Se presenta un método simplificado para la detección de la expresión de proteínas de membrana recombinantes en Escherichia coli basada en la fusión a la proteína verde fluorescente.
La producción de proteínas de membrana recombinantes para estudios estructurales y funcionales sigue siendo técnicamente difícil debido a los bajos niveles de expresión y la inestabilidad inherente de muchas proteínas de la membrana una vez solubilizado en detergentes. Un protocolo se describe que combina la ligadura de la clonación independiente de proteínas de membrana como fusiones de GFP con la expresión en Escherichia coli detectadas por fluorescencia de GFP. Esto permite la detección de la construcción y expresión de la proteína de la membrana múltiple / variantes para identificar candidatos adecuados para una mayor inversión de tiempo y esfuerzo. El reportero GFP se utiliza en una pantalla primaria de expresión mediante la visualización de la fluorescencia de GFP después de la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). Las proteínas de membrana que muestran tanto un alto nivel de expresión con un mínimo de degradación como se indica por la ausencia de GFP libre, se seleccionan para una pantalla secundaria. Estas construcciones se escalan y una fracción total de membrana preparada y solubilizard en cuatro detergentes diferentes. Después de la ultracentrifugación para eliminar el material insoluble en detergente, los lisados se analizaron por cromatografía de exclusión de tamaño de detección de fluorescencia (FSEC). Monitorización del perfil de exclusión de tamaño por la fluorescencia de GFP proporciona información sobre el mono-dispersidad y la integridad de las proteínas de membrana en diferentes detergentes. Proteína: combinaciones de detergente que eluyen con un pico simétrico con poca o ninguna libre de GFP y la agregación mínima son candidatos para la posterior purificación. Utilizando la metodología anterior, la expresión heteróloga en E. Se analizó coli de SED (forma, el alargamiento, la división y la esporulación) proteínas de 47 especies diferentes de bacterias. Estas proteínas tienen típicamente diez dominios transmembrana y son esenciales para la división celular. Los resultados muestran que la producción de los SED orthologues en E. coli fue muy variable con respecto a los niveles de expresión y la integridad de las proteínas de fusión GFP. El i experimentodentified un subconjunto para una mayor investigación.
Se ha estimado que las proteínas de membrana representan aproximadamente el 20-30% de los genes codificados en todos los genomas secuenciados 1, incluyendo el genoma humano 2. Dado su papel fundamental en muchos procesos biológicos, por ejemplo, el transporte de metabolitos, generación de energía y como dianas de medicamentos, hay un gran interés en la determinación de su estructura tridimensional. Sin embargo en comparación con las proteínas solubles, proteínas de membrana son muy poco representadas en el Protein Data Bank. De hecho, de las 99.624 estructuras liberadas en el AP ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) sólo 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) se clasifican como proteínas de membrana. Esto refleja las dificultades técnicas de trabajar con proteínas de membrana que se expresan naturalmente en niveles relativamente bajos; rodopsina es una de las pocas excepciones 3,4. La sobreexpresión de la versión recombinantes en células heterólogas a menudo resulta en mal plegamiento y la mala orientación a la membrana que limita el nivel global de producción. Seleccionar el mejor detergente para la extracción y solubilización de una proteína de membrana, una vez expresada hace posterior purificación difícil y requiere la optimización cuidadosa.
Escherichia coli sigue siendo el huésped de expresión más comúnmente utilizado para proteínas de membrana que representan el 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) de las estructuras resuelto hasta la fecha, que son casi exclusivamente a partir de fuentes bacterianas. Específico E. cepas de E. coli, C41 (DE3) y C43 (DE3), se han aislado que no conducen a la sobreexpresión de proteínas de la membrana y por lo tanto evitar los efectos de la toxicidad observada en otros BL21 cepas de 5,6. Ajuste del nivel de expresión de proteína de membrana recombinante parece ser crítica para optimizar el nivel de producción de 6,7.
<p class="Jove_content"> En muchos casos, la producción exitosa de proteínas de membrana para la determinación de la estructura ha requerido la evaluación de varias versiones incluyendo amino y deleciones carboxi-terminal, múltiples orthologues para explotar variación de la secuencia natural y diferentes proteínas de fusión 6.8. Por lo tanto, un método para la detección expresión de múltiples proteínas de la membrana en paralelo es esencial. Un enfoque comúnmente utilizado es fusionar la proteína a proteína verde fluorescente (GFP) de expresión que permite realizar un seguimiento sin la necesidad de purificar la proteína. De esta manera, la información sobre el nivel de expresión, la estabilidad y el comportamiento en diferentes detergentes se puede evaluar con pequeñas cantidades de material sin purificar 9-12.En este artículo se describe un protocolo eficiente para la detección de clonación y expresión de proteínas de membrana en E. coli usando la fusión de GFP como reportero de la producción y la posterior caracterización de detergente: borrador proteínaReflejos (Figura 1).
En el protocolo descrito en este artículo, la ligadura de la clonación en un vector independiente reportero GFP se combina con detección de fluorescencia para detectar rápidamente la expresión relativa de múltiples proteínas de la membrana en E. coli. Los vectores se pueden hacer en cuatro días de trabajo con expresión de cribado primario de tomar una semana más. En-gel fluorescencia de lisados detergentes de células enteras se utiliza para clasificar expresión golpea para su posterior análisis en una pantalla secundaria. La pantalla de expresión primaria tal como se presenta no requiere ningún equipo especializado, aparte de un incubador agitador adecuado para el cultivo de células en bloques de pocillos profundos. Todas las otras manipulaciones líquido en la que placas de 96 pocillos SBS puede llevarse a cabo utilizando pipetas multicanal. El protocolo puede modificarse fácilmente para incluir otras cepas de E. coli cultivadas bajo diferentes condiciones de expresión (por ejemplo, temperatura baja). En el caso de la LEMO21 (DE3) titulando el nivel de ramnosa (de 0 a 2,0 mM)añadido para modular la tasa de transcripción puede aumentar el nivel de expresión de algunas proteínas de la membrana 7. Detergentes distintos de DDM podrían ser utilizados para la extracción en la pantalla primaria aunque detergentes más duras pueden solubilizar proteínas a partir de cuerpos de inclusión y por lo tanto dar falsos positivos. Es evidente que la más elaborada la pantalla inicial se convierte, el tiempo del experimento más.
La pantalla secundaria implica la preparación de una fracción de membrana total a partir de los éxitos de expresión identificados en la pantalla primaria. Este es un paso crítico, ya que confirmar la localización de las proteínas de fusión a la membrana de la E. células de E. coli. La extracción subsiguiente de la proteína de fusión GFP en diferentes detergentes se controla por el tamaño de cromatografía de exclusión por fluorescencia detectada del material solubilizado para evaluar la mono-dispersidad de los complejos proteína-detergente. Este es otro paso importante, ya que identifica el detergente más adecuado parasolubilización de la proteína de membrana para el procesamiento aguas abajo subsiguiente. Sin embargo, la experiencia demuestra que una mayor optimización de la selección del detergente (s) puede ser necesaria durante la purificación y cristalización. Evidencia de un comportamiento uniforme en diferentes detergentes incluidas las micelas con un tamaño relativamente pequeño (por ejemplo, LDAO) parece ser un buen indicador de la propensión a formar así cristales de difracción por lo menos para las proteínas de membrana procariotas 14. En este sentido, el perfil se muestra para la proteína de la membrana en la Figura 2B aparece altamente favorable.
La principal ventaja de utilizar un reportero GFP es que da una rápida lectura de expresión en muestras sin purificar. Una desventaja es que la proteína de fusión GFP tiene que ser eliminado durante la purificación de la proteína para la cristalización. En el caso de los vectores utilizados aquí, un sitio de proteasa 3C de rinovirus permite la escisión de la GFP. Alternativamente, es sencillopara volver a clonar proteínas candidatos, identificados en la pantalla, en vectores que sólo añaden una polihistidina u otro marcador de afinidad para la purificación posterior. Esto supone que la fusión a GFP no es necesaria para la expresión. La principal alternativa al uso de la fusión a GFP para la detección de la expresión de proteína de membrana y solubilización es añadir sólo una etiqueta de histidina. Sin embargo, este enfoque requiere típicamente a partir de una fracción de membrana 15 que para la evaluación de muchas variantes se convertiría consume mucho tiempo.
En resumen, el objetivo principal del protocolo descrito en este artículo es para permitir que un gran número de secuencia de la proteína de membrana variantes de ser evaluado rápidamente en términos de expresión y solubilización de detergente y priorizado para el análisis más profundo.
The authors have nothing to disclose.
The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).
Name of Material | Company | Catalog Number |
pOPIN-N-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
pOPINE-3C-GFP | addgene (www.addgene.org) | |
C41(DE3)pLysS | Lucigen (http://lucigen.com/ | 60444-1 |
LEMO21(DE3) | New England Biolabs | C2528H |
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns | Clontech/Takara | 639688 |
Power broth | Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) | MD12-106-1 |
Protease Inhibitor tablets | Roche | 11697498001 |
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma-Aldrich | 83650 |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | DN25 |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 |
Cholesterol hemisuccinate | Sigma-Aldrich | C6512 |
CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) | Anatrace | C326 |
DDM ( n-Dodecyl ß-maltoside ) | Generon | D97002 |
DM (n-Decyl ß-maltoside) | Generon | D99003 |
LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) | Generon | D71111 |
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul | Thermo Scientific | 4672030 |
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200µL LTS Spacer | Anachem | LA6-300XLS |
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20µL LTS | Anachem | L8-20XLSPLUS |
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200µL LTS Tip | Anachem | L8-1200XLS |
24 well V bottom deep well blocks | Porvair sciences | 360115 |
BenchMark Fluorescent Protein Standard | Life Technologies | LC5928 |
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well | Life Technologies | WG1203BOX |
XCell4 SureLock Midi-Cell | Life Technologies | WR0100 |
Vibramax 100 | Heidolph | 544-21200-00 |
Tension rollers attachment | Heidolph | 549-81000-00 |
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor | Beckman Coulter | 393253 |
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor | Beckman Coulter | 393315 |
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors | Beckman Coulter | B14535 |
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector | Shimadzu | |
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 |
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs | Shel Lab | SSI5R-HS |
Innova44R incubator | New Brunswick /Eppendorf | Innova44R |
TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI) | Constant systems | PL083016 |
L-Rhamnose monohydrate | Sigma | 83650 |