Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

مقايسة متعدد الكشف عن الملاريا بث البعوض

Published: February 28, 2015 doi: 10.3791/52385
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Abstract

ويضم المجمع الأنواع الأنوفيلة الغامبية الملاريا رئيسيا نقل البعوض في أفريقيا. لأن هذه الأنواع هي بهذه الأهمية الطبية، وعادة ما تتميز بعدة صفات باستخدام المقايسات الجزيئية للمساعدة في الدراسات الوبائية. وتشمل هذه الصفات تحديد الأنواع، ومقاومة الحشرات، حالة عدوى الطفيليات، وتفضيل المضيف. منذ السكان من مجمع الأنوفيلة الغامبية لا يمكن تمييزها شكليا، يتم استخدام سلسلة البوليميراز رد فعل (PCR) تقليديا لتحديد الأنواع. مرة واحدة ومن المعروف أن الأنواع، ويتم تنفيذ عدة فحوصات المصب بشكل روتيني لتوضيح المزيد من الخصائص. على سبيل المثال، والطفرات المعروفة باسم KDR في جين الفقرة تمنح مقاومة ضد DDT والمبيدات الحشرية البيروثرويدات. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام فحوصات انزيم مرتبط المناعي (ELISAs) أو المتصورة كشف DNA الطفيلي المقايسات PCR للكشف عن الطفيليات الموجودة في الأنسجة البعوض. وأخيرا، فإن combinatioن من PCR وتقييد انزيم هضم يمكن استخدامها لتوضيح تفضيل المضيف (على سبيل المثال، الإنسان مقابل دم الحيوانات) من خلال فحص وbloodmeal البعوض لDNA المضيف محددة. قمنا بتطوير فحص متعددة كشف (MDA) الذي يجمع بين كل من المقايسات المذكورة أعلاه في واحد متعدد 33SNPs التنميط الجيني رد فعل لمدة 96 أو 384 عينات في وقت واحد. لأن MDA يتضمن علامات متعددة الأنواع، والكشف عن المتصورة، وتحديد الدم المضيف، يتم تقليل احتمال توليد ايجابيات كاذبة أو السلبيات كثيرا من فحوصات السابقة التي تتضمن علامة واحدة فقط لكل سمة. هذا الاختبار قوي وبسيط يمكن الكشف عن هذه الصفات البعوض الرئيسية على نحو فعال من حيث التكلفة وفي جزء من الوقت من المقايسات القائمة.

Introduction

ارابينسيس الأنوفيليس، الأنوفيليس coluzzii والأنوفيلة الغامبية هي ناقلات الرئيسية المسؤولة عن انتقال الملاريا في أفريقيا 1. هذه الأنواع الثلاثة هي شكليا تمييزه 2 و يمكن إلا أن يكون ميزت من قبل المقايسات الجزيئية 3-9. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من المقايسات المصب أجريت بشكل روتيني لمساعدة الوراثة الوبائية والسكان الدراسات. وتشمل هذه (1) مقايسة التنميط الجيني لأنواع جديدة الجزر 10-12، (2) مقايسة التنميط الجيني الاعتراف تعدد الأشكال غير مرادفة في 1014 عشر من الأحماض الأمينية موقف كودون من الفقرة الجين (المقاومة تدق إلى أسفل، أو KDR، SNP) 13 -18، (3) كشف الطفيلي PCR 19-23، و (4) لفحص الحمض النووي المضيف محددة في midguts البعوض 24،25.

وضعنا مقايسة متعددة كشف (MDA) الذي يجمع بين كل هذه المقايسات إلى رد فعل واحد مع تعدد الإرسال مرماه من هدفalyzing الخصائص المهمة وبائيا لنواقل الملاريا في أفريقيا. ويشمل الفحص MDA علامات متعددة للكشف عن (1) أنواع (A. ارابينسيس، A. الغامبية، A. coluzzii، أو غيرها (أي من) ثلاثة)، (2) مقاومة الحشرات ممثلة في KDR تعدد الأشكال (سواء L1014F وL1014S) ، (3) وجود اثنين من طفيليات الملاريا الكبرى، المتصورة المنجلية وP. النشيطة، و (4) مصدر الدم من الطيور وستة المضيفين الثدييات.

تقليديا، أجريت هذه المقايسات في التفاعلات منفصلة البلمرة المتسلسل. عندما تتم كل هذه المقايسات باستخدام منصة PCR التقليدية، فإنه يتطلب إجراء فحوصات 8-10 PCR رد فعل والمرافق هلام الخطوات الكهربائي. كل رد فعل PCR الفردية من الإعداد إلى النتائج توثيق يأخذ 4-5 ساعة، في حين أن طريقة MDA المقدمة هنا يستغرق حوالي 5 ساعة في مجملها. وهذا يعادل وفورات بنسبة 90٪ في تكاليف العمالة وحدها. قدم MDA هنا يكلف 5 $لكل عينة إلى التركيب الوراثي جميع النيوكلوتايد 33. هذا هو إلى حد كبير أقل تكلفة من فحوصات القائم على هلام الاغاروز واحدة، والتي تكلف نحو 1،50 $ لكل عينة. ان فحوصات الكشف عن الخصائص التي تغطيها MDA تتطلب ما لا يقل عن 8-10 المقايسات القائم على هلام الاغاروز منفصلة بتكلفة 12-15 دولارا للعينة. وعلاوة على ذلك، فإن MDA يقلل كثيرا من فرصة لتوليد كاذبة إيجابية أو سلبية من خلال الاستفادة من ثلاثة على الأقل من علامات لكل الطفيليات أو مصدر المضيف الكشف.

منصة نحن المستخدمة لا يقتصر على نواقل الملاريا ولكن يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من التطبيقات مثل الطب، والطب البيطري، والبيولوجيا الأساسية 26-28. الدراسات جمعية أو علم الوراثة السكانية الدراسات التي تنطوي على كبير (في ترتيب 100S) عدد العينات تتطلب متعمقة المقايسات فعالة من حيث التكلفة لفحص علامات متعددة في وقت واحد. يمكن أن معظم الدراسات التي تستخدم اثنين أو أكثر من المقايسات PCR منفصلة تنفيذ MDA للحصول على نتائج أسرع وبتكلفة أقل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PCR التضخيم

  1. خلط جميع الاشعال PCR (انظر الجدول تكميلية S1) في microtube 1.5ml. كل SNP اثنين الاشعال (إلى الأمام وعكس). تأكد من أن تركيز الأسهم من كل التمهيدي PCR يتم الاحتفاظ بمبلغ 100 ميكرومتر. تقديم ما يكفي من مزيج التمهيدي ل500-1،000 ردود الفعل للحد من pipetting لخطأ والوقت على مقاعد البدلاء (انظر الجدول التكميلي S2). إذا رغبت في ذلك، وإعداد مأخوذة عن 100-200 ردود الفعل في أنبوب وتخزينها في -20 ° C.
  2. إعداد PCR الكوكتيل كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة (الجدول 1). ويشمل حجم ردود الفعل لمدة 96 فائض من 20٪. دوامة الأنبوب الذي يحتوي على كوكتيل PCR بخفة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 2،000 ز س.
  3. الاستغناء 3 ميكرولتر من الكوكتيل PCR في كل بئر من غير متجنب 96 لوحة جيدا. ماصة مكرر يمكن توفير الوقت لهذه العملية.
  4. إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني المناسب من البعوض في كل بئر.
    ملاحظة: عملية الحصول على الحمض النووي الجيني من م الأنسجة osquito (رئيس / الصدر، البطن أو الجسم كله) يوصف في الآداب الأخرى 29-32. اختيار بروتوكول استخراج الحمض النووي المناسب للتمييز ذوي المتصورة في الدم (البطن) من البعوض المعدية (المتصورة في الرأس / الصدر). نحن عادة استخدام الحمض النووي المستخرج من أجزاء الجسم (الرأس / الصدر أو البطن) من البعوض، لذلك تركيز الحمض النووي يختلف من 0.05-2ng / ميكرولتر. على الرغم من أن مجموع المدخلات DNA هو أقل من توصية الشركة الصانعة (5-10ng / rxn)، ونحن عادة ما تحصل قوي SNP يدعو من 98٪ من عينات من الحمض النووي من دون كله تضخيم الجينوم.
  5. ختم لوحة، بلطف مزيج أو الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 370 ز س.
  6. استخدام بروتوكول thermocycler التالية لتنفيذ PCR التضخيم: (1) 94 ° C لمدة 2 دقيقة، (2) 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، (3) 56 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، (4) 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (5) كرر الخطوة (2) - (4) لمدة 45 دورات، (6) 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، و 4 ° C الانتظار.
_title "> 2. العلاج SAP

  1. إعداد الحل انزيم SAP في 96 لوحة جيدا (انظر الجدول 2). معالجة 96 عينة في طبق من ذهب. ويشمل حجم ردود الفعل لمدة 96 فائض من 20٪.
  2. دوامة أنبوب من SAP حل انزيم بخفة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 2،000 ز س. الاستغناء 2 ميكرولتر من محلول أنزيم SAP في كل بئر. مرة أخرى، يمكن ماصة مكرر توفير الوقت لهذه العملية.
  3. ختم لوحة، بلطف مزيج أو الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 370 ز س. احتضان لوحة على النحو التالي: (1) 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة، (2) 85 ° C لمدة 5 دقائق لإبطال نشاط الانزيم، (3) 4 ° C الانتظار. في الانتهاء من هذه الخطوة، وتخزين لوحة عند -20 درجة مئوية قبل المتابعة. معالجة لوحة المخزنة في حدود 2 أسابيع.

3. SNP التمديد

  1. إذا تم تجميدها لوحة عينة بعد العلاج SAP، والسماح لها ذوبان الجليد لRT قبل المتابعة.
  2. تحضير مزيج تمديد التمهيدي (التكميلي الجدول S2). كل SNP ديه EXTE واحدnsion التمهيدي. الحفاظ على تركيز المخزون من كل التمهيدي التمديد في 500 ميكرومتر. اختياريا، قسامة عن 100-200 ردود الفعل في أنبوب وتخزينها في -20 ° C.
  3. إعداد تمديد مزيج كما هو موضح في الجدول رقم 3. ويضم 96 حجم رد الفعل فائض من 20٪.
  4. دوامة أنبوب التمديد كوكتيل بخفة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 2،000 ز س. الاستغناء 2 ميكرولتر من الكوكتيل التمديد في كل بئر. مرة أخرى، يمكن ماصة مكرر توفير الوقت لهذه العملية.
  5. ختم لوحة، بلطف مزيج أو الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 370 ز س. Thermocycle لوحة كما هو مبين في الشكل (1). وعند هذه النقطة، انتقل إلى قياس الطيف الكتلي أو تخزين لوحة عند -20 درجة مئوية لتصل إلى 2 أسابيع.

4. تكييف ملحق المنتج SNP لتحسين تحليل الطيف الكتلي

  1. إذا تم تجميدها لوحة عينة بعد التمديد SNP، والسماح لها ذوبان الجليد لRT قبل المتابعة.
  2. نقل 15MG من راتنج من المآخذ لهاINER على لوحة الدمل باستخدام ملعقة ممدود. استخدام مكشطة لنشر الراتنج في الآبار من لوحة الدمل. اكتساح مكشطة من جانب إلى آخر عبر لوحة الدمل لنشر الراتنج. تأكد من وجود الراتنج في كل بئر.
  3. كشط الراتنج الزائد لوحة الدمل باستخدام مكشطة. السماح للراتنج يقف في لوحة الدمل لمدة 20 دقيقة على الأقل. في حين ترك الراتنج تقف في لوحة الدمل، إضافة 41 ميكرولتر من HPLC المياه الصف إلى كل بئر من لوحة عينة.
  4. وضع بلطف لوحة عينة رأسا على عقب، على لوحة الدمل. تأكد من إعادة تعيين لوحة عينة ضد آخر مدورة صغيرة من لوحة الدمل، حيث يتقابل الآبار في لوحة عينة مع الآبار في لوحة الدمل.
  5. عقد لوحة عينة ولوحة الدمل معا، والوجه لهم بلطف على ذلك يندرج الراتنج من لوحة الدمل في الآبار من لوحة عينة. اضغط على لوحة الدمل حتى يسقط الراتنج للخروج الى لوحة العينة. تأكد من أن جميع الراتنج في دي تقع لوحة mple للخروج الى الآبار لوحة العينة. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 3،200 x ج لمدة 30 ثانية.
  6. تدوير لوحة عينة على محور دوار لمدة 5 دقائق على RT. الدوار يجب تدوير لوحة عينة 360 درجة حول محور طويل.
  7. أجهزة الطرد المركزي لوحة عينة في 3،200 x ج لمدة 5 دقائق. بعد هذه الخطوة، وتخزين لوحة عينة في -20 ° C لتصل إلى 2 أسابيع قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.

5. MALDI-TOF الطيف الكتلي

  1. نقل SNP المنتج تمديد مكيفة الصعود إلى bioarray مثل SpectroCHIP حسب تعليمات الشركة الصانعة. نحن نستخدم MassArray Nanodispenser لهذه الخطوة.
  2. مرة واحدة اكتمال عملية النقل، وتحديد كيف المقايسات واللوحات هي التي يتم إقامتها في قاعدة البيانات الفحص. اسم الفحص واللوحات بحيث كل لوحة لديها معرف فريد الذي يربط إلى تصميم فحص معين (التكميلي الجدول S3).
  3. بعد أن تم تعريف الفحص ولوحة، واكتساب الأطياف باستخدام مطياف الكتلة.

الصورة = "jove_title"> 6. تحليل البيانات

  1. لتحليل البيانات باستخدام الوقت الحقيقي تحليل PCR برنامج تفسير البيانات مثل من نوع محلل أو TyperViewer (Sequenom). الحصول على البيانات في. XML الشكل الذي يحتوي على تخطيط العينة، الطيفية الجماعية لكل بئر، فإن المعلومات بما في ذلك اسم علامة والكتلة المتوقعة لكل متغير من SNP المقابلة، وأي خطأ أو رسائل التحذير المرتبطة بكل رد فعل. انظر الشكل 2 لالناتجة الطيفية كتلة.
  2. إجراء تحليل SNP النمط الجيني التجميع عن طريق تحديد عتبة الكشف (حجم أو إشارة إلى نسبة الضوضاء) والتسامح / التباين المسموح بها لكل النمط الجيني الشكل يظهر 3 مثال على 04707-KDR # 2 SNP مجموعات التركيب الوراثي.
  3. تصدير الناتجة المكالمات النمط الجيني SNP في برنامج جدول بيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحديد الأنواع:

وفيما يلي 5 النيوكلوتايد تحديد معا ثلاثة أنواع (A. ارابينسيس، A. coluzzii وA. الغامبية) (جدول 4). إذا عينة ليست واحدة من الأنواع الثلاثة، وتعدد الأشكال الثلاثة (01073-213، 04679-157 و10313 -052) تفشل لتضخيم.

KDR النمط الجيني لاستنتاج مقاومة الحشرات:

وكودون 1014 عشر للقناة الصوديوم الجهد بوابات شبه يتوافق مع KDR. اثنين النيوكلوتايد على قاعدة الثانية 2 و 3 الثالثة من كودون عشر 1014 تحدد الأحماض الأمينية الثلاثة الممكنة. . يتم سرد التوليفات الممكنة من المورثات في الجدول 5 يعمل هذا SNP لثلاثة أنواع من نواقل الملاريا في أفريقيا: A. ارابينسيس، A. coluzzii وA. الغامبية. تفشل هذه النيوكلوتايد لتضخيم في A. الدارلنغية، ناقل الملاريا البرازيلي. هذه ليستنظرا المستغرب أن الميتوكوندريا تشابه تسلسل الجينوم بين A. الدارلنغية وA. الغامبية هي 88.9٪ فقط في حين الميتوكوندريا تشابه تسلسل الجينوم بين ثلاثة نواقل الملاريا في أفريقيا أكثر من 98٪. لم يتم اختبارها الأنواع الأخرى. وقد نجحنا في التضخيم من العينات التي تم جمعها في مالي والكاميرون وتنزانيا وزامبيا.

الكشف عن المتصورة:

إذا سليمة المتصورة DNA موجود في الأنسجة البعوض، فإننا نتوقع أن كشف P. المنجلية أو P. النشيطة DNA محددة بين عينة من الحمض النووي المستخرج من البعوض. وقد تم التعرف على أنواع محددة من تعدد الأشكال محاذاة تسلسل تسلسل السيتوكروم ب 123 P. المنجلية، P. 97 النشيطة، 11 P. الملاريية و 18 P. عزل متواليات من أفريقيا المتوفرة على بنك الجينات البيضوية. لقد قمنا بتصميم 6 تعدد الأشكال التي تنتج الأنماط الجينية SNP فريدة لتمييز P. المنجلية أو P. السادس VAX من الأنواع المتصورة الأخرى (الجدول 6). لقد اختبرنا هذا الاختبار على عينات البعوض التي تم جمعها في مالي والكاميرون وتنزانيا وزامبيا والبرازيل، وأكد أن هذه مجموعة معينة من علامات يعمل بغض النظر عن أنواع البعوض.

كشف Bloodmeal PCR:

تم جمع السيتوكروم ب متواليات من 7 أنواع المضيف (البشرية والدجاج والبقر، والكلب والماعز والخنازير والغنم) من بنك الجينات وتم إنشاؤها تسلسل الآراء. تعدد الأشكال الإعلامية لكل مضيف ثم تم اختيار لالتنميط الجيني. اختبرنا هذا مع مصادر الدم من 7 حيوانات مختلفة (الجدول 7).

بسبب شظايا PCR قصيرة (80-120 بي بي)، وهذا يعمل على الحمض النووي المتدهورة إلى حد ما أو bloodmeals على المهضوم جزئيا من الأنسجة البعوض. يتم تقليل احتمال المكالمات إيجابية كاذبة إلى حد كبير من خلال وجود علامات متعددة لكل نوع المضيف.

الصورة "> الشكل (1)
الشكل 1. برنامج Thermocycler لSNP خطوة التمديد. دورة التضخيم هي مجموعه 200 (5x40).

الشكل 2
الشكل 2. قداس-الطيفية للMDA. أما المحور X هو كتلة (دا) من المنتجات تمديد SNP والمحور Y هو كثافة إشارة. الخطوط الحمراء تشير إلى كتلة من المتوقع الفردية تمديد التمهيدي، SNP أليل 1 و أليل (2) لعلامة المحدد. خطوط رمادية تشير إلى توقع كتلة من علامات أخرى في MDA. يتم إنشاء هذه المؤامرة من برنامج تحليل البيانات (من نوع محلل أو من نوع عارض) من ملف بيانات الناتج بعد الخطوة 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ه = "دائما"> الشكل (3)
الشكل 3. الفردية SNP العنقودية النمط الجيني عرض المحور X هو القيمة قوس الظل (وصفت بانها "زاوية") من شدة إشارة من SNP أليل 1 و SNP أليل 2. المحور Y هو حجم إشارة النداء النمط الجيني. يتم توفير هذه المؤامرة في برنامج تحليل البيانات (من نوع محلل أو من نوع عارض). يمكن اختيار أي بيانات معينة مع النقر على زر الفأرة ويشار بيانات عينة مختارة من قبل الدائرة. تحليل التجميع المقدمة في مجموعات البرمجيات الأنماط الجينية مع عتبة التباين المعرفة من قبل المستخدم وتلقائيا الألوان الثلاثة الأنماط الجينية من SNP biallelic. المثال المعروض هنا يشير متماثل T (TT) الأفراد على شكل مثلثات زرقاء، متغايرة (TA)، والساحات الخضراء ومتماثل ألف (AA) أفراد والبرتقال مقلوب مثلثات. وتمثل الدوائر الحمراء لا دعوة (لا التضخيم).ر = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

كاشف التركيز في 5 ميكرولتر حجم حجم
(1 rxn) (96 rxns)
المياه (HPLC الصف) NA 0.8 ميكرولتر 92.2 ميكرولتر
10X PCR العازلة مع 20 ملي MgCl2 1X (2 مم MgCl2) 0.5 ميكرولتر 57.6 ميكرولتر
MgCl2 (25 ملم) ** 2 مم 0.4 ميكرولتر 46.1 ميكرولتر
مزيج dNTP (25 ملم لكل منهما) *** 500 ميكرومتر 0.1 ميكرولتر 11.5 ميكرولتر
مزيج التمهيدي (500 نيوتن متر لكل منهما) 100 نانومتر 1.0 ميكرولتر 115.2 ميكرولتر
PCR أنزيم (5 U / ميكرولتر) 1.0 U / rxn 0.2 ميكرولتر 23.0 ميكرولتر
إجمالى حجم التداول: 3.0 ميكرولتر 345.6 ميكرولتر

الجدول 1. ملتيبليكس PCR الكوكتيل وصفة. حجم كل كاشف للخطوة تمديد PCR لرد فعل واحد و 96 التفاعلات مع عبء 20٪.

إجمالى حجم التداول
كاشف حجم (1 rxn) حجم (96 rxn)
المياه (HPLC الصف) 1.53 ميكرولتر 176.3 ميكرولتر
SAP العازلة (10X) 0.17 ميكرولتر 19.6 ميكرولتر
SAP انزيم (1.7 U / ميكرولتر) 0.30 ميكرولتر 34.6 ميكرولتر
2.00 ميكرولتر 230.4 ميكرولتر

الجدول 2. SAP حل الانزيم. حجم كل كاشف لالروبيان العلاج الفوسفاتيز القلوية عن رد فعل واحد و 96 التفاعلات مع عبء 20٪.

كاشف اضرب. في 9 ميكرولتر حجم (1rxn) حجم (96 rxns)
المياه (HPLC الصف) NA 0.6190 ميكرولتر 71.3 ميكرولتر
IPLEX العازلة زائد (10X) 0.222x 0.2000 ميكرولتر 23.0 ميكرولتر
IPLEX إنهاء مزيج 1X 0.2000 ميكرولتر 23.0 ميكرولتر
تمديد التمهيدي مزيج 0.9400 ميكرولتر 108.3 ميكرولتر
IPLEX انزيم 1X 0.0410 ميكرولتر 4.7 ميكرولتر
إجمالى حجم التداول 2.0000 ميكرولتر 230.4 ميكرولتر

الجدول 3. SNP تمديد كوكتيل حجم كل كاشف للخطوة التمديد SNP عن رد فعل واحد و 96 التفاعلات مع عبء 20٪.

الجدول 4
الجدول 4. الأنماط الجينية SNP لكل الأنواع. 28S IGS-540، 28S IGS-649 و01٬073-213 تقع على الصبغي X، 04٬679-157 على كروموسوم 2 و 10٬313-052 هو على الصبغي 3. الهجين النمط الجيني (متغايرة) يتم تمييز باللون الأصفر. البديل ثابت في A. ويتميز coluzzii في البديل الأزرق وثابت الضوء في A. ويتميز الغامبية في الظلامالأزرق.

الجدول 5
الجدول 5. المورثات SNP لKDR اثنان النيوكلوتايد KDR رقم 1 ورقم 2 KDR تشكل النمط الجيني للكودون 1014 عشر من الفقرة الجين. القاعدة الأولى هي الثوابت حتى لا يتم تضمينه في الفحص. يتم وضع علامة المورثات متماثل عرضة باللون الأزرق. يتم وضع علامة على الأكثر مقاومة L1014F زيجوت متماثلة الألائل النمط الجيني في الأزرق الداكن. اللون الأصفر يشير متغايرة. وL1014 S، انتقالية تربط بين النمط الجيني مقاومة، ويظهر باللون البرتقالي.

الجدول 6
الجدول 6. المورثات SNP لP. المنجلية وP. النشيطة اونج>. وتستخدم مجموع 6 النيوكلوتايد لتحديد وجود طفيلي الملاريا. PL-0041، PL-1269 و PL-1549 تحتوي P. المنجلية الأليلات محددة (G، T و T على التوالي). التضخيم في وقت واحد من الأليلات ثلاثة يشير وجود سليمة نسبيا P. DNA المنجلية في عينة DNA. التضخيم من الأليلات البديلة (A لPL-0041 وPL-1269) إلى وجود الأنواع المتصورة الأخرى (على سبيل المثال، P. النشيطة، P. البيضوية أو P. الوبالية) في العينة. يقع PF-1549 في المناطق مع عدد أكبر من P. يتم تضخيمه المنجلية محددة المرافقة المناطق وبالتالي هذا SNP فقط عندما P. المنجلية موجودا. PL-0071، PL-1245 وPL-0157 تحتوي P. النشيطة الأليلات محددة (G، G و T على التوالي). التضخيم من الأليلات البديلة (A، A و C على التوالي) يشير إلى وجود الحمض النووي المتصورة آخرين في العينة. سوف البعوض غير المصابة ليس لديهم التضخيم على جميع علامات (6). الجدول 7
الجدول 7. المورثات SNP لمدة 7 الجنود. بالبشر، الدجاج، البقر، الكلب، الماعز، الخنزير والخراف "NC" لتقف على "عدم وجود مكالمة" (أي التضخيم) في الجدول التالي. لاحظ أنه قد تحدث بعض التضخيم غير محددة في بعض مواضع، ولكن ليس لجميع تعدد الأشكال من مضيف معين. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويتكون MDA من خمس خطوات رئيسية هي: PCR التضخيم، رد فعل قلوية الروبيان الفوسفاتيز (SAP)، والإرشاد SNP، تكييف المنتج التمديد، وبمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين - الوقت الرحلة (MALDI-TOF) قياس الطيف الكتلي 33-37. أول خطوة التضخيم PCR تضخيم DNA المرافقة كل SNP بحيث DNA قالب يكفي سوف تكون متوفرة في خطوة التمديد SNP. رد فعل SAP يحيد dNTPs غير المستخدمة والتي يمكن أن تتداخل مع خطوة تمديد SNP التالية. تمديد SNP ينطوي على تمديد التمهيدي واحد في موضع SNP والنيوكليوتيدات فاصل المعدلة كتلة. النيوكليوتيدات تعديل 3'نهاية تمنع النيوكليوتيدات اللاحقة من يجري دمجها في التمهيدي التمديد. وهكذا فإن كتلة قاعدة واحدة تدل على التركيب الوراثي للSNP المقابلة.

الخطوة الأكثر أهمية في ضمان نجاح هذا النهج هو وجود مجموعة بيانات جيدة من الأشكال الموجودة في الكائن المستهدفالصورة. كنا النيوكلوتايد تتميز كذلك لتحديد الأنواع (N> 900) 10،12،38-40 وKDR (N> 1،000) 15،18. وقد تم التعرف على أنواع تعدد الأشكال محددة لالمتصورة من محاذاة تسلسل تسلسل السيتوكروم ب 123 P. المنجلية، P. 97 النشيطة، 11 P. الملاريية و 18 P. عزل البيضوية متواليات من أفريقيا التي كانت متاحة في بنك الجينات. تم جمع السيتوكروم ب متواليات من 7 أنواع المضيف (البشرية والدجاج والبقر، والكلب والماعز والخنازير والغنم) من بنك الجينات لتحديد SNP المضيف محددة. وبناء على هذا الكم الكبير من البيانات تسلسل، تمكنا من تصميم فحص التشخيص قوية باستخدام برنامج مصمم الفحص.

يتم تحديد عدد من العلامات يمكن لكل رد فعل تستوعب من قبل التوافق الكيمياء الحيوية من مزيج التمهيدي إعطاء التسامح لالتمهيدي إمكانية ديمر (0.9 من 0-1 النطاق). المؤلفون استخدام القيمة الافتراضية (1؛ أكثر صارمة) لإمكانية فتيلة كاذبة. Relaxation هذه المعلمة يمكن أن يحتمل زيادة عدد تعدد الأشكال التي يمكن أن يعاير في رد فعل واحد بالإضافة إلى تعدد الأشكال الواردة في هذه الدراسة.

الخطوات التضخيم PCR هي قوية وعادة لا تتطلب التكيف من تصميم الفحص الأولي. تمديد مزيج SNP (الجدول 3)، ومع ذلك، قد تحتاج إلى تعديل في الكمية النسبية لكل التمهيدي باستخدام مطياف الكتلة لضمان وجود إشارة كافية إلى نسبة الضوضاء ويتحقق لكل التمهيدي. وقدمت SNP تمديد التمهيدي وصفة هي نتيجة لهذه التعديلات. التوافق بين الاشعال تمديد قد تحد من العدد الكلي للتعدد الأشكال التي يمكن أن تكون متعدد في رد فعل واحد. منذ حجم رد الفعل هو صغير (5-8 ميكرولتر)، تحتاج لوحة عينة لتكون مختومة بشكل صحيح لمنع التبخر خلال الخطوات التضخيم.

هذه المنصة يمكن أن يسجل في وقت واحد تصل إلى 35 النيوكلوتايد في رد الفعل، في حين أن غيرها من منصات التنميط الجيني SNP يمكن أن تسكنه أكثر من ألف تعدد الأشكال في رد فعل 41. مع التقدم في تكنولوجيا الجينوم التسلسل، يمكن للمرء الحصول على الملايين من تعدد الأشكال باستخدام الجيل التالي من التسلسل 29،42،43. ومع ذلك، فإن التقنية المستخدمة هنا يوفر تطبيق مثالي للدراسات التي تتطلب التنميط الجيني لعدد صغير نسبيا من علامات بالنسبة للكثيرين (100S-1،000s) الأفراد. وتغطي مناقشة إضافية من القيود تصميم مختلف منصة التنميط الجيني SNP في الدراسات السابقة 41.

ويهدف MDA في تميز الصفات الهامة وبائيا لنواقل الملاريا ويوفر بروتوكول المثالي للمتوسطة الإنتاجية SNP المقايسات التنميط الجيني تحليل الآلاف من البعوض تم جمعها من السكان الطبيعي. قدم MDA هنا تقدم (1) على تخفيض 90٪ في وقت العمل، (2) تخفيض 60٪ في تكاليف الكاشف، و (3) الحد من ايجابيات كاذبة / السلبيات من خلال استخدام علامات متعددة. الفحص المقترحة يمكن أن تعزز الدراسات الوبائية التي كتبهاتسهيل جمع البيانات بشكل كبير. أيضا، فإنه يمكن تحسين الدراسات رابطة الجينوم على نطاق كتبها تميز عينات البعوض فيما يتعلق أصل السكان، ومقاومة الحشرات، الطفيليات قابلية واختيار المضيف. وأخيرا، قد هذا MDA توفير إلهام ونموذج لتصميم فحوصات متعددة أخرى باستخدام منصة SNP التنميط الجيني MALDI-TOF مقرها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر الدكاترة. أنتوني كورنيل ولورا نوريس في جامعة كاليفورنيا في ديفيس والدكتور كاتارينا Kreppel في جامعة غلاسكو لتوفير عينات البعوض من تنزانيا. نشكر السيدة سميتا داس والدكتور دوغلاس نوريس من مدرسة جونز هوبكنز للصحة العامة لتبادل عينات البعوض من زامبيا. كما نشكر السيد لي V. ميون في مختبر علم الوراثة البيطرية للتدريب على تصميم الفحص. وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح R01AI 078183 وR21AI062929.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
  2. Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
  3. Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
  4. Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
  5. Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
  6. Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
  7. Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
  8. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
  9. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
  10. White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
  11. Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
  12. Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
  13. Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
  14. Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
  15. Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
  16. Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
  17. Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
  18. Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
  19. Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
  20. Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
  21. Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
  22. Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
  23. Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
  24. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
  25. Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
  26. Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
  27. Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
  28. Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
  29. Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
  30. Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
  31. Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
  32. Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
  33. Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
  34. Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
  35. Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
  36. Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
  37. Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
  38. Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
  39. Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
  40. Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
  41. Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
  42. Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
  43. Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).

Tags

الأمراض المعدية، العدد 96، البعوض، SNP التنميط الجيني، فحص متعددة، IPLEX، MALDI-TOF، ومقاومة الحشرات والجزر أنواع جديدة، تشخيص الأنواع، والكشف عن الطفيلي، كشف مصدر الدم، وتفضيل المضيف، حالة الإصابة
مقايسة متعدد الكشف عن الملاريا بث البعوض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C.… More

Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter