This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.
Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum – if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.
Disiplin farmakologi har brukt den isolerte vevbad system i over 150 år. Allsidigheten av dette systemet har tillatt forskere over hele verden for å karakterisere reseptorer og reseptor-signaltransduksjon, med denne kunnskapen som danner grunnlaget for terapier som er behandlet millioner av personer med sykdommer eller forstyrrelser, slik som hypertensjon, hjertesvikt, diabetes, gastrointestinal sykdom, blære dysfunksjon, astma, og svelgevansker, for å nevne noen få. Til denne dag, forblir isolert vevbad en viktig fasett av narkotika utvikling og grunnleggende forskning, som det lar vev for å fungere som en vev. I denne Jove leksjon, er en formell protokoll delt å demonstrere en visuell og virtuell eksperiment utnytte data fra en isolert vev bad eksperiment som måler isometrisk kontraksjon, som tillater reseptor karakterisering.
Den primære fordelen med denne teknikken er at vevet er levende etnd fungerer som en helhet vev, med en fysiologisk utfall (kontraksjon eller avslapping) som er relevant for kroppen. Det er en syntese av trinnene (medikament-reseptor interaksjon, signaltransduksjon, andre messenger generasjon, endring i glatt muskulatur oppstemthet, og endring i vev funksjon). Selv om andre teknikker tillater undersøkelse av hver av disse trinnene (f.eks radioligandbinding for medikament affinitet, måling av andre budbringere), lar det isolerte vev-bad teknikk for integrering av alle disse trinnene 1. En annen fordel er at holde vev funksjon tillater beregning av viktige farmakologiske variabler som er mer meningsfylt i et vev vs et cellulært miljø; det kommer nærmere hvordan legemidler undersøkt ville fungere i kroppen som en helhet.
Måling av isometrisk kraft som et analyseverktøy er over 150 år gammel, men det fortsetter å være den prototypiske teknikk for reseptor karakterisering i kontraktile vev 2. Kraften av denne teknikk er i sin enkelhet og fleksibilitet: ved å registrere responser fremkalt av økende konsentrasjoner av en agonist i nærvær eller fravær av en antagonist, kan en myriade av informasjon utledes om de farmakologiske egenskapene av hvert medikament og reseptoren til hvilken det binder 3-5. Eksperimenter av denne typen også garner informasjon om konkurranse versus ikke-konkurrerende natur antagonister som brukes, samt reseptor heterogenitet og uspesifikke narkotika effekter 6-8. Således, med enkle permutasjoner til dette isolerte vev-bad eksperiment, en relativt fullstendig farmakologiske profilen til reseptorene som medierer agonist-indusert muskelkontraksjon kan genereres.
I form av agonisme, the relative effekten (E MAX) og styrke (EC 50) på en agonist i et gitt vev kan beregnes og sammenlignes med responser fra andre agonister i det samme vev 1. I våre forsøk ble rotten thorakalaorta inkubert med enten bærer eller α en adrenerg reseptorantagonist prazosin (5 nM) i en time før tilsetning av α en adrenerg agonist fenylefrin til vevsbadet og generering av sammentrekning. Figur 2 viser resultatene modifisert i figur 1. De grønne responser er merket med maksimal kontraksjon oppnås ved PE merket som max, markerte ½ maksimal sammentrekning som sådan og deretter knyttet til PE konsentrasjon som forårsaket at respons. Identifisering av disse verdier er å identifisere den effektive konsentrasjon av en agonist som oppnår en halv maks (50%) respons eller EC50 verdien.
Dessverre bruker agonist avhengig parameters alene for å bestemme reseptor-bindingsegenskaper kan være komplisert 9. Ideelt, men ytterligere forsøk under anvendelse av reseptorantagonister tillate beregning av to viktige parametre som er viktige for å definere interaksjon mellom et medikament og en reseptor: den -log 10 av antagonisten dissosiasjonskonstant (pK B) og -log 10 av den molare antagonist konsentrasjonen som er nødvendig for å fremkalle to ganger mot høyre skift i konsentrasjons-responskurve (pA 2) 10. Både K B og pA to forsterknings deres nytte av det faktum at de er agonist uavhengige verdier, og forblir konstant selv mellom forskjellige vev 11. Fra dataene i figur 2, kan pK b bli beregnet ved hjelp av følgende ligning og basert på EC 50 verdier beregnet annet sted:
EC 50 i fravær av prazosin = 2 x 10 -8 M
EC 50 i prefølelse av prazosin = 7 x 10 -6 M
Løse for K B i den følgende ligning:
log (dr-1) = log [B] – logg K B
Hvor:
[B] = antagonist-konsentrasjon, eller 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3
dr = dose forhold på EC 50 verdi i nærvær av antagonist / EC 50 i fravær. Hvis det er en høyrerettet forskyvning, vil denne verdien er større enn én. Dermed:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M eller 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Erstatter [B] og dr:
log (350-1) = -8 – logg K B
2.54 = -8 – logg KB
pK B = 10,54
Denne verdi for prazosin er i samsvar med verdiene oppnådd når prazosin samvirker med en α en adrenerg recepteller 12,13, noe som tyder på at den adrenerge reseptoren medierer kontraksjon til fenylefrin er α en adrenerg reseptor.
Flere trinn er avgjørende for å lykkes med disse eksperimentene. Vev må forbli i PSS etter disseksjon for å forhindre tap av vev levedyktighet. Enhver isometrisk muskel forberedelse har en optimal lengde-spenningsforhold som genererer maksimal kraft mot passiv spenning 14,15. For forsøket beskrevet i denne protokollen, ble optimal passiv spenning tidligere bestemt ved kort å legge trinn på 0,5 g passiv spenning til vevet. Vevstoffet bør begynne uten tone og deretter etter 30 minutter av likevekt, ble vevet utfordret med en maksimal konsentrasjon av KCl (80 mM), noe som ga aktive tone. Deretter ble vevet vasket og fikk returnere til basislinjen tone. Etter 15 minutter ved grunnlinjen, ble en annen 0,5 g passiv spenning plassert og denne prosessen gjentas inntil et platå avaktiv spenning ble oppnådd med ytterligere passiv spenning. I preliminære eksperimenter, ble 4 g totalt passiv spenning bestemmes for å oppnå maksimal aktiv spenning generasjon i aorta-ringer, og dermed denne totale mengde spenning legges på ringene før ekvilibrering. Prosedyremessig er det best å fokusere før passiv spenning program, men det kan gjøres når som helst før forsøket. Over-strekking vev, ved ethvert punkt i eksperimentet eller disseksjon, negativt vil påvirke vevs-levedyktighet og eksperimentelle resultater. Dette er mest viktig når du plasserer vev i badekaret, da dette trinnet har den høyeste sannsynligheten for overdreven strekk. Tilstrekkelig vasking, i antall og varighet kreves for reproduserbare effekter. En annen utfordring for tidlig etter en innledende utfordring, eller vev før har returnert til referansespenningen, vil resultere i avvikende respons. Hvis studere reversibel antagonister / hemmere, bør vev ikke vaskes før agonist tillegg, som inhibitor-konsentrasjonen vil bli redusert.
Det er bemerkelsesverdige fordeler og ulemper for de isolerte vev bade analyser.
Ulemper: Vev kan oppleve ulike grader av skade under kirurgisk fjerning eller plassering av ringene på kroker. Siden endotelceller er den indre fôr av aorta ring, må man være forsiktig på plassering av ringen på kroker for ikke å skade dette cellelaget. Vev kan også ha ulike lengder av tid som de er levedyktig i vevsbadet, og dette må fastsettes; ikke alle vev, er de samme. Langs disse linjene, kan vev endre i sin respons i løpet av dagen slik at tidskontroller blitt en nødvendig kontroll for hvert eksperiment. Et godt eksempel på dette er marsvintrakea som forbedrer i kontraktilitet maksimum ved 100% under et typisk 8 timers forsøket. Legemidler som er dårlig løselig i vann kan utløse ut i PSS. Endelig kumulative ennd ikke-kumulative tilsetninger av et medikament som er en agonist kunne resultere i forskjellige resultater hvis reseptor desensitivisering til agonisten oppstår; angiotensin II er et slikt medikament som viser raske tachyphylaxis.
Fordeler: En av de viktigste fordelene med vev bade eksperimenter er at det er sanntid; man kan se eksperimentet som den utfolder seg, og kan raskt gjøre konklusjoner og planlegge neste trinnene, samt feilsøke under et eksperiment. Et eksperiment tar en dag å gjøre. Flere vev kan vanligvis fremstilles fra ett dyr, slik at et dyr kan tjene som sin egen kontroll, og som tilfører styrke til et eksperiment. Man kan også isolere vev fra andre faktorer, slik som å teste en relativt ren reaksjon av vevet for medikamentet. In vitro-eksperimenter som vevsbadet systemet tillater også bruk av en liten mengde av stoffet, sammenlignet med en in vivo-eksperiment.
Den grunnleggende eksperimentelle konstruksjon som er beskrevet her kan bliomfattende modifisert for å gi rom for opptak av flere parametere eller innføring av andre eksterne stimuli. For eksempel, tilsetning av elektroder tillater elektrisk felt stimulering av nerver innervating 16,17. Med tillegg av termiske eller pH-sonder, kan virkningene av temperatur og pH på kontraktile responser også måles 18,19. På samme måte kan oksygen være substituert helt eller delvis med N2 for å evaluere hypoksi-induserte effekter. Videre kan de samme grunnleggende prinsipper for isometrisk måling kontraktilitet brukes i denne video bli brukt for å utvikle systemer som tillater samtidig måling av isometrisk spenning utvikling og forandringer i intracellulær kalsium-20. Signaltransduksjon blir også lett undersøkt, siden systemer finnes som kan hurtig fryse en vevsprøve ved en reaksjon, slik at aktiviteten til en signaltransduksjonsbane system kan verifiseres biokjemisk.
Variasjonen av utstyr;ipment som kan brukes til å gjøre dette er enorme. Hele dette systemet, enten hånd konstruert eller automatisert, kan kjøpes fra flere forskjellige selskaper. Vevbadene og vev holdere som brukes i denne protokollen var munnblåst (vevsbad) og hånd konstruert (innehavere) av en in-house Michigan State University maskin butikker.
The authors have nothing to disclose.
The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
Grass Force-Displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
Tissue Bath | Multiple Sources | ||
Physiological Salt Solution | PSS | ||
Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
50ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
250ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
Micrometer | |||
Custom Stands | |||
Three-Prong Clamps | VWR International | Talon | |
S-Connector | VWR International | Talon | |
Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
Tissue Dissection | |||
Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |