Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.
Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.
Mange nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), og overførbare spongiforme encefalopatier (TSE), er assosiert med aggregering utsatt proteiner og er derfor kollektivt kjent som protein misfolding lidelser (pmds ). TSE eller prionsykdommer utgjør en unik klasse av pmds i at de kan være smittsomme i både mennesker og dyr en. På molekylært nivå, prioner replikere ved å rekruttere og konvertere monomerisk α-helix-rik host-kodet cellular PrP (PrP C) inn i patologisk β-sheet-rik PrP Sc konformasjon 2,3. Selvforplantende protein aggregater er også identifisert i sopp, som deler viktige kjennetegn med pattedyr prioner 4,5. I tillegg pattedyr prioner er i stand til å bevege seg fra celle til celle og infisere naive celler 6,7.
Mens pmds other enn TSE er ikke smittsom, men de deler en felles sykdomsfremkallende prinsipp med prionsykdommer 8,9. Selv om proteiner knyttet til hver av de pmds ikke er relatert i struktur eller funksjon, er de alle danner aggregater via en krystallisering lignende prosess som kalles kjernedannelse eller polymeriseringen; dessuten proteinholdige frø vokse ved å rekruttere sine løselig isoformer 2,10,11. Effektiviteten til selv forplante varierer in vivo, avhengig av de iboende egenskapene til protein som sammen med ekstra cellulære faktorer som molekyl anstand i siste instans bestemmer utbredelsen av aggregatkjernedannelse, såing, fragmentering og sprer 12-15. Derfor må det finnes en fin balanse mellom disse faktorene som gjør det mulig effektiv spredning av protein aggregering. Dette kan også forklare hvorfor bare noen amyloidogene aggregater havn som kjennetegner et prion, og dermed ikke alle pmds er smittsomme. Prioner ser ut til å representere «topp-utøvere 'ofa bredt spekter av selvreproduserende protein aggregater, noe som gjør dem et kraftig verktøy for å studere pmds 8,13.
Forbløffende nok toksisitet assosiert med sykdomsrelaterte aggregater har ofte et ikke celle autonom komponent 16,17. Dette betyr at de påvirker naboceller som ikke uttrykker det tilsvarende gen, i motsetning til et strengt celle autonom virkning, noe som innebærer at bare de celler som uttrykker genet som oppviser den spesifikke fenotype. Dette ble overbevisende demonstrert av vev-spesifikke uttrykk eller slå ned på de respektive proteiner i mange modeller av nevrodegenerative sykdommer 18-26. Forskjellige mekanismer er blitt foreslått som et grunnlag for denne ikke-autonome celletoksisitet i pmds, herunder redusert næringstilførsel, ubalanse i neuronal signalering, glutamat eksitotoksisitet og nevroinflammasjon 16,27,28. I tillegg er en prion-lignende bevegelse av sykdomsbundne aggregater mellom cellene might bidra til dette aspektet 29,30. Økende bevis tyder på at protein andre inneslutninger enn prioner kan overføre fra celle til celle, noe som kan forklare den karakteristiske spredning av patologi observert i mange pmds 30-36. Men det har ennå ikke bestemt hvorvidt det er en klar årsakssammenheng mellom inter bevegelse av sykdomsproteiner og toksisk effekt på nabocellene. Derfor er nødvendig og avgjørende for utvikling av nye terapeutiske midler en bedre forståelse av de cellulære mekanismer som ligger til grunn for celle-til-celle overføring og ikke-autonome celletoksisitet. Imidlertid er mange aspekter av prion-lignende spredning og cellulære faktorer som påvirker celle-til-celle-transmisjon av misfoldede proteiner i metazoans ikke godt forstått, spesielt ved organismenivået.
Den nematode Caenorhabditis elegans har flere fordeler som gir potensial til å oppdage nye fasetter av prion-lignende SPREADIng i metazoans 17. Det er gjennomsiktig, slik at for in vivo sporing av fluorescent merkede proteiner i den levende organisme. Videre er mange cellulære og fysiologiske prosesser som påvirkes av sykdom bevart fra ormer til menneske, og C. elegans er også mottagelig for en rekke genetiske manipulasjoner og molekylære og biokjemiske analyser 37-39. Nøyaktig 959 somatiske celler utgjør voksen hermafroditt med en enkel kropp plan som fortsatt har flere forskjellige typer vev, inkludert muskel, nevroner og tarmen.
Å etablere en ny prion modell i C. elegans, valgte vi å eksogent uttrykke godt karakterisert glutamin / asparagin (Q / N) rik prion domene NM av cytosolisk gjær prionproteinet Sup35, siden det er ingen kjente endogene prionproteiner i ormer 4,40. Gjær prioner har vært uvurderlig i å belyse grunnleggende mekanismer for prion replikering 41-44. Videre er NM furust cytosoliske prion-lignende protein som har vist seg å rekapitulere hele livsløpet til et prion i pattedyrcellekultur 45,46. Likeledes, når det uttrykkes i C. elegans, den Sup35 prion domene vedtatt bemerkelsesverdig godt til de ulike krav til forplantning i metazo celler sammenlignet med gjærceller og utstilt viktige funksjoner i prion biologi 40. NM aggregering var assosiert med en dyp giftig fenotype, herunder avbrudd av mitokondriell integritet og utseende ulike autofagi relatert blemmer på cellenivå, samt embryonale og larve arrest, forsinket utvikling, og en utbredt forstyrrelse av proteinfolding miljø på organismenivå. Påfallende, prion domene viser celle autonome og ikke celle autonom toksisitet, påvirker nabo vev der transgenet ikke ble uttrykt. Videre er vesikulær transport av prion domenet i og mellom cellene overvåkes i sanntid <em> in vivo 40.
Her beskriver vi hvordan vi skal undersøke prion-lignende formidling i C. elegans. Vi vil forklare hvordan å overvåke intra- og inter transport av vesikler som inneholder prion domene som bruker time-lapse fluorescens mikroskopi. Vi vil legge vekt på bruk av vevsspesifikke folding sensorer og allestedsnærværende uttrykt belastnings journalister å evaluere cellestyrte og ikke-celle autonome effekter på celle fitness. Til slutt vil vi beskrive prosedyren av en nylig utført genom bred RNA interferens (RNAi) skjermen for å identifisere nye modifikatorer av prion-indusert toksisitet. I kombinasjon, kan disse metodene bidra til å erte hverandre genetiske trasé involvert i inter bevegelse av proteiner og deres non celle autonome toksisitet.
Metodene som beskrives her for å hjelpe til å illustrere spredning og komplekset celleautonome og ikke-autonome celletoksisitet av prion-lignende proteiner. Vi har nylig oppdaget at en aggregering utsatt cytosoliske prion domene er tatt opp i membranbundne vesikler i en autophagy relatert prosess. En spesifikk undergruppe av disse vesikler transporterer prion domenet i og mellom celler og vev 40. Nøkkelen for å overvåke deres bevegelse i det levende dyr er at proteinet har til å bli merket med mRFP, for…
The authors have nothing to disclose.
We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).
Reagent | |||
Nanosphere size standards 100 nm | ThermoScientific | 3100A | |
Levamisole | Sigma | L-9756 | |
IPTG | Sigma | 15502-10G | |
Ahringer RNAi library | Source BioScience LifeSciences | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/ |
|
Equipment | |||
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC | ThermoScientific | 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60 |
96 pin replicator | Scionomix | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
HiGro high-capacity, incubating shaker | Digilab | http://www.digilabglobal.com/higro | |
Multidrop Combi Reagent Dispenser | Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | |
Biomek FX AP96 Automated Workstation | Beckman Coulter | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
Innova44 shaker | New Brunswick | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389 |
|
M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera | Hamamatsu | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
Spinning Disc AF Confocal Microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
Falcon 4M60 camera | Teledyne Dalsa | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
Software | |||
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html | |
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software | Meyer Instruments | http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm | |
ImageJ | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
wrMTrck plugin for ImageJ | http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html | ||
C. elegans strains | |||
N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
AM815 rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] | Morimoto lab | available from our laboratory | |
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains |