Abstract
Potenziale di superficie è una caratteristica fisica comunemente trascurato che gioca un ruolo dominante nella adesione di microrganismi sul supporto, superfici. Kelvin microscopia a forza sonda (KPFM) è un modulo di microscopia a forza atomica (AFM), che misura la differenza di potenziale contatto tra le superfici a scala nanometrica. La combinazione di KPFM con AFM consente la generazione simultanea di potenziale di superficie e le mappe topografiche di campioni biologici come le cellule batteriche. Qui, ci avvaliamo di KPFM per esaminare gli effetti del potenziale di superficie su adesione microbica di superfici medicalmente rilevanti quali acciaio e oro. Potenziali mappe superficiali hanno rivelato differenze nel potenziale di superficie per membrane microbiche su diversi supporti materiali. Un grafico step-altezza è stato generato per mostrare la differenza di potenziale di superficie in una zona di confine tra la superficie del substrato e microrganismi. Variazioni cellulare potenziale di superficie di membrana sono stati collegati con il cambiamentos nel metabolismo e la motilità cellulare. Pertanto, KPFM rappresenta un potente strumento che può essere utilizzato per esaminare le variazioni di potenziale di superficie della membrana microbica su aderenza a varie superfici del substrato. In questo studio, dimostriamo la procedura per caratterizzare il potenziale superficie delle singole celle Staphylococcus aureus meticillino-resistenti USA100 su acciaio e oro con KPFM.
Introduction
I biofilm prodotto sulle superfici attrezzature e nelle ferite cutanee rappresentano un problema per l'industria medica come biofilm sono recalcitranti alla rimozione e può portare a un aumento dei tassi di trasmissione di malattie e la resistenza antimicrobica. Attachment è il primo passo nella formazione di biofilm e è la fase più critica a causa della sua reversibilità 1-3. Caratteristiche della superficie del substrato svolgono un ruolo cruciale sull'attaccamento microbica. Fattori quali la durezza superficiale, porosità, rugosità, e idrofobicità hanno dimostrato di effettuare attaccamento microbica; Tuttavia, poche ricerche esaminare il ruolo potenziale di superficie del substrato (SP) sulla adesione microbica è stato fatto 4,5. Superfici cariche negativamente prevenire l'attacco di spore di Bacillus thuringiensis per mica, silicio, oro e 6. Le variazioni del potenziale di membrana cellulare sono indicativi delle variazioni di attaccamento cellulare e motilità 5,7. È stato osservato che hom elettricamentesuperfici ogeneous promuovere più facilmente microbica adesione 5. Caratterizzazione del potenziale superficiale di batteri su nanoscala può fornire un nuovo modo di comprendere la cinetica adesione dei batteri alle varie superfici, e quindi possono facilitare lo sviluppo di strategie anti-incrostanti. A differenza di altri metodi utilizzati per la caratterizzazione della cinetica elettro di batteri, come dispersione elettroforetico luce, potenziale zeta, e determinazione del punto isoelettrico, Kelvin microscopia a forza sonda (KPFM) consente per l'esame di singole cellule invece di intere culture 8-11. Questo è vantaggioso quando si vuole confrontare cellula-cellula o biofilm caratteristiche elettriche con elevata accuratezza e precisione.
KPFM è un modulo di microscopia a forza atomica (AFM). AFM è stato sviluppato come risultato diretto del microscopio a effetto tunnel (STM) 12. Le prime immagini pubblicate utilizzando STM sono stati fatti da Gerd Binnig e Heinrich Rorhrer nel 1982 12 12 eccitato. STM può essere fatto anche in liquidi con punte di controllo specializzati 13. Questo è stato dimostrato da Lindsay et al., Che usava STM e AFM di immagini molecole di DNA in 10 mM HClO 4 e in acqua, su elettrodi di oro 13. KPFM è stata dimostrata nel determinare i potenziali superficiali di DNA e proteine analisi 25 e biomolecole interazione con ligandi 26.
KPFM opera misurando la differenza di potenziale di contatto (CPD) tra una punta cantilever AFM conduttivo e un campione idealmente conduttivo (Figura 1, i) 14,15. I campioni non devono necessariamente essere conduttivo (cioè, sampl biologicaes). Imaging può essere eseguita su mica, vetro, e superfici di silicio (non conduttivi), purché la superficie non conduttiva è sottile e non vi è un materiale conduttivo sottostante 6,7. Il CPD è equivalente al potenziale di tensione superficiale e può essere descritto come la differenza nelle funzioni di lavoro tra la punta (tip φ) e il campione (campione φ), diviso per la carica dell'elettrone negativo (- e). Quando una punta AFM conduttivo viene portato vicino ad una superficie del campione (separati da distanza d), viene generata una forza elettrostatica (es F) a causa della differenza di energia di Fermi (Figura 1, ii, a) 15. A questo punto, le energie vuoto della punta e del campione (E v) sono in equilibrio e allineato. Su portando la punta più vicino alla superficie del campione, la superficie della punta e del campione entrano in contatto elettrico e agiscono come condensatori a piastre parallele (Figura 1, ii, b 14,15. Al punto, le energie di Fermi della superficie punta e del campione diventano allineate, raggiungendo un equilibrio di stato stazionario (Figura 1, ii, b). Sarà addebitato la superficie punta e campione e un CPD V formerà a causa di una differenza di funzioni E s 'contro e di lavoro. Una atti F es sull'area di contatto elettrico a causa della V formata CPD. Questa forza viene successivamente annullato attraverso l'applicazione di un DC V esterna alla punta che ha la stessa grandezza della V CPD formata (figura 1, ii, c). Questa tensione continua applicata elimina carica superficiale nella zona di contatto elettrico, e la quantità di V cc necessaria per eliminare gli es F di V CPD è pari alla differenza tra le funzioni di lavoro tra l'sadi superficie mple e mancia 15. Va notato che la funzione di lavoro della punta è noto ed è fornito dai produttori. In tutti i metodi KPFM, una tensione AC (V AC, circa 100 - 500 mV) viene applicato anche alla punta per generare forze elettriche oscillanti tra la punta e il campione 14. Ciò fornisce una migliore risoluzione per la misurazione dei cambiamenti della V CPD e / o F ES. A questo proposito, cambiamenti nella frequenza o ampiezza di oscillazione elettrica possono essere corretti V DC, e la superficie mappe potenziali possono essere generati. I dati provenienti da specifiche aree di queste mappe possono essere ulteriormente analizzati per fornire informazioni elettrici su specifiche caratteristiche topografiche.
KPFM può essere utilizzato in tre modi: (1) modalità ascensore, modalità (2) modulazione di ampiezza (AM), e (3) modulazione di frequenza (FM) modalità 14,16. Modalità Ascensore era il inc inizialearnation di KPFM. Modalità di sollevamento si basa su un metodo a due passaggi in cui una punta oscillata viene trascinato attraverso la superficie per ottenere un'immagine topografica. Per il secondo passaggio della punta viene sollevata una distanza prefissata al di sopra del campione periodo (10 - 100 nm) e scansione indietro attraverso la stessa area. Grazie a questo metodo a due passaggi, modalità di sollevamento, rispetto al AM- e FM-KPFM, richiede più tempo per l'acquisizione dell'immagine. Aumentare la punta lontano dalla superficie assicura che solo a lungo raggio F es viene misurato. Inoltre, cross talk tra i potenziali misure di topografia e di superficie è disaccoppiato a scapito di una maggiore risoluzione laterale e sensibilità.
AM-KPFM migliora la risoluzione laterale e la sensibilità utilizzando dual-frequenze per misurare simultaneamente la topografia del campione e il potenziale di superficie (scansione one-pass) 14. In modalità AM, il cantilever è oscillato meccanicamente, generalmente 5% di sotto della sua prima frequenza di risonanza (f 0), e oscillare elettricamente (tttraverso un V AC) alla sua seconda frequenza di risonanza (f 1). Le variazioni di ampiezza di f 0 portano alla generazione di dati topografici, mentre le variazioni di ampiezza di f 1, dovute a variazioni es F e V CPD, danno potenziali dati di misura di superficie. f 0 e f 1 del cantilever sono separati da frequenze significative ed energie che segnale di cross-talk 14 è minimizzato. La centralina di testa (HEB) della AFM separa i due segnali per dare sia topografica e la superficie dei dati potenziali contemporaneamente in una sola scansione. FM-KPFM migliora la risoluzione anche oltre AM-KPFM su superfici biologiche 14. FM-KPFM funziona in modo diverso rispetto AM-KPFM in che misura l'andamento gradienti forza elettrostatica piuttosto che forza elettrostatica (es F) 15. Come modalità AM, FM utilizza dual-frequenze e un single-pass meccanismo di scansione per ottenere topografica e di superficie dati potenziali simultaneamente 14. In modalità FM, il cantilever viene fatto oscillare meccanicamente ed elettricamente f 0 oscillare ad una bassa frequenza modificata (f mod, tipicamente: 1 - 5 kHz). Su interazioni elettrostatiche, f 0 e f mod mix per produrre bande laterali f 0 ± f mod. Queste bande laterali sono molto sensibili alle variazioni di forza elettrostatica, e possono essere separati da f 0 a HEB del AFM. Dal FM-KPFM misura l'andamento gradienti forza elettrostatica, la punte forma apice e la sua manutenzione / integrità giocano un ruolo critico nella superficie complessiva potenziale risoluzione 14, 15. Surface potenziale risoluzione usando AM e FM sono nel range di 1 nm laterale 14 -16. Va notato che l'imaging KPFM può essere realizzata in liquidi non polari, e, più recentemente, è stato dimostrato essere fatto in (<10 mm) liquidi polari bassa ionico (inKPFM modalità ad anello aperto che non richiedono una valutazione polarizzazione, ovviando l'applicazione di una polarizzazione CC) come acqua MilliQ; tuttavia, l'imaging KPFM deve ancora essere fatto su cellule vive in soluzioni polari 17-20. Sfide aggiuntivi associati SP imaging liquido è che le soluzioni comunemente utilizzati per le celle mantenimento (cioè, tampone fosfato salino) hanno alte concentrazioni di ioni mobili, che porterebbero a reazioni faradica, dinamiche carica di polarizzazione indotta, e la diffusione di ioni / ridistribuzione 20. Quindi, per questo esperimento, le misurazioni sono state prese da cellule MRSA essiccati e morti su superfici funzionalizzate inox poli-L-lisina acciaio e oro in condizioni ambientali. Imaging può essere effettuata in condizioni di aria o di vuoto su campioni biologici che sono stati precedentemente essiccati o immobilizzati sulle superfici 20. La presenza di umidità hanno anche dimostrato di influenzare l'imaging KPFM di superfici 6.
In questo studio, abbiamo impiegato FM-KPFMe AFM di esaminare il ruolo della SP per il sequestro di meticillino-resistente Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) per superfici in acciaio inox e oro funzionalizzate poli-L-lisina. MRSA ha recentemente ottenuto lo status di multi-farmaco resistente (MDR) "superbug" per la sua resistenza naturale selezionato a molti antibiotici β-lattamici e cefalosporine 21. Infezioni da MRSA sono ora più impegnativo, difficile, e formidabile per trattare, portando all'utilizzo di antimicrobici severe come la vancomicina o oxazolidinoni che hanno livelli elevati di tossicità nell'uomo, e pertanto non può essere utilizzato come trattamenti a lungo termine 22. L'acciaio inossidabile è stato scelto per la sua rilevanza medica e di uso comune come materiale in aghi ipodermici, padelle, maniglie delle porte, lavandini, ecc L'oro è stato utilizzato come un metallo comparativa. FM-KPFM è stato utilizzato per esaminare se la membrana microbica SP cambia su attaccamento ai substrati.
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Protocol
1. Preparazione di cristalleria e culture
- Prima di procedere con questo esperimento, preparare agar sangue 5% di pecora (SBA) piastre per coltivazione MRSA. Incubare le piastre SBA per 24 ore a 37 ° C. Dopo questo periodo, singoli, colonie ben isolate dovrebbero essere presenti per essere utilizzato per le successive vaccinazioni in mezzi liquidi. Conservare striato piastre SBA con singole colonie a 4 ° C per 1 - 2 mesi.
NOTA: piastre di agar sangue di pecora sono disponibili in confezioni precostituiti contenenti da 20 - 25 piastre base al produttore, e tipicamente costituiti da una base di soia agar Tryptic con l'aggiunta di 5% w / v di sangue di pecora. - Fare 500 ml di brodo di soia trittico (TSB) supplementato con 1% di glucosio e 0,1% NaCl. Dopo questo, raccogliere e pulire 2 provette di vetro. Se coperchi autoclavabili non sono disponibili per provette, usare fogli di alluminio come un cappuccio. Autoclave TSB e provette insieme a una scatola di punte per pipette 1 ml.
- Sotto un armadio biosicurezza o vicino ad una Bunsen bruciatore pipetta 5 ml di precedentemente sterilizzati in autoclave TSB in provette in autoclave. Attenzione a garantire che il tempo è stato dato a lasciare il TSB e provette raffreddare a temperatura ambiente. Da un 5% piastra SBA precedenza striato, inoculare una singola colonia in 6 ml di brodo TSB. Una conterrà MRSA, e la seconda provetta sarà utilizzato come controllo negativo per garantire la sterilità.
- Prendere provette inoculate prova TSB e metterli in un incubatore reciproca per 24 ore a 37 ° C ea 200 rpm. Dopo questo tempo la crescita microbica dovrebbe essere evidente nella provetta MRSA mentre nessuna crescita dovrebbe essersi verificato nella provetta di controllo.
- Prendere 1 ml di cultura 24 ore e trasferirli in 6 ml di TSB fresco. Incubare a 37 ° C per 6 ore a 200 rpm.
- Pipettare 1 ml di 6 ore sub-cultura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifugare per 3 min a 850 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di H 2 O. deionizzata Centrifuga, ripetere, e ri-sospensione.
- Prendere acciaio e dischi campione oro AFM (20 mm e 10 mm di diametro rispettivamente) e pulire ogni lato con 5 ml di H 2 O. deionizzata Tenere dischi campione nella mano dominante con una pinza e utilizzare la mano sottodominante pipettare 5 ml su ciascun lato del disco campione. Dopo aver lavato entrambi i lati, dischi campione posto in un becher contenente 20 ml di H 2 O deionizzata seguita da sonicazione per 1 min.
- Dopo l'uso sonicazione pinze per rimuovere i dischi campione dal bicchiere. Posizionare i dischi in modo che si affacciano ad un angolo di 60 ° contro il bordo di una piastra di Petri aperta su un tovagliolo di carta. Utilizzare il coperchio della piastra Petri per coprire i dischi di essiccazione. Lasciate asciugare completamente i dischi prima di procedere. Il tempo di asciugatura può variare tra 4 - 8 ore.
- Una volta asciutto, usare il forcipe per inserire i dischi di campioni in una piastra di Petri.
- Facoltativamente, funzionalizzare le superfici dei dischi campione con qualsiasi materiale (ad esempio, collagene, acido ialuronico, argento nano-particelle, ecc).
- Per questo esperimento, utilizzare poli-L-lisina per rivestire la superficie del substrato. Per poli-L-lisina funzionalizzazione, pipette 200-400 ml di 0,1% di poli-L-lisina (in H 2 O) su dischi di esempio, e lasciate incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una piastra di Petri.
- Dopo 1 ora, utilizzare pinze per tenere il disco del campione, e lavare con 1 ml di H 2 O. deionizzata Lasciate asciugare su carta assorbente come descritto al punto 2.2.
- Prendere 2x cellule ri-sospeso lavati e piastra 200-400 ml su dischi di campioni all'interno di un armadio biosicurezza. Se dischi campione sono rivestiti con poli-L-lisina, incubare per 0,5 ore a temperatura ambiente.
- Dopo incubazione di cellule su dischi campione, lavare dischi campione delicatamente con 1 ml di H 2 O. deionizzata Lasciate asciugare i dischi durante la notte prima di imaging.
3. KPFM Imaging
NOTA: Per questo esperimento,utilizzare una serie Agilent 5500 ILM-AFM.
- Per iniziare AFM, accendere il gruppo computer con HEB e MAC III controllore della AFM. Software di imaging aperto AFM (ad esempio, di Agilent PicoView). Assicurarsi di selezionare inizialmente ACAFM o qualsiasi denominazione corretta è sulla AFM per l'imaging in modalità intermittente contatto.
- Utilizzando pinze AFM nella mano dominante, e tenendo premuto il supporto a clip a molla aperto con la mano sottodominante, inserire un cantilever KPFM in testa al pezzo. Prestare attenzione durante la manipolazione e il trasferimento del capo-pezzo AFM al AFM come questa unità (almeno sul 5500 ILM-AFM) contiene l'unità di cristallo piezoelettrico fragile che controlla X, Y, Z e direzionalità scansione.
NOTA: I cantilever KPFM utilizzati in questo caso sono stati Mikromasch DPE conduttivo (basso rumore) cantilever con frequenze medie di risonanza di 80 kHz e primaverili costanti di 2,7 N / m. Cantilever con queste frequenze di risonanza e costanti primaverili sono stati scelti per la loro facilità d'uso.Cantilevers con costante elastica più grandi e più elevate frequenze di risonanza possono essere utilizzati anche per l'imaging. - Sistemare con cura testa pezzo al AFM e collegare i fili appropriati (in questo caso due fili bisogno di essere collegato in: luce laser e motore di sollevamento stadio).
- Allineare il laser sulla punta del cantilever. Alcune unità contengono una funzionalità della telecamera, che agevola l'allineamento. Se la funzionalità della fotocamera non è presente su AFM, allineare sulla punta cantilever come descritto di seguito:
- Ruotare il front-to-back in senso orario per spostare il laser sovrastano il chip a sbalzo. Quando il laser raggiunge il chip verrà bloccato e non sarà più visibile. Solo ruotare la manopola un paio di volte.
- Ruotare la manopola front-to-back in senso antiorario fino a quando il punto laser riappare. Il laser è ora sul bordo del chip.
- Ruotare la manopola sinistra a destra per posizionare il laser sul cantilever. Come il laser passa sopra il cantilever sarà scomparire e riapparire in rapida successione. Il punto laser deve essere visibile nella copertura di vetro smerigliato in cui l'unità fotodiodo sarà poi sedersi.
- Ruotare la manopola front-to-back in senso antiorario per spostare il punto lungo la mensola verso la punta fino a quando il punto sul vetro smerigliato scompare.
- Ruotare la manopola front-to-back solo leggermente in senso orario per posizionare il laser in modo che esso si trova appena sulla punta cantilever. Lo spot laser riapparirà sul vetro smerigliato.
NOTA: Questo è il metodo di posizionamento laser per cantilever trampolino. Per a forma triangolare, il processo di allineamento è leggermente diversa.
- Una volta che il laser è allineato, tenere il motore fase di sollevamento in posizione "aperto" per 10 sec per garantire spazio sufficiente tra la mensola e del campione durante il fissaggio del campione alla AFM.
- Posizionare campione sul palco del campione KPFM. A terra il campione utilizzando un filo di rame. Collegare i cavi appropriati dalla AFM alla fase di campionamento. Collegare le stage alla AFM. Nella maggior parte dei casi la fase viene tenuto in posizione mediante magneti.
- Nel software AFM, sintonizzare il cantilever e poi iniziare approccio della punta cantilever al campione. Assicurarsi che tempo di assestamento è fissato a non più di 10 msec, e che velocità di avvicinamento non superi 2,0 micron / sec per evitare danni punta.
- Una volta che la punta è sbalzo sulla superficie del campione, selezionare una dimensione della finestra di imaging e area di esposizione ideale. Ottimizzare i guadagni I e P con il set point a sbalzo in modo che l'immagine topografica è ottimizzato.
- Una volta che l'imaging topografico è ottimizzato, accendere il modulo KPFM (FM o AM, qui, utilizzare la modalità FM). Va notato che l'imaging KPFM è molto impegnativo esterna della finestra di imaging x 5 micron 5 micron. Inoltre, per l'imaging ottimale KPFM, utilizzare una risoluzione di 512 x 512 con basse velocità di scansione (,02-,05 linee / sec).
- Per le impostazioni FM-KPFM (non ACAFM impostazioni), impostare la percentuale di auto tra il 5 - 10%. Impostare il fr cantileverequency tra: 1 - 5 kHz con una larghezza di banda di 2 kHz. Set I e P guadagni per le impostazioni FM-KPFM al 0,3%.
- Variare la larghezza di banda del segnale e I e P guadagni tra le superfici dei campioni. Per ottimizzare SP immagini, regolare ulteriormente la larghezza di banda del segnale e I e P guadagni per ottenere immagini ottimali. La gamma raccomandata di guadagni I e P sono 0,22-0,35%.
- Elaborare e analizzare le immagini raccolte KPFM utilizzando il software di elaborazione post-immagine per raccogliere i dati SP.
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Representative Results
La capacità di misurare SP utilizzando KPFM si basa sul principio che sia la superficie del campione e punta cantilever conduttivo sono in una certa misura. Acciaio e oro agito come superfici conduttive cui MRSA sono stati attaccati. KPFM immagini sono state prese di 15 celle MRSA su entrambe le superfici con 512 x 512 risoluzioni, e con aree di scansione da 5 x 5 micron a 10 x 10 micron. La scansione è stata effettuata con velocità di linea vanno da 0,02 linee / sec a 0,05 linee / sec. Pertanto, con 512 punti di dati raccolti per riga righe e 512 per la scansione, tempi di scansione variava da 2,84 a 7.11 hr hr. I tipi di immagini raccolte può essere visto in Figura 2. KPFM opera utilizzando doppia frequenza, e, come tale, immagini topografiche vengono raccolti simultaneamente insieme con i dati relativi alle caratteristiche elettriche della superficie. Filtri termici sono stati applicati per SP mappe per discernere più facilmente piccole variazioni di potenziale superficiale (Figura 2). I dati di mappe SP wcome analizzato software di elaborazione post-immagine per determinare le potenzialità media di superficie e le deviazioni standard. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando la programmazione R Open Source di statistica. Student t-test sono stati condotti per confrontare gruppi con P <0.05 essere considerato significativo.
SP immagini sono state analizzate per determinare microbica potenziale di superficie della membrana. Questi erano quindi confrontata con la crescita sulle diverse superfici del substrato. Ciò è stato fatto al fine di determinare se il tipo di superficie ha un effetto sul microbica potenziale di superficie di membrana. Inizialmente abbiamo cercato di incubare cellule MRSA staticamente per 3 ore sulle superfici del substrato. Tuttavia, non microbi attaccati erano visibili sotto la AFM. Dati SP per superfici funzionalizzate pulito e poli-L-lisina è stato determinato da 5 x 5 micron aree digitalizzate. Scansioni SP dei substrati acciaio e oro nudo nudo mostrato rispettivamente potenziali superficie complessiva negativo (-0,045 ± 0,057 V e -0,126 ± 0,052 V,, P = 0,047, Figura 3). Poly-L-lisina è stato utilizzato per funzionalizzare le superfici per renderle più favorevole per l'adesione delle cellule. Superfici funzionalizzate mostrato un passaggio a potenziali superficiali positivi per superfici in acciaio inox e oro (0,133 ± 0,063 V e 0,126 ± 0,030 V, rispettivamente, Figura 3). Abbiamo poi esaminato i potenziali di membrana di MRSA sulle superfici in acciaio e oro funzionalizzate poli-L-lisina. Si è constatato che potenziali di membrana cellulare MRSA variavano tra acciaio e superfici d'oro. Superfici in acciaio inox ha portato alla SP membrana positivi significativamente più grandi per le celle rispetto alla loro controparte oro. Ad esempio, la SP di cellule MRSA commutato da positivo a negativo SP. MRSA ha mostrato SP positivo su superfici in acciaio inox con SP di 0.160 ± 0.022 V e SP di -0,025 ± 0,016 V su superfici d'oro (P <0,001).
Per mostrare tutte le funzionalità di KPFM, un esempiodi un grafico step-altezza MRSA su acciaio inossidabile è fornito (Figura 4). Questo mostra la differenza di potenziale superficiale tra la superficie del substrato e la membrana microbica.
Figura 1. Principi di funzionamento del microscopio a forza atomica (i) e Kelvin forza sonda microscopio (ii) Ristampato con il permesso (15). La configurazione di base di AFM è mostrato in (i). In AFM, una punta affilata è collegato a un cantilever attraverso deposizione elettrochimica. Mikromasch platino ricoperto conduttivi DPE (a basso rumore) cantilevers sono stati utilizzati in questo esperimento ha dimensioni di 210 x 30 micron, 80 kHz frequenza di risonanza, e le costanti primaverili di 2,7 N / m. Cantilevers erano attaccati ad un chip grande per consentire una facile movimentazione. Una volta assemblato nella AFM, un laser è allineato sulla punta cantilever. Le flessioni nel cantilpunta sempre vengono rilevati attraverso un fotodiodo. Le flessioni sono usati per generare le immagini topografiche. (Ii, a, b, c) mostra il principio di funzionamento di KPFM. Il cantilever è portato abbastanza vicino alla superficie per consentire il contatto elettrico a verificarsi. Le differenze nei potenziali di superficie tra la punta e la superficie provocano la punta a deviare. Una tensione DC viene applicata per correggere tali deviazioni. Questa tensione DC applicata è uguale al potenziale di superficie della superficie del substrato. A seconda del tipo di modalità di imaging utilizzate (ascensore, AM, FM), questo principio di funzionamento è leggermente diversa. Figura 1 (ii) è stato modificato da 15.
Figura 2. topografia rappresentante e superficie potenziali mappe di MRSA su supporti acciaio e oro funzionalizzate poli-L-lisina. Immagini (I e III) mostrano immagini topografia rappresentative di cellule MRSA su acciaio inox e superfici d'oro, rispettivamente. Dimensioni immagine possono essere visti nell'asse X e Y di queste immagini insieme con un corrispondente profilo un'altezza colorato. (Ii e iv) mostrano le corrispondenti mappe SP del MRSA sulle rispettive superfici. 'Gold' filtri di colore standard sono stati applicati alla topografia immagini mentre i filtri termiche sono state applicate per SP immagini discernere più facilmente piccole variazioni di SP. Va notato che la SP di superfici del substrato non era omogenea. SP è risultato essere eterogeneo con evidenti aree positivi e negativi su entrambe le superfici del substrato. Questo può essere visto intorno alle cellule di MRSA in cui si osservano SPs eterogenei su supporti in acciaio e oro inox. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. potenziale superficiale di superfici del substrato e membrane cellulari MRSA. Figura 3 mostra i dati corrispondenti KPFM in acciaio inossidabile (etichettata qui come SS) e superfici d'oro, così come, dati da 15 celle. Gli asterischi rappresentano differenze significative tra i campioni con il numero di asterischi corrispondenti ai campioni confrontati. Dati MRSA sono stati raccolti dalle cellule attaccate alle superfici funzionalizzate dopo 30 minuti di incubazione. Questo è stato fatto per il fatto che non le cellule sono stati trovati per attaccare alle superfici del substrato nudo dopo 3 ore.
Figura 4. superficie Passo altezza potenziale immagine di MRSA su poli-L-lisina acciaio inox funzionalizzati. Utilizzando il software di elaborazione post-immagine, un grafico passo altezza è stato generato per mostrare la capabililegami del software, così come la notevole differenza SP tra la superficie del substrato e la membrana cellulare. L'area in sezione trasversale scelto è rappresentato nella corrispondente mappa SP con la linea grigia. Un passaggio da 0,15 V sulla superficie cellulare di 0,21 V sulla superficie del substrato è evidente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Azienda | Tipo di sonda | Costante molla (N / m) | Frequenza di risonanza (kHz) | Sbalzo Dimensioni | Suggerimento Apex Diametro |
| Asylum Research | AC240TM-R3 | 2 | 70 | Lunghezza = 240 micron Width = 40 micron </ Td> | 28 nm |
| Bruker AFM Sonde | SCM-PIT | 2.8 | 75 | Lunghezza = 225 micron Width = 28 micron | 20 nm |
| Mikromasch | Conduttivi DPE (Low-Noise) Cantilevers | 2.7 | 80 | Lunghezza = 210 micron Width = 30 micron | 40 nm |
| Nano e Altro USA | PTSI-NCH | 42 | 330 | Lunghezza = 125 micron Width = 30 micron | > 25 nm |
| Nanoscienze Instruments | AppNano conduttivi Tapping modalità AFM sonde. | 40 | 300 | Lunghezza = 125 micron Width = 35 micron | 30 nm |
| Nanoscienze Instruments | AppNano conduttivi Tapping modalità AFM sonde. | 40 | 300 | Lunghezza = 125 micron Width = 35 micron |
Tabella 1. Le aziende che offrono una vasta gamma di sonde KPFM. Una varietà di aziende offrono ora punta KPFM con diversi diametri punta apice, costanti primavera, e le frequenze di risonanza. Personalizzazione Tip è vicina senza limiti, con le aziende che generalmente offre di costruire cantilever con specifiche personalizzate per un esperimento previsto. La maggior parte delle sonde KPFM sono platino ricoperto nitruro di silicio. Platinum fornisce funzionalità conduttivo al cantilever. Altri materiali di rivestimento comune comprende l'iridio, platino + iridio e oro. La maggior parte dei suggerimenti KPFM possono anche essere utilizzati in alternativa per la microscopia a forza elettrica (EFM). Suggerimento apice è importante per cantilever KPFM. Punte di diametro maggiore sacrificio maggiore di imaging risoluzione topografica per meno rumore elettrico. Al contrario, punte di piccolo diametro (<25 nm) offrono una migliore risoluzione dell'immagine topografica, ma sono più inclini a disturbi elettrici. Per questo studio, i ricercatori hanno usato un comportamento Mikromaschive DPE (basso rumore) cantilever.
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Discussion
KPFM è stato impiegato come una tecnica innovativa per ottenere dati elettrici di superficie. È stato comunemente usato come metodo per l'esame distribuzione di carica in chimica ed è solo recentemente iniziato da applicare per lo studio di sistemi biologici della micro e nano-scale. Dai dati raccolti abbiamo scoperto che i microbi non sembrano collegare facilmente per pulire le superfici in acciaio inox e oro, anche dopo 3 ore di incubazione statica. Superfici funzionalizzate Poly-L-lisina mostrato attacco rapido microbica dopo 30 min. Tempi di incubazione più lunghi di microbi su superfici funzionalizzate portato a cellule sovraffollamento sulle superfici del campione, e le immagini topografia poveri. Funzionalizzazione superficiale ha portato ad uno spostamento da SP negativo a SP positivo per superfici in acciaio inox e oro. Precedenti studi hanno dimostrato che i microrganismi in genere hanno SPs negative a causa della sequestro di ioni negativi intorno alle cellule per mantenere osmotico ed equilibrio ionico 23. È anche notoche la presenza di gruppi fosfato in gram negative e acidi teichoic in microrganismi gram-positivi conduce a seguito della formazione di negative SP 24. La conoscenza della chimica di base di Gram membrane cellulari positivo e negativo ci ha portato a ritenere che gli SP substrato positivi potrebbero portare a un rapido attacco microbica. Tuttavia, come si può vedere nelle figure 2 - 4, che c'era un grande spostamento da positivo a SP cellulari MRSA negativi su substrati di acciaio inossidabile e oro, rispettivamente. Attaccamento microbica potrebbe essere inizialmente verificata dal sequestro di ioni negativi intorno alla membrana. Dopo il lavaggio delle cellule e lasciarli asciugare sulle superfici del substrato, avremmo potuto essere dilavamento questo supporto ionici. Inoltre, va notato che i dati KPFM è solo cumulativo delle aree esterne della parete cellulare del Gram positivi (MRSA) cellule. È stato dimostrato che in alcuni casi un potenziale di membrana cellulare microrganismi può cambiare dalla presenza di Catiopeptidi antimicrobici nic o altri fattori di stress 8.
Lo svantaggio principale del KPFM rispetto a misure di potenziale zeta standard su colture cellulari microbiche è che in KPFM i dati raccolti vengono eseguiti su cellule morte e secche. KPFM è stato utilizzato per esaminare le tendenze generali della superficie cellulare potenziali cambiamenti per quanto riguarda diverse superfici del substrato attaccamento. L'applicazione di tensioni DC alla punta cantilever (per contrastare es F), insieme con il requisito di una superficie del campione conduttiva, limitare KPFM standard per aprire aria imaging. Imaging in liquido polare non è attualmente possibile con KPFM standard e quindi la imaging cellule vive utilizzando KPFM non è come ancora possibile. Gli sviluppi di nuovi modi KPFM doppia frequenza anello aperto e hanno mostrato risultati promettenti nella loro capacità di superfici di immagine in soluzioni a basso ionici 18-20. E 'nostra speranza che in futuro questa tecnologia è ulteriormente sviluppato in modo che l'imaging può essere fatto su livcolture cellulari e. L'imaging cellule in un ambiente più naturale senza dubbio portare alla generazione di dati SP membrana cellulare più accurati e realistici. Per questo studio abbiamo voluto applicare questa tecnologia in un modo nuovo per misurare i potenziali di membrana delle cellule microbiche, nonché studiare le caratteristiche di adesione di MRSA su una superficie clinicamente rilevante. Variazioni SP membrana microbici sono stati osservati sulle incubazione sulle diverse superfici del substrato. Ciò può implicare che tipo di supporto può influenzare il metabolismo cellulare. La nostra speranza è che questi dati preliminari possono portare alla generazione di nano-rivestimenti con cariche elettriche intrinseche che potrebbero essere applicati a superfici o attrezzature mediche (compresi gli altri materiali come bende e garze) al fine di prevenire la fissazione microbica. Il protocollo descritto in questo articolo è destinato per aiutare i ricercatori a capire i principi di KPFM e mostrare i modi in cui può essere applicato per misurare e creare SP mappe.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
| AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
| DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
| PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
| PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
| Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
| Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
| Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |
References
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