This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
药理学学科采用了分离组织浴系统超过150年。该系统的多功能性使得科学家在世界各地以表征受体和受体信号转导,这方面的知识形成已处理的数以百万计的疾病或病症,例如高血压,心脏衰竭,糖尿病,胃肠道疾病,膀胱的个体的疗法的基础功能障碍,哮喘和吞咽障碍,仅举几例。为了这一天,分离的组织浴保持药物开发和基础研究的一个重要方面,因为它允许所述组织以用作组织。在此朱庇特的课,正式的协议共享演示视觉和虚拟实验,从一个孤立的组织浴实验,测量等长收缩,这使得受体的表征利用数据。
该技术的主要优点在于,所述组织是过着第二功能为一体的组织,用生理结果(收缩或松弛)是相关于身体。它是一种合成的步骤(药物 – 受体相互作用,信号传导,第二信使的产生,改变平滑肌兴奋性,并改变组织功能)。而其它技术允许每个步骤的研究( 例如,放射性配体结合药物的亲和力,第二信使测定)中,分离的组织浴技术允许集成的所有这些步骤1。另一个优点是,保持组织功能允许的重要的药理学变量是在一个组织中的VS的蜂窝环境更有意义的计算;它更接近如何检查药品将在工体作为一个整体。
的等长收缩力作为一种研究工具测量超过150年的历史,但它仍然是收缩组织2原型技术受体表征。该技术的功率是在其简单性和通用性:通过记录通过增加拮抗剂的存在或不存在激动剂的浓度引起的反应,信息无数可导出关于每种药物的药理学特性和受体向其中它结合3-5。这种类型的实验也争取有关的竞争与所使用的拮抗剂的非竞争性的信息,以及受体的异质性和非特异性药物作用6-8。因此,简单的排列组合,以这种孤立的组织浴实验,可以生成介导激动剂诱发肌肉收缩的受体的一个比较完整的药理学特性。
在激动方面,第在给定组织的激动剂电子相对效力(E MAX)和效力(EC 50)可被计算并与其它激动剂在相同组织1的响应。在我们的实验中,将大鼠胸主动脉孵育用载体或α1肾上腺素能受体拮抗剂哌唑嗪(5 nm)的一小时中添加α1肾上腺素能激动剂苯向组织浴并产生收缩之前。 图2给出修改的结果图1的,绿色的响应已被标以最大收缩由聚乙烯取得了明显的最大值,该半最大收缩标记为这样,然后与PE浓度相关联的原因造成的响应。确定这些值是识别实现了半最大(50%)的反应或EC 50值的激动剂的有效浓度。
不幸的是,使用激动剂依赖性参数独自一人来确定受体结合特性可并发9。理想的是,使用受体拮抗剂附加实验允许计算的两个重要参数是关键限定药物与受体之间的相互作用:所述拮抗剂离解常数(pK值B)的-log 10和摩尔拮抗剂的-log 10必要浓度以引发在浓度-反应曲线2倍向右移位(PA 2)10。无论K B&和PA 2增益的一个事实,即他们是兴奋剂无关的值,保持不变,甚至不同组织11之间有用。从图2中的数据,PK B能够使用以下等式来计算,并根据欧共体别处计算50值:
EC 50在没有哌唑嗪= 2×10 -8 M的
EC 50在预哌唑嗪SENCE = 7×10 -6 M
在下面的等式求解在K B:
登录(DR-1)=日志[B] -日志K B&
其中:
[B] =拮抗剂浓度,或5×10 -9 M.登录(5×10 -9 M)= -8.3
DR =的EC 50值拮抗剂/ EC 50的情况下存在剂量率。如果有一个向右移位,则此值将大于1。因此:
DR = 7×10 -6 M / 2×10 -8 M或700×10 -8 M / 2×10 -8 M =二分之七百= 350
代替[B]和DR:
登录(350-1)= -8 -登录K B&
2.54 = -8 -登录KB
的pK B = 10.54
该值哌唑嗪与获得的值一致时,哌唑嗪与α1肾上腺素RECEPT交互或12,13,这表明肾上腺素受体 介导的收缩,以苯为α1肾上腺素能受体。
几个步骤是这些实验的成功是至关重要的。解剖后的组织必须保持在PSS,以防止组织的生存力的丧失。任何肌肉等长制剂,产生最大的力量对被动紧张14,15的最佳长度张力关系。在这个协议中所描述的实验中,最佳的被动张力是得到0.5克被动张力到组织的简要添加增量预先确定的。组织应该开始无音,然后平衡30分钟后,将组织用KCl(80毫米)的最大浓度,其产生的活动音调的挑战。然后,将组织洗涤并允许返回到基线音。 15分钟后,在基线,另一个0.5克被动张力置于与该过程重复,直到一个高原活性张力用另外的被动张力实现。在初步实验中,将4g总被动张力的测定,以达到最大活性的张力产生在主动脉环,因而张力这个总量前平衡放置在环。在程序上,这是最好的零之前的被动张力的应用,但可以在之前的实验中的任何时间进行。过度伸展的组织,在实验或夹层的任一点,将带负组织的生存力和实验的结果产生影响。放置组织在洗澡时,因为此步骤具有过度伸展的最高似然,这是最必要的。充分洗涤,在数量和持续时间,需要为可重现的效果。第二个挑战太快经过最初的挑战,日前组织已经回到基线紧张,会造成异常反应。如果就读可逆拮抗剂/抑制剂,组织不应该事先洗涤以激动剂另外,作为INHIBI器的浓度将降低。
有显着的优点和缺点,以分离的组织浴测定。
缺点:组织可能在钩上手术切除环或安置体验不同程度的损伤。由于内皮细胞是主动脉环的内衬,必须小心在放置在环上的挂钩,以便不破坏该细胞层。组织也可能有时间明显不同的长度,其中它们是可行的,在组织浴,而这必须被确定;不是所有的组织是相同的。沿着这些线路,组织可在全天的反应改变这样的时间控制成为了必要的控制每一个实验。这方面的一个很好的例子就是豚鼠气管,在一个典型的8小时的实验提高了收缩最大100%。药物是难溶于水的可沉淀出来的PSS。最后,一个累计第二药物是一种激动剂,可能会导致不同的结果,如果受体脱敏的激动剂发生的非累积加法;血管紧张素II是一种这样的药物,其示出快速快速耐受。
优点:其中的组织浴实验的主要优点是,它是实时;人们可以看到实验,因为它展现,并且可以迅速地作出结论,并在实验过程中规划后续步骤,以及故障排除。实验需要每天做。多个组织通常可以从一个动物制备,使得动物可以作为其自身的对照,而增加了强度以一个实验。人们也可以隔离所述组织从其他因素,以便测试该组织对药物的相对较纯的响应, 在体外实验中,如组织浴系统还允许使用相比, 在体内实验中少量的药物。
本文所描述的基本实验设计可以广泛修改,以允许更多的参数记录或引入其他外界刺激。例如,另外的电极允许支配神经16,17的电场刺激。通过加入热或pH探针,温度和pH值对收缩反应的影响也可以测量18,19。同样地,氧可以部分或全部用N 2以评估缺氧诱导的作用取代。此外,可以使用等距收缩的测量在此视频中使用的相同的基本原理来开发系统,允许等长张力的发展和变化的伴测量细胞内钙20。信号转导也容易了研究,由于系统存在的响应时能迅速冷冻组织样本,使得一个信号转导途径体系的活性可以生物化学进行验证。
EQU的变化ipment可以用来做,这是巨大的。这整个系统,建造或自动左右手,可以从多个不同的公司购买。在这个协议中使用的组织浴和组织持有人手工吹制(组织浴)和手工建造(持有人)通过一个内部的密歇根州立大学机械车间。
The authors have nothing to disclose.
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
Tissue Bath | Multiple Sources | ||
Physiological Salt Solution | PSS | ||
Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
Micrometer | |||
Custom Stands | |||
Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
S-Connector | VWR International | Talon | |
Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
Tissue Dissection | |||
Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |