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Biology

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

Published: February 28, 2015
doi:
10.3791/52385
, , , ,
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology,School of Veterinary Medicine, University of California – Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory,School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

Summary

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Abstract

과 아노 펠 레스 gambiae 종 단지는 아프리카에서 모기를 전송하는 주요 말라리아가 포함되어 있습니다. 이들 종은 의료 중요하기 때문에, 여러 가지 특성은 전형적 역학 연구에 도움 분자 분석법을 이용하여 특성화된다. 이러한 특성은 종 식별, 살충제 저항, 기생충 감염 상태, 호스트 환경 설정을 포함한다. 과 아노 펠 레스 gambiae 복합체의 형태 학적 집단 구별하기 때문에, 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 전통적 종을 식별하는 데 사용된다. 종이 알려지면, 여러 하위 분석은 정기적으로 추가 특성을 규명하기 위해 수행된다. 예를 들어, 파라 유전자 KDR이라고도 돌연변이는 DDT 및 피레스 로이드 계 살충제에 대해 내성을 부여. 또한, 효소 면역 분석법 (ELISA를) 또는 변형체 기생충 DNA 검출 PCR 분석법 모기 조직 기생충 존재를 검출하기 위해 사용된다. 마지막으로, combinatioPCR과 제한 효소 다이제스트의 N은 호스트 별 DNA의 모기 bloodmeal을 선별하여 호스트 환경 설정 (예를 들어, 동물의 혈액 대 인간) 규명하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 96 시간에 384 샘플에 대해 단일 ​​멀티 플렉스 반응 유전자형 33SNPs으로 상기 분석을 모두 겸비한 다중 검출법 (MDA)을 개발 하였다. MDA 종, 말라리아 검출 및 호스트 혈액 식별을위한 여러 마커를 포함하기 때문에, 오탐 (false positive) 또는 네거티브를 생성하는 가능성은 크게 특성 당 하나의 마커를 포함 이전 분석에서 감소한다. 이 강력하고 간단한 분석은 비용 효율적으로 기존 분석의 시간의 틈새에서 이러한 주요 모기의 특성을 감지 할 수 있습니다.

Introduction

학질 모기의 arabiensis, 학질 모기의 coluzzii 아노 펠 레스 gambiae 아프리카 1 말라리아 전송을 담당하는 주요 벡터입니다. 이 세 종은 형태 학적으로 2 구별 만 분자 분석 3-9으로 구별 할 수있다. 또한, 정기적으로 역학 및 인구 유전학 연구를 지원하기 위해 실시 많은 다운 스트림 분석이있다. 이들은 분화 섬 10-12 (1) 유전자형 분석, (2) 아미노산 코돈 파라 유전자의 위치 번째 1014 비 동의어 SNP를 인식 유전자형 분석 (녹다운 저항 또는 KDR, SNP) (13)를 포함 -18, (3) 기생충 검출 PCR 19-23, 모기 midguts 24, 25에서 호스트 별 DNA (4) 검사.

우리의 목표와 하나의 멀티 플렉스 반응으로 모든 분석을 결합한 다중 탐지 분석 (MDA)을 개발아프리카에서 말라리아 벡터의 역학적으로 중요한 특성을 alyzing. MDA 분석 여러 (1) 종을 검출하기위한 마커 (A.의 arabiensis, A.의 gambiae, A.의 coluzzii, 또는 3 개)의 기타 (없음) KDR의 SNP로 표현, (2) 살충제 저항을 포함 (L1014F 및 L1014S 모두) 두 가지 주요 말라리아 기생충, (3)의 존재, 말라리아 원충 및 P. 삼일 열, 하나의 조류와 여섯 포유류 호스트에서 (4) 혈액 소스.

전통적으로, 이러한 분석은 분리 된 중합 효소 연쇄 반응을 수행 하였다. 이러한 모든 분석은 종래의 PCR 플랫폼을 사용을 완료하면, 그것은 8-10 PCR 반응 분석을 수행하고 전기 영동 단계를 수반하는 요구한다. 여기에 제시된 MDA 방식은 전체에서 약 5 시간 소요하면서 문서화 결과에 준비에서 각 PCR 반응은, 4 ~ 5 시간이 걸립니다. 이 단독으로 노동 비용을 90 % 절감하는 것과 같습니다. MDA는 여기에 제시된 5 달러 비용샘플 당 모두 33 개의 SNP 유전자형합니다. 이것은 상당히 저렴 샘플 당 약 $ 1.50의 요금으로 하나의 아가 로스 젤 기반 분석,보다. MDA 의해 덮여 모든 특성을 검출 분석은 샘플 당 $ 12-15의 비용 8-10 별도 아가 로스 겔 – 기재 분석법의 최소 필요하다. 또한, MDA 크게 각 기생충 또는 호스트 소스 검출에 대해 적어도 3 개의 마커를 이용하여, 거짓 포지티브 또는 네거티브의 발생 가능성을 감소시킨다.

우리가 활용 플랫폼은 말라리아 벡터에 한정되지 않고, 의약, 수의학, 및 기초 생물학 26-28 같은 다양한 애플리케이션에 사용될 수있다. 심층 많은 샘플 (100 단위의 순서) 번호를 포함하는 관련 연구 또는 집단 유전학 연구는 동시에 여러 마커에 대한 비용 효과 분석 검사를 필요로한다. 둘 이상의 별개 PCR 분석법을 이용하는 대부분의 연구는 더 낮은 비용으로 더 빠른 결과를 위해 MDA를 구현할 수있다. </p>

Protocol

1. PCR 증폭 1.5 ㎖ 마이크로 튜브의 모든 PCR 프라이머를 (보충 테이블 S1 참조) 섞는다. 각각의 SNP는 두 개의 프라이머 (순방향 및 역방향)가 있습니다. 각 PCR 프라이머의 주식 농도를 100 μM로 유지되어 있는지 확인합니다. (보충 표 S2 참조) 벤치에서 오류와 시간을 피펫 팅 줄이기 위해 500 ~ 1,000 반응에 대한 충분한 프라이머 믹스를 확인합니다. 원하는 경우, -20 ° C에서 튜브 및 상점 당 100 ~ 20…

Representative Results

종 식별 : 샘플이 세 종 중 하나가 아닌 경우 다음과 같은 5 개의 SNP 함께. 세 가지의 SNP (01073-213, 04679-157과 10,313 세 종 (A.의 arabiensis, A.의 coluzzii와 A.의 gambiae) (표 4)를 식별 -052)는 증폭 실패합니다. 살충제 저항을 추론하기위한 KDR 유전자형 : 파라 전압 관문 나트륨 채널의 1014 번째 ?…

Discussion

– 비행 (MALDI-TOF) 질량 분석 33-37 시간 PCR 증폭, 새우 알칼리 포스 파타 아제 (SAP) 반응, SNP 확장, 확장 제품 에어컨, 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 : MDA는 5 개의 주요 단계로 구성되어있다. 첫 번째 PCR 증폭 단계는 충분한 주형 DNA가 SNP 확장 단계에서 사용할 수 있도록 각각의 SNP를 측면에서는 DNA를 증폭한다. SAP 반응은 다음과 SNP 확장 단계를 방해 할 수있는 사용하지 않은 dNTPs를 중화. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 박사 감사합니다. 탄자니아에서 모기 표본을 제공 글래스고 대학의 UC 데이비스 박사 카타리나 Kreppel에서 앤서니 코르 넬과 로라 노리스. 우리는 잠비아에서 모기 샘플을 공유하기 위해 공중 보건의 존스 홉킨스 대학원에서 양 Smita 다스 박사 더글러스 노리스 감사합니다. 우리는 또한 분석 디자인 교육에 대한 동물 유전학 연구소 이씨 V. 밀론 감사합니다. 이 작품은 R01AI 078183과 R21AI062929을 부여 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
MassARRAY Analyzer Compact Sequenom MT9 MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids.
MassARRAY Nanodispenser Sequenom RS1000 Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set Sequenom 10158 Reagents used for iPLEX assay including SAP kit.
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Keywords: Multi-detection AssayAnopheles GambiaeMalariaMosquitoesSpecies IdentificationInsecticide ResistancePlasmodium DetectionHost PreferencePCRELISAMultiplex Genotyping
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Lee, Y., Weakley, A. M., Nieman, C. C., Malvick, J., Lanzaro, G. C. A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes. J. Vis. Exp. (96), e52385, doi:10.3791/52385 (2015).
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