Immortaliserade cancer cellinjer kan odlas som 3D cellkulturer, en värdefull modell för biologisk forskning. Detta protokoll beskriver masspektrometri avbildning av 3D cellkulturer, inklusive förbättringar i provberedning plattform. Målet med detta protokoll är att instruera användarna att förbereda 3D cellkulturer för masspektrometrianalys avbildning.
Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.
Mass spectrometry imaging (MSI) is a powerful technique to examine the distribution of molecular species across samples of interest. Researchers have imaged biological samples from whole animals down to single cells with this technique.1–4 Using MSI hundreds of analytes may be imaged at a single time, rather than single-substrate techniques requiring the development of additional fluorophores for traditional confocal microscopy, or staining for histology.5–7 Additionally, MSI can be used in either a targeted or a discovery-based fashion, making it an attractive approach to look at the overlap between the distribution of chemical species. Presented within are methods for the growth, preparation, and matrix assisted laser desorption ionization/desorption (MALDI) imaging of small samples (~1 mm in diameter) of three-dimensional multicellular cell cultures.8–11
3D cell cultures are of particular interest to the biological community as an intermediary between traditional monolayer culture and in vivo tumors. As the name implies, 3D cell cultures are heterogeneous cellular aggregates that contain many of the chemical gradients in the microenvironment observed in small avascular tumor nodules, making them a more realistic model system to the native tumor environment than monolayer culture.10 Many human cell lines can be grown as 3D cultures, including cell lines derived from colon, breast, ovary, prostate, kidney and lung tissues.10 There are inherent challenges in imaging three dimensional cell cultures as they are smaller than many samples commonly used for mass spectrometry imaging and therefore require careful sample preparation.7 However, the advantages of these tractable model systems include lower cost and faster growth and analysis time compared to animal models. As a result, studies involving three dimensional cell cultures can be higher throughput than traditional animal studies.12–14
All of these advantages have resulted in increasing popularity for three dimensional cell cultures in biological research; there is a corresponding need to develop new analytical strategies to explore both the composition and spatial distribution of molecules in these systems.12,15–21 The goal of this manuscript is to describe the adaptation of mass spectrometry imaging methods and sample preparation to three dimensional cell cultures.
Använda metoder som beskrivs ovan, kan 3D cellkulturer odlas och analyseras med MALDI-MSI. Många odödliga cellinjer bildar 3D strukturer när de odlas på lämpligt sätt. 9,10 Försiktighet bör vidtas för att odla celler som inte har passerat för många gånger, det vill säga har låga passagenummer. I allmänhet, celler med passagenummer tio och lägre är optimala för växande 3D cellkulturer. Växande 3D cellkulturer i en traditionell agaros stöd ger ett kostnadseffektivt sätt för forskargrupper intresserade av 3D cellodling att prova detta system. Denna metod använder få komponenter inte redan är i de flesta däggdjurscellodlings laboratorier. Noggrann uppmärksamhet måste ägnas utarbetandet av agarosplattor för tillväxt så att 3D-cellkulturer är konsekventa i storlek och form; några aspekter som kräver noggrann uppmärksamhet innefattar kontroll att inga luftbubblor är infångade till blandningen och att en ordentlig menisk bildas på botten av varje well. Om menisken inte utgör korrekt, kan cellerna växer i icke-sfäroida former eller i små klumpar. Dessutom måste man vara försiktig att inte placera PBS i gelatinet med sfäroider. Om detta händer, ta bort PBS från toppen av gelatinet med hjälp av en 200 l pipett. Om kostnaden är inte en faktor, ultralåg bindande runda bottenplattor är kommersiellt tillgängliga och erbjuda förenkling av dessa steg. Medan andra vävnads inbäddningsmetoder kan också vara kostsamma och icke-masspektrometri kompatibel, har gelatin-inbäddning visats vara både billig och mångsidig. Förberedelser strategier som anges ovan har optimerats för 3D cellkulturer för att få de högsta kvalitetsdata. Medan gelatin-inbäddning har visat sig vara kompatibla med masspektrometrianalys, gör denna process begränsa de tillgängliga matriser grund av co-kristallisering. När frysta, 3D cellkulturer är stabila i månader, så länge de inte frys tinas. Gelatinet blir ogenomskinlig när frysta, och 3D-cellenkulturer är en liknande färg, så det är lämpligt före frysning att dokumentera 3D cellodlingsplacering till stöd i skivning.
När man förbereder diabilder kan matris appliceras med flera olika metoder, men det bör noteras att vissa matriser har befunnits samverka kristallisera med gelatinet, såsom ferulsyra, rendering provet oanvändbar. Mindre matriskristaller producera mer konsekvent masspektra. Medan handspotting är den enklaste metoden för matris ansökan, kan den större volymen lösningsmedel resultera i större kristallstorlekar och betydande analyt migration.
Vid masspektrometer, avancerar i MALDI-MSI-teknik har minskat den kompetens som behövs för början analyser. Datainsamling och analys är enkel på de flesta system, vilket gör även en nybörjare att få information av hög kvalitet från ITO-belagda diabilder. Noggrant urval av instrumentparametrar, optimerad på närliggande icke-image värdig 3D cell cultures, är avgörande för att få data av hög kvalitet. Till exempel kan öka lasereffekt ökar toppintensitet men minskande lasereffekt kan förbättra upplösningen och ge mer symmetriska toppformer. 3D cellkulturer bör användas snabbt efter skivning för att säkerställa optimal provkvalitet. Nedbrytning av proteinsignal kan ses i mindre än en vecka utan ordentlig förvaring (exsickator / -80 ° C frys), särskilt i höga mass regionen (över 20 kDa). På grund av den växande efterfrågan, har många olika visualisering program utvecklats och är fria att allmänheten forskningen. De flesta bild Masspektrometrar har installerat programvara som krävs för att visualisera enstaka massor med proprietära format som används på varje instrument. Dessa mjukvaruprogram kan användas för att erhålla enkel-massbilder och exportera data. De flesta program kommer också att möjliggöra överlagring av två eller flera massor av intresse. Dessutom har många olika tittare för MSI uppgifter är fria att ladda ner, såsom MSiReader ettd BioMap. 32,33 masspektrometri data som erhållits får också behandlas efter förvärvet med lätthet, vilket mer användbar information i förgrunden.
Från läkemedel till lipider till proteiner, systemet beskrivs ovan möjliggör snabb insamling av data för att utvärdera fördelningen av molekyler av intresse över en 3D cellodlingsstruktur. Seriella sektioner kan vidtas för att avbilda hela 3D-struktur genom att bygga från varje 2D-bild av en skiva av 3D-cellkulturen. De tekniker och anteckningar i protokollet kommer att vara till nytta för forskare som vill börja tredimensionella cellodling som en bro mellan monolager kultur och djurmodeller. När behärskar, kan dessa tekniker tillämpas på flera typer av 3D cellkulturer, vävnader och cellkulturer, där forskarna till bilden beroende på vilket prov de väljer.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Walther Cancer Foundation under the Advancing Basic Cancer Research program to the Harper Cancer Research Institute of the University of Notre Dame (DARW) and the 2011 Starter Grant from the Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH). Thanks also to the staff of the Mass Spectrometry and Proteomics Facility for useful discussions.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
HCT116 Cell line | ATCC | ATCC CCL-247 | Potential hazard, handle with care |
McCoy's 5A media | Gibco | 16600-108 | |
Fetal Bovine serum | HyClone | SH30071.03 | |
0.25% Trypsin-EDTA solution | Gibco | 25200-056 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010049 | |
Gelatin, unflavored | Knox | — | Available at most grocery stores in single-packets |
ITO-coated glass slides | Delta Technologies, Limited | CG-90IN-S115 | |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
Sinapic Acid | Sigma-Aldrich | 85429 | |
0.3mm Gravity Feed Dual-Action Airbrush Paint Spray Gun Kit Set | RoyalMax Airbrush | — | Many options available on sites such as Amazon.com |