Introduction
약리학 분야는 150 년 이상 격리 된 조직 목욕 시스템을 사용하고있다. 이 시스템의 범용성은 고혈압, 심장 부전, 당뇨병, 위장 질환, 방광 질환 또는 장애를 가진 수백만 명의 개인을 치료 한 요법의 기초를 형성하는 이러한 지식으로, 수용체 및 수용체 신호 전달을 특성화하기 위해 전세계 과학자 허용했다 장애, 천식, 연하 장애, 몇 가지 이름. 이 조직은 조직의 기능을 할 수 있습니다로이 날을 위해, 고립 된 조직 목욕, 신약 개발 및 기초 연구의 중요한면을 남아있다. 이 주피터 과정에서는 공식적인 프로토콜은 수용체의 특성을 허용 아이소 메트릭 수축을 측정하는 격리 된 조직 목욕 실험의 데이터를 이용하여 시각 및 가상 실험을 설명하기 위해 공유됩니다.
이 기술의 주요 장점은 조직 생활된다는 것이다몸에 관련된 생리 학적 결과 (수축 또는 이완)와 전체 조직으로 차 기능. 이 단계 (약물 - 수용체 상호 작용, 신호 전달, 두 번째 메신저 세대, 평활근의 흥분의 변화, 조직 기능의 변화)의 합성이다. 다른 기술은 이러한 각 단계의 연구 (예, 방사성 리간드 약물 친 화성, 두 번째 메신저의 측정에 대해 구속력을) 할 수 있지만, 분리 된 조직 조 기술은 이러한 모든 단계를 하나의 통합 할 수 있습니다. 또 다른 장점은 조직의 기능을 유지하는 셀룰러 설정 대 조직에 더 의미가있는 중요한 약물 학적 변수의 계산을 허용한다는 것입니다; 이 조사 된 약물이 전체 몸에서 어떻게 작동하는지에 가까운 온다.
Protocol
참고 :이 문서에 설명 된 모든 절차가 미시간 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설립 지침에 따라 수행된다.
1. 시스템 준비 및 설정
- 50 ㎖ 티슈 화장실까지 사용 조직 조 수축 실험에 필요한 양이 생리 식염수 (PSS) 5 L의 확인; PSS 조리법에 대한 표 2를 참조하십시오. 필요한 조직 세척의 숫자로 곱한 후 조직 화장실의 수 배에 목욕 볼륨을 곱에 의해 필요한 총 부피를 계산합니다.
- PSS을 지침으로 표 2를 사용합니다. 물 약 4 L의 염을 녹여. 참고 : HPLC - 유형 I 물을 권장합니다
- 엔드 솔루션 1.6 mM의 칼슘 그래서,이 용액에 (이수화 염을 사용하는 경우 147g / L) 1 M CaCl2를 솔루션 8 ML을 추가합니다.
- 5 L.에 양자 sufficit PSS 솔루션
- 순환 온수 목욕을 설정하여 37 ° C로 조직 목욕 시스템을 예열한다. 중요한 단계 : 시스템의 각 구성 요소들이 서로 직렬로 연결되어 있는지 확인, 물 재킷이다. 흐름의 방향은 중요하다 - 가장 높은 가시 연결에 가장 낮은 가시 연결에서 밖으로 각 구성 요소에 물 흐름을 보장합니다.
- 데이터 수집 시스템을 켭니다. 실험 전에 힘 트랜스 듀서 적어도 15 분에 전원 온도를 평형합니다.
주 : 대부분의 힘 센서가 온도 변화에 민감하고 전원이인가 된 후 처음 열 드리프트를 전시 스트레인 게이지를 사용합니다. - 실행 데이터 수집 소프트웨어 및 데이터 수집 시스템과의 연결을 보장한다. 데이터 기록을 가능하게하는 제조 지침을 따르십시오.
- 힘 센서가 조직이 조직 조 및 데이터 기록이 시작되기 전에 배치되기 전에 교정해야합니다; FO교정 llow 제조사의 지시.
- 95 %, O2 / 5 % CO 2 의료용 가스 실린더에 조직 목욕 시스템을 연결하고 가스 누출을 점검 한 다음 시스템을 가압.
- PSS와 조직 조 저수지 채우고 용액 시간은 최적 온도에 도달 할 수있다. 프라임 시스템 및이 시스템 및 튜브 내의 기포를 제거한다.
- PSS 버퍼에 산소와 실험 기간 동안 조직 조에서 소개 될 예정 약물을 배포하는 브라운 운동을 제공 일관된 솔루션 폭기를 보장하기 위해 조직 목욕 폭기 장치를 확인합니다. 확인 폭기 / 거품 데이터 레코딩을 중단 할 조직의 움직임을 유발하지 않는다; 필요에 따라 가스 흐름을 감소시킨다.
참고 : 조직 목욕 및 데이터 수집 시스템은 이제 실험을 시작할 수 있습니다.
2. 조직 준비
- 이상적으로, 동물에서 조직을 해부 직전에 사용하고 내가 직접 배치NTO PSS.
참고 : 일부 조직은 4 ° C에서 하룻밤 PSS에 저장 될 수 있지만, 적절한 컨트롤을 장기간 보관 후 조직의 기능을 검증하기 위해 수행해야합니다; 6 절을 참조하십시오. - 이 운동의 조직으로 흉부 대동맥을 사용합니다.
- 제도적 지침에 따라 쥐를 마취 아래로 쥐의 등쪽을 배치합니다. 발가락 핀치이 고통스러운 자극에 대한 반사 반응의 손실을 통해 마취를 확인합니다.
참고 :이 프로토콜은 복강 내 주사를 통해 전달 펜 토바 비탈의 70 ㎎ / ㎏을 사용합니다. 쥐 마취에 대한 제도적 지침과 다를 수 있습니다. - 흉곽의 하단에있는 진동판을 따라 가위로 절개를 작성하여 기흉을 만듭니다. 그런 다음, 흉골에 흉곽의 바닥에서 절개를 계속 양분.
- 멀리 해부 또는 척추의 상단에있는 그 장기를 따로 배치하고 척추를 따라 직접 거짓말 대동맥을 찾습니다.
참고 :이 STEP는 대동맥을 해부 할 수있는 충분한 작업 공간을 제공합니다. - 대동맥에 대한 모든 연결을 끊다; 및 식도, 폐, 등에서 진동판의 수준에서 척추에 수직 대동맥을 잘랐다.
- 부드럽게 집게로 대동맥을 잡고 척추에서 대동맥을 해부 가위를 사용합니다. 심장을 향해 척추와 작업에 인접한 낮은 조리개 영역에서 해부를 시작합니다. 조직에 손상을 줄 수 있습니다 대동맥 조직에 추가 당기지하기 위해 예방 조치 또는 예인선을해야합니다.
- 즉시 PSS를 포함하는 준비된 해부 접시에 대동맥을 배치합니다.
참고 : 반지에 대동맥의 해부 가장 검은 실라 스틱 기반을 가지고 해부 접시에 이루어집니다. 이는 해부 접시에 안정성을 제공하면서, 대동맥 cannulate하고 접시에 체결 될 수있다 와이어의 사용을 허용한다. 검은 배경 해부 에이즈 대비를 제공합니다. 케어는 내피로 cannulating 와이어의 사용에주의가 필요합니다원점이라 세포층 용기의 와이어 루멘에 대해 과량의 마찰에 의해 제거 될 수있다. - 와이어를 타고 한 쪽 끝에 작은 90 ° 각도를하고 가이드 와이어를 고정하기 위해 실라 스틱 기반에 각진 끝을 밀어 넣습니다. 해부 접시에 전체 대동맥를 놓습니다.
- 집게와 가이드 와이어의 끝을 잡고 부드럽게 대동맥의 루멘에 와이어를 스레드.
- 집게를 사용하고 와이어에 대동맥을 밀어 넣습니다. 가이드 와이어의 자유 단부는 볼 곡선 부드럽게 와이어이며 조직을 안정화시키기 위해 접시의 실라 스틱 파운데이션에 자유 단을 배치하는 경우.
- 흉부 대동맥은 흰색과 다소 섬유 나타날 때까지 작은 vannas 가위와 집게를 사용하는 등 혈관 주위 지방 조직과 다른 모든 관계없는 조직, 혈전을 제거합니다.
- 와이어에서 청소 대동맥을 제거하고 폭 약 3-5mm이다 반지의 대동맥을 잘라 가위를 사용합니다.
- TI의 쌍 중 하나에 대동맥 고리를 배치후크를 잡고 부드럽게 후크 위에 반지를 슬라이드 집게를 사용하여 ssue 후크. 두 번째 훅이 과정을 반복합니다. 복잡하게 얽힌하지 않는 후크를 보장하기 위해주의; 그림 3 참조.
- 각 후크가 부착 된 다른 실크 봉합사를 가지고 있는지 확인하십시오. 다른 손으로 묶여 힘 변환기에있을 것입니다 10-4cm 긴 조각 봉합 동안 하나의 후크, 유리 또는 스테인리스 스틸 막대에 부착을 허용 실크의 작은 매듭 루프를 가지고 있는지 확인; 그림 3 참조.
주 : 대동맥가 후크 고정되면, 조직은 조직 조 내에 장착 될 준비; 그림 3 참조. - 반복하여 두 번째 조직 목욕 실에서 제 대동맥 고리를 탑재, 2.14-2.15 단계를 반복합니다.
목욕 3. 조직 배치
- 이 시스템에서, 조직 화장실 자체가 고정되어 있습니다. 이 때, 그리고 온도에 와서 솔루션을 따뜻하게, 폭기 PSS와 조직 화장실을 채우기 허용전자.
- 실크 봉합사로, 스테인리스 스틸 막대에 말뚝에 조직 준비의 고리 중 하나를 묶어. 조직 목욕 챔버로이 끝을 놓습니다. 링 스탠드에로드를 연결하고 버퍼에 몰입 조직을 유지하기 위해 PSS 가득 염색 접시에 다른 쪽 끝을 배치; 그림 3 참조.
- 조직 목욕 챔버에서로드와 조직을 배치하고 조직이 완전히 PSS에 침지하고로드가 안전해야합니다; 그림 3 참조.
- 힘 변환기에 다른 봉합을 묶어 조직과 힘 센서 사이의 봉합에 느슨하게해야합니다.
참고 :이 느슨 마이크로 미터를 조정하여 제거됩니다; 그림 3 참조.
- 두 번째 대동맥 링과 조직 조 챔버에 대해 이러한 단계를 반복합니다.
4. 수동 장력 설정
주 : 각 조직은 평활근 세포가 OPTIMA 응답하는 길이 (LO)가에서야. 예비 실험은 각각의 조직 유형에 대해 수행되어야이 길이 검사 할 달성 최적 연신 장력을 결정한다. 쥐 흉부 대동맥 4g의 최적의 수동적 스트레칭 긴장이있다.
- 2g에 장력을 증가시키고 고원 도달하는 조직 기다릴 마이크로 미터 / 랙과 피니언을 사용한다. 고원에 도달하면, 긴장 또 다른 2g을 높이고 고원에 조직을 기다립니다.
참고 : 2g의 초기 장력이 설정 고원에 도달 한 후 대동맥 고리에서, 조직은 다음 ~ 1.6 g에 휴식을 취한다. 2g의 두 번째 응용 프로그램은 ~에 조직이 다시 긴장하고 긴장이 감소되는 3.6 g을, 조직을 가져올 것입니다. 따라서, 총 장력 4g을 첨가 한 후, 소프트웨어는 장력의 약 3.2 g을 나타내야한다. - 두 번째 대동맥 링과 조직 조 챔버에 대해 이러한 단계를 반복합니다.
5. 평형의 약국 만들기
- 의 조직을 평형조직에 수동적 긴장을 적용한 후 60 분.
- 평형 단계에서 조직마다 15 ~ 20 분을 씻는다. 조직 목욕을 배출하고 따뜻하게 저수지에서 PSS와 PSS를 교체합니다.
주 :이 시간 동안, 조직을 수동 장력의 손실에 의해 지시되는, 긴장한다. - 이 시간 동안, 그래서 약물 콘텐츠의 단지 소량이 원하는 농도를 달성하기 위해 필요한, 욕중의 실제 농도보다 적어도 1000 배 더 집중 될 필요가 실험 약물을 준비한다.
6. 초기 도전
- 평형 기간의 끝에서, 조직을 한 번 씻어 최종 데이터를 저장하고, 모든 입력을 다시 제로.
- 조직이 응답되는 (활성 수축의 원인이됩니다 화합물) 작용제를 선택합니다.
주 : 래트 흉부 대동맥, 동맥 평활근 적극적 기인의 신경 분포에 알파 아드레날린 수용체 작용 물질로 수축한다교감 신경계에 의해 조직. 아드레날린 작용제 아드레날린 작용제 휴식의 원인이 주어진 장 조직에서 유용하지 않을 것입니다. 이 경우, 아세틸 콜린 (콜린성 수용체)와 같은 수용체 작용제이 사용될 수있다. 페닐에 아세틸 콜린 양에 대한 대안은 상기 제 1 도전 높은 칼륨 (K) 등의 비 - 수용체 작용제를 사용하는 것이다. 평활근에서 높은 K 간접적으로 열린 칼슘 채널을 운영하고 있으며, 따라서 평활근의 무결성의 일반적인 지표로 볼 수 있습니다.- 조직 조 10 -5 M 페닐에 추가하여 첫 번째 과제 또는 웨이크 업 과제를 수행합니다. 50 ml의 조직 조에서이 농도를 달성 10-2 M 페닐에 솔루션의 50 μl를 추가합니다.
주 : PSS 50 ㎖에 50 μl의 최종 농도는 스톡보다 1000 배 더 적은 정도로, 1 / 1000 희석, 또는 10-5 M. 조직 목욕 C 내에서 볼륨과 볼륨의 일관성 유지 보수 기술hamber 최종 약물 농도를 결정하는 단계에 중요하다.
- 조직 조 10 -5 M 페닐에 추가하여 첫 번째 과제 또는 웨이크 업 과제를 수행합니다. 50 ml의 조직 조에서이 농도를 달성 10-2 M 페닐에 솔루션의 50 μl를 추가합니다.
- 데이터의 기울기가 제로가되면 조직 조에 10-5 M 페닐에 추가하고 다음 피크 고원 수축을 허용한다. 사후 실험 분석을 돕기 위해 각 실험 이벤트를 기록해야합니다.
- 고원 후 비우고 새로운 PSS와 조직 목욕 챔버를 보충에 의해 철저하게 작용 물질을 세척 할 것. 뿐만 아니라 이러한 이벤트를 기록해야합니다.
참고 : 엄지 손가락의 규칙은 목욕 작용제의 농도가 각각 세척으로 10 배 감소한다는 것입니다. 이상 3-4 세척이 필요할 수 있지만 아래로 다시 평형 기준 톤 (긴장)에 조직을 가지고있다. - 진행하기 전에 ~ 10 분 동안 기준 톤에서 조직의 나머지 부분을 보자.
7. 실험
주 : 프라 조신, 알파 아드레날린 수용체 길항제는 농도 RESP를 시프트 조직 조 챔버에 도입 될온세 곡선 페닐에 (PE)에; 이것은 명백한 적대입니다.
- 한 목욕 차량을 추가 (H 2 O)하는 프라 조신이 용해시켰다. 다른, 프라 조신의 적절한 농도를 추가합니다. 이 경우, 5 × 10-9 M 또는 욕실에서 5 nM의 농도를 달성하기 위해 다른 하나의 욕 차량의 25 μL 프라 조신과의 10 -5 M 농도의 25 μL를 추가한다.
주의 : 차량의 첨가 본 실시 예에서는 불필요 해 보이지만 혈관 작용 될 전위 (예를 들면, DMSO, 에탄올, 아세트산)가 다른 차량을 사용할 때, 그렇게하는 것이 필수적이다. 이 혈관에 작용하는 수에 대한 증거가있는 경우에도 해당 차량을 추가합니다. - 화장실에서 차량 / 프라 조신을두고 1 시간 동안 조직을 씻어하지 않습니다.
- 조직을 균등화하는 동안, 작용제 (PE)의 여러 농도를 준비합니다. 예를 들어, <더 반응을 유도하지 농도 (농도에서 광범위한 포함/ 최대 응답 (능가 농도 EM> 10 -9 M PE) 예를 들어, 10 -4 M PE). 농도 - 반응 곡선은 10 -1 M 주식 솔루션에서 PE의 여섯 별도의 원액 (10-6 -10 -1 M) 연속 희석을 통해을, 자연 로그 때문에. 각각의 농도에 필요한 볼륨이 모든 화장실 (예> 300 μL)에 필요한 트리플 전체 부피보다 약간 더 있는지 확인합니다.
- 표 1에 기재된 바와 같이 작용제를 추가로 계속.
참고 :이 실험은 PE하는 누적 농도 반응 곡선을 생성합니다; 각각의 반복은 계정에 이미 목욕에 추가 물질의 양을합니다. 더 이상 수축을하지 않을 때까지 추가 증가가 발생하거나, 전체 곡선은 plateaued있다.- 티슈 (threshold)에 도달 될 때까지 개별적으로 약물 농도를 추가한다.
- 아무런 변화가 발생하지 않으면, 다음의 농도를 추가시리즈; 표 2를 참조하십시오.
참고 : 이러한 추가의 타이밍이 사용 작용제에 따라 달라집니다. 예를 들어, 노르 에피네프린과 페닐에 수축이 빠르게 개발하고 분 이내에 고원해야합니다. 이와는 대조적으로, 엔도 텔린 1 수축은 천천히 개발하고 가까운 45 분 동안 고원하지 않을 수 있습니다. 다른 실험만큼, 이와 같은 곡선의 형성 후에 조직에서 수행 될 수있다 (1) 밖으로 세척 물질; 및 (2)는 정상적인 조직 수축성 동작으로 복귀하고 이전 자극의 영향을받지 않는 것으로 입증 될 수있다.
8. 데이터 분석
- 이전과 개입 직후에 데이터를 저장해야합니다 (예를 들어, 웨이크 업 또는 전체 곡선).
- 찾기 및 데이터 분석에 도움이 각 조직 조 챔버 / 입력 채널에 대한 조직의 기준을 설정합니다.
- 기준이 설정되면, 각각의 농도에 대한 최대 응답을 발견하고, 찬 기록기준선에서 GE. 순차적으로 농도의 각을 통해 이동하고 기준선 이동을 기록합니다.
- 결과 데이터를 그래프입니다. 어떤 그래프 프로그램에서이 작업을 수행합니다.
참고 : 그래프 패드 프리즘이 약리학을 위해 설계, 이것은 여기에 제시된 실험의 종류에 이상적입니다.
Representative Results
효능 작용의 관점에서, 소정의 조직의 상대적인 작용제 효능 (E MAX) 및 효능 (EC 50)는 계산과 같은 조직 한 다른 작용제의 반응과 비교 될 수있다. 우리의 실험에서는, 래트 흉부 대동맥 비히클 또는 종래 (도 1)을 조직 조에 α 1 아드레날린 작용제 페닐에 추가 및 수축을 발생시키는 1 시간 동안 α 1 아드레날린 수용체 길항제 프라 조신 (5 ㎚) 중 하나와 함께 배양 하였다.
그림 2 선물는도 1의 결과를 수정했습니다. 녹색 응답은 PE에 의해 달성의 최대 수축 반응하는 것이 원인이 최대, ½ 최대 수축 등으로 표시 한 후 PE 농도와 연관로 표시 표시했다. 이러한 값을 식별하는 것은 반 최대 (50 %) 반응을 달성하거나 EC 작용제의 유효 농도를 식별하는 것이다
생성하고 이러한 결과를 해석에서, 농도 - 반응 곡선을 작성하는 작용제 낮고 높은 농도를 사용하는 것이 중요하다. 충분히 안정된 점 기준과 최대 고원을 표시하지 않고, EC (50) 및 E MAX는 추정 될 수있다. 이이 예에서는 그래픽으로 이루어졌다. S 자형 곡선 로지스틱 함수를 사용하는 컴퓨터 소프트웨어는 EC (50)의 커브 피팅 값과 계산에 사용될 수있다.
그림 1 :. 조직 목욕 회로도 만화 이중 벽에 배치 조직의 고리를 나타내는, 물 재킷 조직 바일. 버퍼 유출입은 챔버의베이스에 통합 된 3 방향 스톱 콕 유리에 의해 조절된다. O 2 / CO 2 PSS 또는 가스의 누설을 방지하는 개스킷에 의해 밀봉된다 폭기 통해 버블 링시켰다. 재순환 입력 적절한 재순환을 유지하고 온도를 야기 disregulation 공기 주머니의 형성을 방지하기 위해 출력 이하이다.
그림 2 :. 쥐 흉부 대동맥 + 내피 세포는 위의 그림은 네 개의 개별 실험 (다른 동물과 다른 색상으로 표시되는 다른 세트 업에 다른 연구자들에 의해 수행) PE에 의한 수축을 이동하는 프라 조신의 능력을 테스트를 보여줍니다. 프라 조신 (5 nM의)은 명확 병렬 방식으로 PE - 유도 수축 곡선을 우측으로 이동했다.
그림 3 : 쥐 흉부 대동맥 + 내피 세포 그래픽 부재 (차량)에 PE에 대한 EC 50 값의 추정 및 길항제의 존재 (프라 조신).. 그린 라인 (그룹 C는) 만 표시됩니다.
| 소금 | MW (g / 몰) | 5 리터 | FINAL mM의 |
| (g) | |||
| 염화나트륨 | 58.45 | 37.99 | (130) |
| 의 KCl | 74.56 | 1.75 | 4.7 |
| KH2PO4 | 136.1 | 0.8 | 1.18 |
| 황산• 7H20 | 246.5 | 1.45 | 1.17 |
| NaHCO3를 | 8421 | 6.25 | 14.9 |
| 우선 당 | 180.16 | (5) | 5.5 |
| EDTA | (380) | 0.05 | 0.03 |
표 1 : 정상 생리 소금 솔루션 (PSS) 조리법이 실험에 사용 된 중탄산염 버퍼 PSS의 내용.. 모든 염의 분자량 원하는 농도를 달성하기 dH보다 2 O 5 L에 첨가 량이 포함된다.
| 목욕 농도 | 작용제를 첨가 조로 이루어 |
| 1 × 10-9 M | 50 ml의 1 × 10 -6 M |
| 3 × 10-9 M | 100 ㎖의 1 × 10-6 M |
| 1 × 10-8 M | 35 ml의 1 × 10 -5 M |
| 3 × 10 -8 M | 100 ㎖의 1 × 10-5 |
| 1 × 10-7 M | 35 ml의 1 × 10 -4 M |
| 3 × 10 -7 M | 100 ㎖를 1 × 10 -4 M |
| 1 × 10 -6 M | 35 ml의 1 × 10 -3 M |
| 3 × 10 -6 M | 100 ㎖의 1 × 10-3 M |
| 1 × 10 -5 M | 35 ml의 1 × 10-2 M |
| 3 × 10-5 M | 100 ml의 1 × 10-2 M |
| 1 × 10 -4 M | 35 ml의 1 × -1 M |
표 2 :. 목욕 티슈 첨가제 작용제 농도 작용제의 양은 프로 각 욕에 첨가 될perly 누적 농도 - 반응 곡선을 구축. 원하는 욕 농도는 작용제의 농도를 증가시키는 양의 순차 첨가를 통해 달성된다. 각 추가 계정에 목욕에 이미 존재하는 작용제의 농도를합니다. 이 작용제의 단일 농도 증가량을 사용하여 발생 될 조직 조에서의 부피 증가를 최소화하기 위해 행해진 다.
Discussion
연구 도구로 아이소 메트릭 힘의 측정은 150 세 이상이지만, 수축 조직 2 수용체의 특성에 대한 프로토 타입 기술되고 있습니다. 이 기술의 힘은 단순함과 다양성에있다 : 길항제의 존재 또는 부재 하에서 작용 물질의 농도를 증가시킴으로써 유도 반응을 기록함으로써, 정보의 무수한 각 약물의 약리학 적 특성 및 수용체에 대해 유도 될 수있는 그것은 3-5을 결합한다. 이러한 유형의 실험이 또한 사용될 길항제 비경쟁 자연 대 경쟁에 대한 정보뿐만 아니라, 수용체 얼룩이 비특이적 약효 6-8 가너. 따라서,이 절연 조직 조 간단한 실험으로 치환 작용제 - 유도 된 근육 수축을 매개하는 수용체의 약리학 비교적 완전한 프로파일을 생성 할 수있다.
효능 작용의 측면에서, 제해당 조직에서 작용제의 전자 상대 효능 (E MAX)과 힘 (EC 50) 같은 조직 한 다른 작용제의 응답에 비해 계산 될 수있다. 우리의 실험에서는, 래트 흉부 대동맥 비히클 또는 종래 수축을 조직 조에 α 1 아드레날린 작용제 페닐에 첨가하고 생성 한 시간 동안 α 1 아드레날린 수용체 길항제 프라 조신 (5 ㎚) 중 하나와 함께 배양 하였다. 수정 된 결과를 두 선물 도표 녹색 응답이 최대로 표시 PE에 의해 달성의 최대 수축으로 표시 한 그림 1의., ½ 최대 수축하게 표시하고 응답하는 것이 원인이 된 PE 농도와 관련. 이러한 값을 식별하는 것은 반 최대 (50 %) 반응 또는 EC (50) 값을 달성 작용제의 유효 농도를 식별한다.
불행하게도, 작용제에 의존하는 매개 변수를 사용하여수용체 결합 특성이 9 복잡 할 수 있습니다 결정하기 위해 혼자에요. 상수 길항제 해리 PK (B)의 -log 10 몰 길항제 -log 10 : 이상적으로, 수용체 길항제를 사용하여 추가 실험은 약물과 수용체 사이의 상호 작용을 정의하는 중요한 두 가지 중요한 파라미터들의 계산을 허용 필요한 농도의 농도 - 반응 곡선에서 두 배의 우측 시프트 (PA (2)) (10)을 유도한다. K 및 PA B 2 이득들이 작용제 독립적 값이며, 심지어 다른 조직 (11) 사이에 일정하게 유지된다는 사실로부터 유용성 양쪽 모두. 다른 계산 된 값 (50)을도 2의 데이터로부터 약동학 B는 다음 방정식을 이용하여 계산 될 수 있고, EC에 기초 :
= 2 × 10-8 M 프라 조신의 부재하에 50 EC
사전에 EC (50)프라 조신의가 나타나지 않는 = 7 × 10 -6 M
다음의 수학 식 B에 K를 풀 :
로그인 (DR-1) = [B] 로그 - K B 로그
장소 :
[B]는 길항제 농도 = 5 X 10-9 M. 로그인 (5 × 10-9 M) = -8.3
박사 = 없을 길항제 / EC (50)의 존재 EC 50 값의 용량 비율. 우측 시프트가있는 경우,이 값은 1보다 클 것이다. 따라서 :
박사 = 7 × 10 -6 M / 2 × 10 -8 M 700 × 10 -8 M / 2 × 10 -8 M = 2분의 700 = 350
[B]와 박사를 대체 :
K B를 기록 - = -8 (350-1)를 기록
2.54 = -8 - KB 로그
의 pKa B = 10.54
프라 조신은 α 1 아드레날린 RECEPT와 상호 작용할 때 프라 조신이 값은 얻은 값과 일치페닐에 프린에 수축을 매개 아드레날린 수용체 α 1 아드레날린 수용체임을 제안 또는 12,13.
몇 가지 단계는이 실험의 성공에 매우 중요합니다. 조직은 조직의 생존력 상실을 방지하기 위해 박리 후 남아 있어야 PSS. 모든 아이소 메트릭 근육 준비 수동 장력 (14, 15)에 대해 최대한의 힘을 생성하는 최적의 길이 긴장 관계를 가지고있다. 이 프로토콜에서 설명하는 실험에서, 최적의 수동 장력 티슈는 이전에 수동 장력 0.5 g의 잠깐 씩 첨가하여 결정 하였다. 조직 톤없이 시작해야하고 평형의 30 분 후, 조직 활성 톤 생성의 KCl (80 mM)을 최대의 농도로 도전되었다. 이어서, 조직을 세척하고, 기준 계조로 복귀시켰다. 기준선에서 15 분 후, 수동 장력의 또 다른 0.5 g을 넣고,이 프로세스의 고원까지 반복활성 장력을 추가 수동 긴장을 달성했다. 예비 실험에서, 수동 장력 4g 총량 대동맥에서 최대 활성 장력 발생을 달성하도록 결정하고, 따라서 장력의 총량이 이전에 평형화 고리 상에 배치된다. 절차 적으로, 이는 종래 수동 장력 애플리케이션을 제로로 최선이지만, 실험 전에 언제든 수행 될 수있다. 실험 또는 해부 어느 시점에서, 조직을 스트레칭 오버, 부정적인 조직의 생존과 실험 결과에 영향을 미칠 것입니다. 이 단계는 과량 신축성 높은 가능성을 갖는 한, 조직 욕에 배치 할 때 가장 필수적이다. 수와 기간에 적절한 세정, 재현 효과를 위해 필요합니다. 두 번째 문제는 너무 빨리 조직이 기준 긴장 돌아왔다 초기 접종 후, 또는 그 이전에, 비정상적인 반응 발생합니다. 가역 길항제 / 저해제를 공부하는 경우, 조직은 inhibi로, 추가 작용제하기 전에 세척하지 마십시오토르 농도는 감소 될 것이다.
분리 된 조직 목욕 분석에 주목할만한 장점과 단점이 있습니다.
단점 : 조직은 후크 고리의 제거 수술 또는 배치하는 동안 손상의 다른 정도가 발생할 수 있습니다. 내피 세포의 환상 대동맥의 내벽이 때문에 전지 층을 손상시키지 않도록주의가 후크 고리의 위치에주의해야한다. 조직들은 또한 조직 조에서 생존하는 시간의 뚜렷하게 상이한 길이를 가질 수 있고,이 결정되어야한다; 모든 조직은 동일하다. 이와 더불어, 조직은 시간이 컨트롤은 모든 실험 필요한 제어가되도록 하루 종일 자신의 응답에서 변경 될 수 있습니다. 이것의 좋은 예는 전형적인 8 시간의 실험 기간 동안 100 %에 의해 수축력 최대로 향상 기니피그 기관이다. 물에 난 용성이다 마약 PSS에 침전 수 있습니다. 마지막으로, 누적차 효능에 대한 수용체의 탈감작이 발생하는 경우 작용제는 다른 결과를 초래할 수있는 약물의 비 누적 추가; 안지오텐신 II는 빠른 과내를 보여줍니다 하나의 약물이다.
장점 : 조직 조 실험의 주요 이점 중 하나는 실시간이라는 것이다; 그것은 전개하고 신속하게 결론을 확인하고 실험 기간 동안 다음 단계뿐만 아니라 문제 해결을 계획 할 수 있습니다으로 한 실험을 볼 수 있습니다. 실험은 할 수있는 일이 걸립니다. 여러 조직은 통상적 동물 자체 조절 역할을 할 수 있도록 하나의 동물에서 제조 될 수 있으며, 그 강도를 실험에 추가한다. 약물 조직의 비교적 순수한 응답을 테스트하도록 하나는 다른 요소로부터 조직을 분리 할 수있다. 그러한 조직 조 시스템과 같은 시험 관내 실험은 생체 내 실험과 비교하여 약물의 적은 양의 사용을 허용한다.
본원에 기재된 염기성 실험 설계가 될 수광범위하게 추가 매개 변수의 기록 또는 다른 외부 자극의 도입을 허용하도록 수정했습니다. 예를 들어, 전극의 첨가는 근에 분포하는 신경 16,17의 전기장 자극 허용한다. 열이나 산도 프로브의 추가로, 수축 온도에 응답하여 pH의 영향도 18,19를 측정 할 수있다. 이와 유사하게, 산소는 부분적으로 또는 저산소증 유도 효과를 평가하기 위해 N이 전체에서 대체 할 수 있습니다. 또한,이 비디오에 사용 된 아이소 수축력 측정의 기본 원칙은 동일한 세포 내 칼슘 20 등척성 장력 개발 및 변경을 허용 수반 측정 시스템을 개발하는데 사용될 수있다. 그 시스템은 빠르게 반응 동안 조직 샘플을 고정 할 수있는 신호 변환 이후도 용이하게 검토되고, 신호 전달 경로 시스템의 생화학 적 활성을 검증 할 수 있도록.
EQU의 변화이 작업을 수행하는 데 사용할 수 있습니다 ipment은 거대하다. 이 모든 시스템 구성 또는 자동 양손은 여러 다른 회사에서 구입하실 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 조직 화장실 조직 홀더는 사내 미시간 주립 대학 기계 상점에 의해 손으로 날려 (조직 화장실)과 손 건설 (홀더)이었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
| PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
| QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
| Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
| Grass Force-displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
| Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
| BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
| IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
| Tissue Bath | Multiple Sources | ||
| Physiological Salt Solution | PSS | ||
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
| Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
| 50 ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| 250 ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
| Micrometer | |||
| Custom Stands | |||
| Three-prong Clamps | VWR International | Talon | |
| S-connector | VWR International | Talon | |
| Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
| Tissue Dissection | |||
| Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
| Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |
References
- Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
- Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
- Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
- Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
- Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
- Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
- Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
- Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
- Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).
- Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
- Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).
- Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
- Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
- Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
- Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
- Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
- Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
- Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
- Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
- Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).
