ultra-lave bindende runde bunnplater er kommersielt tilgjengelige og tilbyr forenkling av disse trinnene. Mens andre vev innebygging metoder kan også være kostbart og ikke-massespektrometri kompatibel har gelatin-innebygging blitt vist å være både billig og allsidig. Forberedelse strategier skissert ovenfor har blitt optimalisert for 3D-cellekulturer for å oppnå de høyeste kvalitetsdata. Selv om gelatin-forankring har vist seg å være kompatibel med massespektrometri-analyse, gjør denne fremgangsmåte å begrense de tilgjengelige matriser på grunn av ko-krystallisering. Når frosset, 3D-cellekulturer er stabile i flere måneder, så lenge de ikke er fryse-tint. Gelatinen blir ugjennomsiktig når frosset, og 3D-cellekulturer er av en lignende farge, så det er tilrådelig før frysing for å dokumentere 3D cellekultur plassering for å hjelpe til med slicing.
Ved fremstilling av objektglass, kan matrisen bli anvendt med en rekke forskjellige metoder, men det bør bemerkes at noen matriser har blitt funnet å co-crystalize med gelatin, som for eksempel ferulsyre, slik at prøven kan brukes. Mindre matrix krystaller produsere mer konsekvent massespektra. Mens handspotting er den enkleste metoden for matrise søknad, kan den større løsemiddel volum resultere i større krystall størrelser og betydelig analyse migrasjon.
På massespektrometer, fremskritt i MALDI-MSI teknologi har redusert den kompetansen som kreves for begynnelsen analyser. Datainnsamling og analyse er grei på de fleste systemer, slik at selv en nybegynner å få informasjon av høy kvalitet fra ITO-belagt lysbilder. Nøye utvalg av de instrumentparametre, optimalisert på nærliggende non-image verdig 3D celle cultures, er avgjørende for å skaffe data av høy kvalitet. For eksempel kan øke laser makt øke peak intensitet, men avtagende laser makt kan forbedre oppløsning og gi mer symmetriske peak former. 3D-cellekulturer bør brukes raskt etter å ha klippet for å sikre optimal prøvekvalitet. Nedbrytning av proteinsignal kan sees på mindre enn en uke uten riktig lagring (dessikator / -80 ° C fryser), særlig i høy masse region (over 20 kDa). På grunn av økende etterspørsel, har mange forskjellige visualisering programmer er utviklet og står fritt til forskning publikum. De fleste bilde massespektrometre har installert nødvendig programvare for å visualisere enkelt massene med de proprietære formatene som brukes på hvert instrument. Disse programmer kan anvendes for å tilveiebringe enkelt-massebilder og eksportere dataene. De fleste programmer vil også tillate overlapping av to eller flere masser av interesse. I tillegg er mange forskjellige seere for MSI data er gratis å laste ned, for eksempel MSiReader end BioMap 32,33 De massespektrometri data innhentet kan også bli behandlet etter oppkjøpet med letthet, og bringer mer nyttig informasjon i forkant..
Fra legemidler til lipider til proteiner, systemet som er beskrevet ovenfor gjør det mulig for rask innsamling av data for å vurdere fordelingen av molekyler av interesse på tvers av en 3D-cellekultur struktur. Seriesnitt kan tas til bilde hele 3D-struktur ved å bygge fra hver 2D-bilde av en bit av 3D cellekultur. Teknikker og notater i protokollen vil være til nytte for forskere som ønsker å begynne tredimensjonale cellekultur som en bro mellom enlagskultur og dyremodeller. Når mestret, kan disse teknikkene anvendes på flere typer av 3D-cellekulturer, vev og cellekulturer, slik at forskere til bilde hvilken prøvene de velger.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
HCT116 Cell line | ATCC | ATCC CCL-247 | Potential hazard, handle with care |
McCoy's 5A media | Gibco | 16600-108 | |
Fetal Bovine serum | HyClone | SH30071.03 | |
0.25% Trypsin-EDTA solution | Gibco | 25200-056 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010049 | |
Gelatin, unflavored | Knox | — | Available at most grocery stores in single-packets |
ITO-coated glass slides | Delta Technologies, Limited | CG-90IN-S115 | |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
Sinapic Acid | Sigma-Aldrich | 85429 | |
0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set | RoyalMax Airbrush | — | Many options available on sites such as Amazon.com |