This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
Disciplinen i farmakologi har brugt den isolerede vævsbad system for over 150 år. Alsidigheden af dette system har givet forskere over hele verden til at karakterisere receptorer og receptor signaltransduktion med denne viden danner grundlag for terapier, der har behandlet millioner af mennesker med sygdomme eller lidelser, såsom hypertension, hjertesvigt, diabetes, gastrointestinal sygdom, blære dysfunktion, astma, og synkebesvær, for blot at nævne nogle få. Til denne dag, den isolerede vævsbad fortsat en vigtig facet af lægemiddeludvikling og grundforskning, da det giver det væv, der fungerer som et væv. I denne JOVE lektion er en formel protokol delt at vise en visuel og virtuel eksperiment udnytte data fra en isoleret vævsbad eksperiment, der måler isometrisk kontraktion, som tillader receptor karakterisering.
Den primære fordel ved denne teknik er, at vævet lever etnd fungerer som en helhed væv, med en fysiologisk resultat (sammentrækning eller afslapning), der er relevant for kroppen. Det er en syntese af trin (lægemiddel-receptor-interaktion, signaltransduktion, anden messenger generation, ændring i glat muskulatur uro, og ændring i vævsfunktion). Mens andre teknikker tillader undersøgelse af hver af disse trin (f.eks radioligandbinding for lægemiddel affinitet, måling af second messengers), den isolerede vævsbad teknik tillader integration af alle disse 1 trin. En anden fordel er, at fastholde vævsfunktion tillader beregning af vigtige farmakologiske variabler, der er mere meningsfuld i et væv vs et cellulært indstilling; det kommer tættere på, hvordan de undersøgte lægemidler ville arbejde i kroppen som helhed.
Måling af isometrisk kraft som værktøj for forskningen er over 150 år gammel, men det er fortsat den prototypiske teknik til receptor karakterisering i kontraktile væv 2. Effekten af denne teknik er i sin enkelhed og alsidighed: ved at optage reaktioner fremkaldt af stigende koncentrationer af en agonist i nærvær eller fravær af en antagonist, kan et utal af information udledes om de farmakologiske egenskaber af hvert lægemiddel og receptoren, som det binder 3-5. Forsøg af denne type også samle oplysninger om konkurrencesituationen versus ikke-konkurrerende karakter antagonister anvendes, samt receptor heterogenitet og uspecifikke lægemiddelvirkninger 6-8. Således, med enkle permutationer til dette isolerede vævsbad eksperiment, en relativt komplet farmakologiske profil af receptorerne, der medierer agonist-induceret muskelsammentrækning kan genereres.
Med hensyn til agonisme, the relative effekt (E max) og styrke (EC50) af en agonist i et givet væv kan beregnes og sammenlignes med svarene fra andre agonister i det samme væv 1. I vores forsøg blev rotten thorakalaorta inkuberet med enten vehikel eller α 1 adrenerge receptor antagonist prazosin (5 nM) i en time før tilsætning af α 1 adrenerge agonist phenylephrin til vævsbadet og generere sammentrækning. Figur 2 præsenterer modificerede resultater i figur 1. De grønne reaktioner er blevet markeret med den maksimale kontraktion opnås ved PE markeret som max, den ½ maksimal sammentrækning mærket som sådan og derefter tilknyttet PE koncentration, der forårsagede dette svar. Identifikation af disse værdier er at identificere den effektive koncentration af en agonist, der opnår en halv max (50%) respons eller EC50-værdi.
Desværre anvendelse agonistafhængig parameters alene at bestemme receptorbindende egenskaber kan være kompliceret 9. Ideelt, yderligere forsøg med receptor-antagonister tillader beregning af to vigtige parametre, der er nøglen til at definere interaktionen mellem et lægemiddel og en receptor: den -log 10 af antagonisten dissociationskonstant (pK B) og -log 10 i molære antagonist koncentration nødvendig for at fremkalde dobbelt højregående forskydning i koncentrations-responskurven (pA2) 10. Både K B og pA2 får deres anvendelighed fra det faktum, at de er agonist-uafhængige værdier, og forbliver konstant, selv mellem forskellige væv 11. Ud fra dataene i figur 2, kan pK B beregnes ved hjælp af følgende ligning og er baseret på EF-50, der er beregnet andetsteds:
EC50 i fravær af prazosin = 2 x 10 -8 M
EF 50 i den præmeget af prazosin = 7 x 10 -6 M
Løs for K B i følgende ligning:
log (DR-1) = log [B] – log K B
Hvor:
[B] = antagonist koncentration, eller 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3
DR = dosisforhold af EC 50 værdi i nærvær af antagonist / EF 50 i fravær. Hvis der er en højredrejning, vil denne værdi være større end én. Således:
DR = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M eller 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Substitution for [B] og dr:
log (350-1) = -8 – log K B
2,54 = -8 – log KB
pK B = 10,54
Denne værdi for prazosin er i overensstemmelse med de værdier, når prazosin interagerer med en α 1 adrenerg recepteller 12,13, tyder på, at adrenerge receptor medierer kontraktion til phenylephrin er α 1 adrenerge receptor.
Flere trin er afgørende for succes i disse forsøg. Væv skal forblive i PSS efter dissektionen for at undgå tab af levedygtighed væv. Enhver isometrisk muskel præparat har en optimal længde-spænding forhold, der genererer maksimal magt mod passiv spænding 14,15. For eksperimentet beskrevet i denne protokol, var optimal passiv spænding tidligere bestemt ved kort tilføje trin på 0,5 g passiv spænding til vævet. Vævet skal begynde uden tone og derefter efter 30 min af ligevægt blev vævet udfordret med en maksimal koncentration af KCl (80 mM), hvilket genererede aktive tone. Derefter blev vævet vasket og fik lov til at vende tilbage til basislinie tone. Efter 15 min ved baseline blev endnu 0,5 g passiv spænding anbringes, og denne proces gentages, indtil et plateau afaktiv spænding blev opnået med yderligere passiv spænding. I indledende eksperimenter blev 4 g totalt passiv spænding bestemmes for at opnå maksimal aktiv spænding generation i aortaringe og dermed denne samlede spænding anbringes på ringene før ækvilibrering. Proceduremæssigt er det bedst kendte passiv spænding ansøgning til nul, men kan gøres til enhver tid før forsøget. Over-stretching væv, på noget tidspunkt i forsøget eller dissektion, negativt vil påvirke væv levedygtighed og eksperimentelle resultater. Dette er mest afgørende, når placere væv i badet, da dette trin har den højeste sandsynlighed for overdreven strækning. Tilstrækkelig vask, i antal og varighed er påkrævet for reproducerbare virkninger. En anden udfordring for hurtigt efter en indledende udfordring eller før væv er vendt tilbage til baseline spænding, vil resultere i afvigende reaktioner. Hvis studere reversible antagonister / hæmmere bør væv ikke vaskes før agonist kommer, som inhibitor fusion vil være nedsat.
Der er bemærkelsesværdige fordele og ulemper for de isolerede vævsbad assays.
Ulemper: Væv kan opleve forskellige grader af skader under kirurgisk fjernelse eller placering af ringe på kroge. Da endotelcelle er den indvendige foring af aorta ring, skal man passe på anbringelsen af ringen på kroge for ikke at beskadige denne cellelag. Væv kan også have tydeligt forskellige længder af tid, hvor de er levedygtige i vævsbadet, og dette skal bestemmes; ikke alle væv, er de samme. Langs disse linjer, kan væv ændre sig i deres reaktionsevne hele dagen, således at tidskontrol blevet en nødvendig kontrol for hvert forsøg. Et godt eksempel på dette er marsvinluftrøret der forbedrer i kontraktilitet maksimum af 100% i løbet af en typisk 8 timer eksperiment. Lægemidler, der er tungtopløselige i vand, kan udfældes i PSS. Endelig kumulativ ennd ikke-kumulative tilsætninger af et lægemiddel, der er en agonist kan medføre forskellige resultater, hvis receptor desensibilisering til agonisten finder sted; Angiotensin II er et sådant stof, der viser hurtige tachyphylaxe.
Fordele: En af de primære fordele ved vævsbad eksperimenter er, at det er real time; man kan se eksperimentet som det udfolder sig og kan hurtigt lave konklusioner og planlægge de næste skridt, samt fejlfinding under et eksperiment. Et eksperiment tager en dag at gøre. Flere væv kan typisk fremstilles ud fra et dyr, således at et dyr kan tjene som sin egen kontrol og der tilføjer styrke til et eksperiment. Man kan også isolere væv fra andre faktorer, således at afprøve en relativt ren reaktion af vævet for lægemidlet. In vitro forsøg, såsom vævsbadet systemet tillader også anvendelse af en mindre mængde af lægemiddel sammenlignet med et in vivo eksperiment.
Det grundlæggende eksperimentelle design beskrevet heri, kan væreudstrakt ændret for at give mulighed for optagelse af yderligere parametre eller indførelse af andre eksterne stimuli. For eksempel tilsætning af elektroder tillader elektrisk felt stimulation af innerverer nerver 16,17. Med tilføjelsen af termiske eller pH-sonder, kan også måles effekten af temperatur og pH på kontraktile respons 18,19. Ligeledes kan oxygen være substitueret helt eller delvist med N2 for at evaluere hypoxi inducerede virkninger. Desuden kan de samme grundlæggende principper for isometrisk kontraktilitet måling, der anvendes i denne video bruges til at udvikle systemer, der tillader samtidig måling af isometrisk spænding udvikling og ændringer i intracellulært calcium 20. Signaltransduktion er også let undersøgt, eftersom systemer eksisterer der hurtigt kan fryse en vævsprøve i en reaktion, således at aktiviteten af en signaltransduktionsvej systemet kan kontrolleres biokemisk.
Variationen i EQUipment, der kan anvendes til at gøre dette er enorm. Hele denne ordning, enten hånd konstrueret eller automatisk, kan købes fra flere forskellige virksomheder. De væv bade og væv indehavere i denne protokol var mundblæste (væv bade) og hånd konstrueret (indehavere) af en in-house Michigan State University maskinværksteder.
The authors have nothing to disclose.
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
Tissue Bath | Multiple Sources | ||
Physiological Salt Solution | PSS | ||
Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
Micrometer | |||
Custom Stands | |||
Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
S-Connector | VWR International | Talon | |
Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
Tissue Dissection | |||
Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |