Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב Published: January 6, 2015 doi: 10.3791/52357
Automatic Translation
1, 1, 1, 2,3, 4, 4, 3, 4, 1
1Oxford Protein Production Facility, Research Complex at Harwell, 2Protein Crystallography Group, Ruhr University, 3MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge Biomedical Campus, 4Membrane Protein Laboratory, Diamond Light Source

Summary

גישה יעילה לבדיקות סקר לאיתור הביטוי של חלבונים בממברנה רקומביננטי בcoli Escherichia מבוסס על היתוך לחלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת.

Abstract

הייצור של חלבונים בממברנה רקומביננטי ללימודים מבניים ותפקודיים נותר מאתגר מבחינה טכנית בשל רמות נמוכות של ביטוי וחוסר היציבות הטבועה של חלבונים בממברנה רבות solubilized פעם אחת בחומרי ניקוי. פרוטוקול מתואר המשלב שיבוט עצמאי קשירה של חלבונים בממברנה כשילובי GFP עם ביטוי בcoli Escherichia זוהה על ידי הקרינה GFP. זה מאפשר הקרנת הבנייה וביטוי חלבון קרום מרובה של / גרסאות לזהות מועמדים מתאימים להשקעה נוספת של זמן ומאמץ. כתב ה- GFP משמש במסך ראשי של ביטוי על ידי הדמיה הקרינה GFP הבא אלקטרופורזה SDS polyacrylamide ג'ל (SDS-PAGE). חלבוני קרום שמראים שתי רמת ביטוי גבוהה עם השפלה מינימום כפי שעולה מהעדר GFP החופשי, נבחרו למסך המשני. מבנים אלה הם מדורגים והכין כולל שבריר קרום וsolubilizeד בארבעה חומרי ניקוי שונים. בעקבות ultracentrifugation כדי להסיר חומר ניקוי-מסיס, lysates מנותחות כרומטוגרפיה גילוי הקרינה הדרת גודל (FSEC). ניטור פרופיל הדרת גודל על ידי הקרינה GFP מספק מידע על מונו-dispersity והשלמות של החלבונים בממברנה בחומרי ניקוי שונים. חלבון: שילובי חומרי ניקוי שelute עם שיא סימטרי עם GFP מעט או ללא תשלום וצבירת מינימום הם מועמדים לטיהור שלאחר מכן. שימוש במתודולוגיה לעיל, ביטוי Heterologous בE. coli של SED (צורה, התארכות, החלוקה, ונִבִיגָה) חלבונים מ -47 זנים שונים של חיידקים נותח. יש לי חלבונים אלה בדרך כלל עשרה תחומים הטרנסממברני וחיוניים לחלוקת תאים. התוצאות מראות כי הייצור של orthologues SEDs בE. coli היה משתנה מאוד ביחס לרמות הביטוי ושלמות של חלבוני היתוך GFP. אני הניסויdentified משנה לחקירה נוספת.

Introduction

הערכה הוא כי חלבוני קרום מהווים כ 20-30% מהגנים המקודדים בכל הגנום רצף 1, כוללים את הגנום האנושי 2. בהתחשב בתפקידם הקריטי בתהליכים ביולוגיים רבים, למשל תחבורה של מטבוליטים, דור אנרגיה וכמטרה לתרופות, יש עניין רב בקביעת המבנה התל ממדים שלהם. עם זאת בהשוואה לחלבונים מסיסים, חלבוני קרום מאוד בחלבון נתוני הבנק תחת הייצוג. למעשה, של 99624 המבנים שוחררו בPDB (http://www.rcsb.org/pdb/) רק 471 (http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/) מסווגים כחלבוני קרום. זה משקף את הקשיים הטכניים של עבודה עם חלבוני הקרום שבאים לידי ביטוי באופן טבעי ברמות נמוכות יחסית; רודופסין הוא אחד מכמה יוצאים מן הכלל 3,4. ביטוי יתר של גרסת רקומביננטי ים בתאי Heterologous לעתים קרובות תוצאות misfolding ומיקוד עניים הקרום המגביל את הרמה הכללית של ייצור. בחירת חומר הניקוי הטוב ביותר להפקה וsolubilization של חלבון קרום הביע פעם עושה טיהור שלאחר מכן קשה ודורשת אופטימיזציה זהירה.

coli Escherichia נשאר מארח הביטוי הנפוץ ביותר לחלבוני קרום והיוו 72% (http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/) של מבנים נפתרו עד היום שהם כמעט אך ורק ממקורות חיידקים. E. הספציפי זני coli, C41 (DE3) וC43 (DE3), היו מבודדים שאינו מובילים לביטוי היתר של חלבונים בממברנה ולכן להימנע מההשפעות של הרעילות נצפתה עבור BL21 אחר זני 5,6. כוונון רמת ביטוי חלבון קרום רקומביננטי נראה קריטי לייעול רמת הייצור 6,7.

"Jove_content"> במקרים רבים ייצור מוצלח של חלבונים בממברנה לקביעת מבנה דרש ההערכה של מספר גרסאות כוללים amino- ומחיקות carboxy-מסוף, orthologues מרובה לנצל וריאציה רצף טבעית וחלבוני היתוך שונים 6-8. לכן, שיטה להקרנת הביטוי של חלבונים בממברנה מרובות במקביל היא חיונית. גישה אחת נפוץ היא למזג את החלבון לחלבון פלואורסצנטי ירוק ביטוי (GFP) המאפשר להיות במעקב ללא הצורך לטהר את החלבון. בדרך זו, מידע על רמת ביטוי, יציבות והתנהגות בחומרי ניקוי שונה ניתן להעריך עם כמויות קטנות של חומר מטוהר un 9-12.

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול יעיל לסינון שיבוט וביטוי של חלבונים בממברנה בE. coli באמצעות היתוך GFP ככתב של ייצור והאפיון הבא של חומרי ניקוי: comp חלבוןlexes (איור 1).

Protocol

1. בנייה של וקטורי ביטוי

  1. שימוש PCR עירוי השיבוט לבנות עד 96 פלסמידים ביטוי במקביל באמצעות הווקטורים pOPINE-3C-GFP וpOPIN-N-GFP שיוסיפו או שילובי GFP-His6 cleavable C-מסוף או N-terminal לרצפי 13 בהתאמה.
    הערה: הבחירה של וקטור מוכתבת על ידי הטופולוגיה של החלבון מאז GFP צריך לבוא לידי ביטוי בcytosol, ובכך, לחלבון בעל N-הסופי cytosolic ו- C-הסופי תאי היינו להשתמש pOPIN-N-GFP ול N-הסופי תאי ו- C-הסופי cytosolic בהיינו להשתמש pOPINE-3C-GFP. איפה שני termini הוא cytosolic היינו להשתמש pOPINE-3C-GFP, אלא אם כן יש סיבה פונקציונלית לא לתייג C-הסופי.
  2. להגביר את רצפי DNA המקודדים את החלבונים בממברנה עם פריימרים המאגדים את הסיומות הבאות מוצגות:
    pOPINE-3C-GFP (פריימר קדימה - AGGAGATATACCATG; לאחור תחל - CAGAACTTCCAGTTT) וpOPIN-N-GFP (פריימר קדימה - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; לאחור תחל - ATGGTCTAGAAAGCTTTA).
  3. לנתח את תגובת PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose. ברגע שמוצרי ה- PCR נקיים התקבלו, להוסיף 5 U DpnI היטב כל אחד (לפצות ב -5 μl של חיץ תגובת 1x DpnI). לטהר את מוצרי ה- PCR באמצעות חרוזים מגנטיים בפורמט 96-היטב.
    הערה: DpnI מתווסף להסיר את וקטור התבנית; צעד זה אינו נחוץ אם הדנ"א הגנומי משמש כתבנית.
  4. הוסף 1 μl (100 ng) של הווקטור לינארית המתאים היטב בכל צלחת PCR.
  5. באמצעות x תוספת pipettor רב-ערוצי μl של PCR המטוהר להכניס לבארות המתאימות של צלחת PCR. להבטיח כי כל המוצרים הם בטווח של 10-250 ng.
  6. להוסיף μl (9-x) של מים אל הבאר ולהעביר את כל 10 μl לצינור המכיל מגיב ב- היתוך היבש למטה. השאר למשך 30 שניות.
  7. מערבבים תוכן בקצרה על ידי pipetting מעלה ומטה. העברההתגובות חזרה לצלחת PCR המקורית והחותם.
  8. דגירה של 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס בthermocycler.
  9. מייד להעביר את התגובות לקרח בהקדם התגובה היא להשלים ולהוסיף 40 μl של TE (10 מ"מ טריס, pH 8.0, 1 mM EDTA).
  10. להקפיא מייד או להפוך לתאים מוסמכים. לשינוי, להשתמש 3 μl של התגובה מדוללת ל-50 aliquot μl גבוה כשירות (> 5 x 10 9 transformants / מיקרוגרם) E. המוסמך תאי coli.
  11. הוסף 1 מיליליטר של אגר LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin לכל טוב של צלחת תרבית רקמת 24 גם (לשיבוט, להכין בארות עבור 2 x מספר מבנים).
  12. בעקבות תוצאה, בעקבות צלחת תולדה מתוך 25 μl ו -25 μl של 1 ב 5 דילול של התרבות על אגר המכילים צלחות תרבית רקמת 24 גם.
  13. מורחים את התאים בעדינות על ידי הטיית הצלחת.
  14. ייבש את הצלחת עם המכסה במשך 10-15 דקות ב 37 ° C או בפלהמכסה המנוע w בטמפרטורת חדר.
  15. החזר את המכסה ולהפוך את צלחת דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס.
  16. פיק שתי מושבות ומיני הכנת הווקטורים.
  17. PCR לוודא את המבנים באמצעות פריימר המבנה הספציפי ההפוך ופריימר וקטור ספציפי קדימה (למשל GG TAG pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA).

2. שינוי של א ' זני Xpression coli E

הערה: לפני ביצוע פרוטוקול זה, א ' תאים מוסמכים coli נעשים, aliquotted ומאוחסנים קפוא ב -80 ° C כפי שתוארו לעיל 13. ביטוי חלבון קרום מוקרן באופן שיגרתי בשני זנים, Lemo21 (DE3) וC41 (DE3) pLysS. כדי לסייע פרשנות של תוצאותיה יכולות להיות מועילות לכלול שליטה חיובית, למשל פלסמיד GFP להביע או חלבון קרום התמזג GFP הידוע להביע ובקרת וקטור ריק שלילית.

  1. להפשיר אותי quotted E. coli על קרח. הוסף 3 μl של פלסמיד ביטוי הכין מיני לכל aliquot של תאים מוסמכים.
  2. דגירה לערבב על קרח למשך 30 דקות.
  3. חום-לזעזע את התאים למשך 30 שניות על 42 מעלות צלזיוס.
  4. לאפשר לתאים להתאושש על קרח למשך 2 דקות ולאחר מכן להוסיף 300 μl של מרק כוח על צינור אחד.
  5. דגירה עבור שעה 1 בחממה סטטי 37 ° C.
  6. הכן את אגר LB בצלחת תרבית רקמת 24 גם, בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin ו -35 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol. להוסיף rhamnose לריכוז סופי של 0.25 מ"מ לבארות המכילות Lemo21 (DE3).
    הערה: אם המוצר עשוי להיות רעיל הבארות המכילות C41 ניתן להשלים (DE3) pLysS עם 1% (w / v) גלוקוז.
  7. העברה 30 μl של תאים מתערובת השינוי לצלחות LB אגר. מורחים ולייבש את הצלחת כפי שמתואר ב1.13-1.15.

3. הכנת תרבויות Starter לילה

= "Jove_content"> הערה: תמיד להכין תרבויות לילה ביום שלאחר שינוי לא מצלחת שינוי ישנה.

  1. להוסיף מרק 0.7 מיליליטר כוח היטב בכל 96 היטב עמוק היטב צלחת בתוספת 50 מיקרוגרם carbenicillin / מיליליטר ו -35 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol. להוסיף rhamnose לבארות המכילות Lemo21 (DE3) לריכוז סופי של 0.25 מ"מ. לחלופין, להשלים C41 pLysS (DE3) עם 1% (w / v) גלוקוז; ראה לעיל (הערה 2.6).
  2. פיק מושבה אחת מצלחות השינוי בין לילה לכל אחד. לאטום את הבלוק עם חותם גז חדיר.
  3. לנער את הבלוק ב 250 סל"ד באינקובטור עם זריקה גדולה (למשל מסלול 25 מ"מ) או ב 600 סל"ד באינקובטור עם זריקה קטנה (כגון מסלול 4.3 מ"מ) על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

4. צמיחה ואינדוקציה של תרבויות

  1. להוסיף 3 מיליליטר של מרק כוח בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin ו -35 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol לכל well של 24 גם צלחת עמוקה היטב. הוספת L-rhamnose (וגלוקוז) כמפורט בסעיף 3.1. השתמש 3 מיליליטר של תרבות, כדי לאפשר קצירה בשני עותקים, ולאפשר לכמה אידוי של מים דרך האטם החדיר הגז.
  2. הגדר את תרבויות ביטוי על ידי הוספת 150 μl של Lemo21 (DE3) או C41 (DE3) pLysS תרבויות לילה היטב בכל הלוקים עמוקים היטב 24 גם.
  3. לנער את הקוביות על 37 מעלות צלזיוס עד OD הממוצע ב595 ננומטר הוא ~ 0.5 באמצעות הצלחת.
  4. לגרום לביטוי על ידי הוספת IPTG לתרבויות לריכוז סופי של 1.0 מ"מ IPTG.
  5. לגדול תרבויות הלילה (שעות 18-20) עם הרעד ב 20 מעלות צלזיוס.

5. ניתוח של ביטוי על ידי In-ג'ל הקרינה

  1. קציר בשני עותקים. העברת 1 מיליליטר של תרבות מכל טוב לכיכר גם, תחתון חרוטי, 96, גם בלוק עמוק היטב.
    הערה: קציר בשני עותקים במקרה של שבירה של הגוש או כדי לאפשר הבדיקה של משתנve חומר ניקוי אם תרצה בכך.
  2. לאטום את הלוקים ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב6,000 XG במשך 10 דקות.
  3. הפוך את הבלוק ולמזוג התקשורת. הקש על הבלוק בעדינות על גבי מגבת נייר לניקוז תקשורת שנותרה.
  4. לאטום את הצלחות ולאחסן ב -80 ° C למשך תקופה מינימאלית של 20 דקות. לחלופין, לעזוב את הניסוי בשלב זה ולחסום מעובד כאשר נוח.
  5. De-כפור כדורים במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
  6. השתמש באחת פיפטה רבת-ערוצית או ייקר מסלולית (1,000 סל"ד במשך 10 דקות) בשעה 4 ° C כדי resuspend התאים לחלוטין ב -200 μl של חיץ תמוגה (50 v 1% מ"מ לאא 2 PO 4, 300 מ"מ NaCl 10 מ"מ Imidazole / V Tween 20, להתאים את ה- pH ל 8.0 באמצעות NaOH).
  7. הוסף 20 μl של פתרון DLPI (20 μl DNaseI (4,000 יחידות / מיליליטר), 20 מ"ג יזוזים, ומעכבי פרוטאז קוקטייל 20 μl בנפח סופי של 2 מיליליטר של מים). דגירה של 10 דקות עם הרעד (~ 1000 סל"ד) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
    8. n -Dodecyl β-D-maltoside (DDM).
  8. דגירה של 60 דקות עם הרעד (~ 1000 סל"ד) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
  9. צנטריפוגה הבלוק העמוק היטב ב6,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  10. העברת 10 μl של lysate פינה לצלחת microtitre ולהוסיף 10 μl של חיץ SDS טעינת ג'ל עמוד (100 מ"מ טריס, pH 6.8, 4% w / v SDS, 0.2% w / v β הכחולה, 10% v / v bromophenol -mercaptoethanol, ו -20% v גליצרול / V). זהירות! אין להרתיח את המדגם.
  11. טען 10 μl של מדגם מצעד 5.11 / גם על ג'ל SDS עמוד (ים) ולרוץ ב100-120 V (מתח קבוע) בחדר קר עד החזית לצבוע מגיעה לתחתית (2-2.5 שעות).
  12. מניחים את הג'ל על תרמי (למשל עם מסנן כחול-אור כדי לזהות את חלבוני היתוך GFP). זמן החשיפה נבחר על מנת להבטיח שהלהקות המבריקה לא רוויות.

6. Scale-up של תרביות תאים

  1. להפוך aliquot של מוסמך
  2. פיק מושבה לתוך 10 מיליליטר של מרק כוח (בתוספת כאמור בסעיף 3) ולגדול לילה בשעה 37 ° C.
  3. לדלל 5 מיליליטר של תרבות הלילה לתוך 500 מיליליטר מרק כוח.
  4. לגדול עם הרועד בסל"ד 250 על 37 מעלות צלזיוס עד OD ב 595 ננומטר הוא ~ 0.5.
  5. לגרום לביטוי על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של 1.0 מ"מ.
  6. לגדול בין לילה עם הרועד ב 250 סל"ד ב 20 ° C.
  7. קציר תאים על ידי צנטריפוגה בXG 5000 במשך 15 דקות.
  8. supernatant מחק. ניתן לאחסן כדורי תא ב -80 ° C.

7. הכנה של ממברנות

  1. תאי הפשרה (במידת צורך) בטמפרטורת חדר וגלול ב1x PBS pH 7.5 בנפח של 5 מ"ל לגרם של תא גלולה; הגדל את הנפח לפי צורך עד הצמיגות מפחיתה לעקביות נזלת. הוסף MgCl 2 לריכוז סופי של 1 מ"מ, DNAse אני לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל ואחדטרום ארוז לוח מעכב פרוטאז לכל 20 גרם של תא גלולה. לשבור תאים פתוחים באמצעות משבש תא מקורר בלחץ של 30 kpsi.
  2. גלולה התאים והפסולת השלמים ב30,000 גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העברת supernatant לצינור אולטרה-צנטריפוגה.
  3. לאסוף את שבר הקרום הכולל ידי ספינינג את supernatant באולטרה-צנטריפוגות ב 200,000 XG עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס.
  4. בטל supernatant.
  5. להשעות מחדש את גלולה הקרום בקר כקרח 10 מיליליטר PBS pH 7.5 באמצעות homogenizer תא. 1 מיליליטר resuspended קרומים נדרשים לכל חומר ניקוי. לחלופין, בשלב זה, הבזק להקפיא את ההשעיה הקרום בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C.

8. solubilization וניתוח של שבר ממברנה

  1. חלק קרום הפשרה (במידת צורך), ולכל חומר ניקוי שישמש לsolubilization, 900 μl aliquot של ההשעיה הקרום ל1.5 מיליליטר מיקרו-centrifu polyallomerצינור ge.
  2. הוספה של כל חומר ניקוי מוכן טרי 100 μl (10% w / v פתרונות של DDM, DM, Cymal-6 וLDAO) לריכוז סופי של 1% לצינור 1.5 מיליליטר שצוין. לsolubilization של hemisuccinate אוקריוטים חלבוני קרום כולסטרול (0.2% ריכוז סופי) ניתן להוסיף לחומרי הניקוי.
  3. דגירה התערובות על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם תסיסה עדינה.
  4. גלולה החלק בלתי מסיס חומר הניקוי עם אולטרה-צנטריפוגה ספסל עליון, צינורות הבטחה הם חצי מלא לפחות, ב150,000 גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות ולשמור supernatant.
    הערה: היעילות של solubilization חומרי הניקוי ניתן להעריך באמצעות קורא צלחת ניאון על ידי מדידת הקרינה GFP של קרומי solubilized עם החלק בלתי מסיס חומר הניקוי resuspended באותו הנפח של PBS.
  5. ניתוח חד-dispersity של חומרי הניקוי השונים: קומפלקסי חלבוני קרום באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל זוהה הקרינה (FSEC).
  6. לניתוח FSEC, לאזן עמודת הדרת גודל עם מגוון רחב חלוקה, למשל 5000 ל 5,000,000 במשקל מולקולרי, עם הפעלת מאגר (20 מ"מ טריס pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, DDM 0.03%) בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר / דקה . השתמש במאגר זה עבור כל הדגימות, כלומר הוא לא השתנה במשך כל חומר ניקוי שנבדק.
  7. הזרק של קרומי solubilized 100 μl על הטור בקצב זרימה של 0.3 מיליליטר / דקה. צג פרופיל elution באמצעות אופטיקה הקרינה (עירור ב 488 ננומטר פליטה ב 512 ננומטר). אם צג הקרינה מוטבעת אינו זמין, לאסוף את השברים ולקרוא את הקרינה בקורא צלחת.
  8. יבוא elution נפח ונתוני עוצמת הקרינה לתכנית גיליון אלקטרוני לתצוגה גרפית.
  9. נתח את יתרת חומר קרום solubilized ידי הקרינה בג'ל כאמור בסעיף 5.

Representative Results

משפחת SEDS של חלבונים (צורה, התארכות, החלוקה, ונִבִיגָה) היא חיונית לחלוקת תאי חיידקים. יש לי חלבונים נפרד אלו בדרך כלל עשרה תחומים הטרנסממברני עם שני termini אמינו וcarboxy בתוך התא. כדי להדגים את הפרוטוקול שתואר לעיל, 47 orthologues SEDs היו משובט לתוך הווקטור pOPINE-3C-eGFP. מסך ביטוי בקנה מידה קטן של המבנים בוצע בשני זני .coli E, Lemo21 (DE3) גדל בנוכחות של 0.25 מ"מ rhamnose לחסום ביטוי דולף וC41 (DE3) pLysS, המשמש באופן שיגרתי לביטוי של קרום חלבונים 5-8.

lysates דטרגנט solubilized של תרבויות מושרה נותח על ידי אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide. שימוש בקרינה ב- ג'ל לדמיין חלבוני היתוך GFP הביעו הראו כי בין שני הזנים 38 מתוך מבני SEDs 47 הופקו. מעניין היו הבדלים בין שני זני הביטוי. של 38 הביעו בונה, רק 18 יוצרו בשני הזנים, 14 לידי ביטוי רק בLemo21 (DE3) ו -6 רק בC41 (DE3) pLysS. בסך הכל, היה שיעור הצלחה גבוה יותר עבור Lemo21 (DE3) בהשוואה לpLysS C41 (DE3) (38 לעומת 24). עם זאת התצפית שחלבונים מסוימים הופיעו להיות ספציפי זן אומרת שהקרנה בשניהם היא שימושית.

נציגי נתונים עבור 24 מ -47 SEDs מבנים מוצגים באיור 1. העצמה של הלהקות נותנת אינדיקציה לרמה של ביטוי, למשל חלבון ההיתוך בC4 גם באיור 1 א ו -1 B באה לידי ביטוי גם בשני הזנים עם זאת נוסף להקות משקל מולקולריות נמוכות מצביעות על כך שהחלבון הוא מושפל באופן חלקי. בנתיבים רבים יש להקה שמתאימה בגודלו לGFP לבד. הערכה איכותית של היושרה של החלבון יכול להתבצע על ידי הסתכלות על עוצמת חלבון היתוך ביחס לGFP החופשי;למשל G4 וH4 שבורים לחלוטין עד GFP החופשי בC41 (DE3) pLysS (איור 1) ואילו בLemo21 (DE3) יש כמה חלבון שלם (איור 1 א). במשך 14 מתוך 38 החלבונים הביעו את עוצמת להקת GFP החופשית דומה לזה של חלבון ההיתוך, במשך 21 עוצמת להקת GFP החופשי היא גדולה יותר מזה של חלבון ההיתוך ומיעוט של חלבוני ההיתוך (3 / 38 הביעו) למשל F6 וG6 באיור 1 א יש לי GFP החופשי קטן יחסית בהשוואה לחלבון ההיתוך.

שניים מהמבנים שמתבטאים היטב בB5 המסך הראשי (הלהקות בעוצמה גבוהה לGFP החופשי וחלבוני היתוך) וG6 (קטן GFP חינם) באו לידי ביטוי וחלק קרום כולל שהוכן מ -500 מיליליטר תרבות תא. קרומי Resuspended חולקו לaliquots ונותחו על ידי כרומטוגרפיה-זוהה הקרינה הדרת גודל (FSEC). פרופילי FSEC מוצגים בfigur2A הדואר ו2B בהתאמה ולהראות ששני חלבוני SEDs מתנהגים באופן שונה בארבעת חומרי הניקוי שנבדק. במקרה אחד (איור 2 א: B5 מדגם) החלבון נתן רק שיא סימטרי עם צבירה קטנה בDDM שלכן יהיה בחומרי הניקוי מבחירה לטיהור שלאחר מכן. לעומת זאת חלבון היתוך האחר (איור 2: G6 מדגם) נתנו פרופיל דומה בכל חומרי הניקוי שנבדק.

איור 1
איור 1: תרשים של זרימת עבודה לסינון ביטוי חלבון קרום בE. coli באמצעות כתב GFP.

איור 2
איור 2: מסך ראשי של ביטוי חלבון קרום באמצעות הקרינה בג'ל. א ' תאי coli נותחו על ידי SDS-PAGE וג'לים צילמו באמצעות תאורת Epi הכחול ומסנן 530/28. התוצאות מוצגות למשך 24 מבנים (שכותרת A4-H6 המבוסס על מיקומם בצלחת 96-היטב). העמדות של הלהקות לGFP חופשי וחלבוני היתוך GFP מצוינות. חלבונים () באו לידי ביטוי בLemo21 (DE3). (ב) חלבונים לידי ביטוי בC41 (DE3) pLysS.

איור 3
איור 3:. מסך משני של ביטוי חלבון קרום באמצעות כרומטוגרפיה-זוהה הקרינה הדרת גודל (FSEC) שברים קרום סה"כ הוצאו בארבעה חומרי ניקוי שונים וחלבוני קרום solubilized נותחו על ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל באמצעות מערכת FPLC מצמידים את גלאי הקרינה. פרופילי FSEC ל() B5 חלבון קרום ו( B)

Discussion

בפרוטוקול המתואר במאמר זה, שיבוט עצמאי קשירה לתוך וקטור כתב GFP הוא בשילוב עם גילוי הקרינה להקרין את הביטוי היחסי של חלבונים בממברנה המרובים במהירות E. coli. וקטורים יכולים להתבצע בארבעה ימי עבודה בהקרנת ביטוי ראשוני לוקחת שבוע נוסף. בג'ל הקרינה של lysates בחומרי ניקוי מכל תאים המשמשת לדירוג ביטוי פוגע לניתוח נוסף במסך המשני. מסך הביטוי העיקרי כפי שהוצג אינו דורש כל ציוד מומחה מלבד חממה ייקר מתאימה לגידול תאים בלוקים גם עמוקים. כל טיפול הנוזל האחר שקשור ללוחיות SBS 96-גם יכול להתבצע באמצעות טפטפות רבת-ערוצית. הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לכלול זני coli אחרים E. גדלו בתנאים שונים ביטוי (למשל טמפרטורה נמוכה יותר). במקרה של LEMO21 (DE3) titrating רמת rhamnose (0-2.0 מ"מ)הוסיף לווסת את קצב השעתוק יכול להגדיל את רמת ביטוי של חלבונים מסוימים קרום 7. חומרי ניקוי אחרים מאשר DDM יכול לשמש להפקה במסך הראשי אם כי חומרי ניקוי חריפים יותר עשוי solubilize חלבוני מגופי הכללה ולכן נותנים תוצאות חיוביות שגויות. ברור, יותר לפרט המסך הראשוני הופך, יותר ניסוי הזמן רב.

המסך המשני כרוך בהכנת חלק קרום מוחלט מלהיטי הביטוי שזוהו במסך הראשי. זהו צעד קריטי כפי שיאשר את הלוקליזציה של חלבוני היתוך הקרום של E. תאי coli. החילוץ הבא של חלבון היתוך GFP בחומרי ניקוי שונה מנוטר על ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל זוהה הקרינה של חומר solubilized להעריך את מונו-dispersity של מתחמי חומר ניקוי-חלבון. זהו עוד שלב קריטי שכן הוא מזהה את חומר הניקוי המתאים ביותר לsolubilization של חלבון הקרום לעיבוד במורד הזרם שלאחר מכן. עם זאת, ניסיון מראה כי אופטימיזציה נוספת של הבחירה של חומר ניקוי (ים) עדיין עשויה להידרש במהלך טיהור וגיבוש. ראיות להתנהגות אחידה בחומרי ניקוי שונים, כולל אלה עם גודל קטן יחסית micelle (למשל LDAO) נראית אינדיקטור טוב של נטייה ליצירת גם diffracting גבישים לפחות לחלבוני קרום פרוקריוטים 14. במובן זה הפרופיל מוצג לחלבון הקרום באיור 2 מופיע חיובי ביותר.

היתרון העיקרי של שימוש בכתב GFP הוא שזה נותן קריאה מתוך מהירה של ביטוי בדגימות המטוהר של האו"ם. חסרון הוא שחלבון היתוך GFP צריך להיות מוסר במהלך הטיהור של החלבון להתגבשות. במקרה של הווקטורים משמשים כאן, אתר פרוטאז rhinovirus 3C מאפשר מחשוף של GFP. לחלופין, זה פשוטמחדש שיבוט חלבוני מועמד, שזוהו במסך, לוקטורים שרק להוסיף polyhistidine או תג זיקה אחר לטיהור שלאחר מכן. זאת בהנחה שהיתוך GFP אין צורך לביטוי. התחליף העיקרי לשימוש בהיתוך GFP לגילוי של ביטוי חלבון הקרום וsolubilization הוא להוסיף רק תג היסטידין. עם זאת גישה זו בדרך כלל דורשת שמתחילה בשבריר קרום 15 שלהערכת גרסאות רבות היה להיות מאוד זמן רב.

לסיכום, המטרה העיקרית של הפרוטוקול המתואר במאמר זה היא לאפשר למספר גדול של רצף חלבון קרום גרסאות להיות מוערך במהירות במונחים של ביטוי וsolubilization חומרי הניקוי וסדר עדיפויות לניתוח מעמיק יותר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pOPIN-N-GFP addgene (www.addgene.org)
pOPINE-3C-GFP addgene (www.addgene.org)
C41(DE3)pLysS Lucigen (http://lucigen.com/) 60444-1
LEMO21(DE3) New England Biolabs C2528H
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns Clontech/Takara 639688
Power broth Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/) MD12-106-1
Protease Inhibitor tablets Roche 11697498001
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail  Roche 11836170001
L-Rhamnose monohydrate Sigma-Aldrich 83650
Protease Inhibitor Cocktail  Sigma-Aldrich P8849
DNAse 1 Sigma-Aldrich DN25
Lysozyme Sigma-Aldrich L7651
Cholesterol hemisuccinate Sigma-Aldrich C6512
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside) Anatrace C326
DDM (n-Dodecyl β-maltoside) Generon D97002
DM (n-Decyl β-maltoside) Generon D99003
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide) Generon D71111
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl Thermo Scientific  4672030
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer Anachem LA6-300XLS
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS Anachem L8-20XLSPLUS
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip Anachem L8-1200XLS
24 well V bottom deep well blocks Porvair sciences 360115
BenchMark Fluorescent Protein Standard Life Technologies LC5928
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well Life Technologies WG1203BOX
XCell4 SureLock Midi-Cell Life Technologies WR0100
Vibramax 100 Heidolph 544-21200-00
Tension rollers attachment Heidolph 549-81000-00
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor Beckman Coulter 393253
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor Beckman Coulter 393315
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors  Beckman Coulter B14535
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column GE Healthcare 17-5172-01 
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm Shel Lab  SSI5R-HS
Innova44R incubator New Brunswick /Eppendorf Innova44R
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi) Constant systems PL083016
L-Rhamnose monohydrate Sigma 83650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wallin, E., von Heijne, G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).
  3. Okada, T., et al. X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles. J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).
  4. Palczewski, K., et al. Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289 (5480), 739-745 (2000).
  5. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  6. Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
  7. Schlegel, S., et al. Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3). J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).
  8. Chun, E., et al. Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors. Structure. 20 (6), 967-976 (2012).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).
  11. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  12. Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).
  13. Busso, D., et al. Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study. J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).
  14. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  15. Low, C., et al. High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).

Tags

מיקרוביולוגיה גיליון 95 חלבוני קרום חלבון פלואורסצנטי ירוק גילוי הקרינה, הקרנת ביטוי
הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bird, L. E., Rada, H., Verma, A.,… More

Bird, L. E., Rada, H., Verma, A., Gasper, R., Birch, J., Jennions, M., Lӧwe, J., Moraes, I., Owens, R. J. Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (95), e52357, doi:10.3791/52357 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter