Introduction
Primær glaukom er en ødeleggende øye sykdom som rammer anslagsvis 60.500.000 mennesker over hele verden en, noe som kan føre til liv-altering synstap og blindhet to. Forskning på sykdomsmekanismer, og utviklingen av nye behandlingsformer for glaukom, er avhengig av gode modeller av sykdommen som rekapitulere noen av kjennetegnene til patologi.
Vi presenterer her en rotte glaukom modell basert på metoden for Samsel et al. 3 Det overordnede målet med denne teknikken er å øke intraokulært trykk (IOP) i øyet ved å injisere magnetiske mikrokuler inn i fremre kammer, og ved hjelp av en magnetisk ring, direkte dem inn i iridocorneal vinkel. Dette hindrer vandig strøm, noe som øker IOP, som fører til nevronal skade og celletap. Protokollen ble utviklet for å forsøke å tilveiebringe et enklere, induserbar modell av glaukom.
Denne protokollen kan ha noen fordeleri forhold til eksisterende teknikker. Genetiske musemodeller som DBA / 2J er tilgjengelig, som ikke krever prosedyrer for å sette i gang; men disse kan ha en uforutsigbar inntreden av sykdomsprogresjon 4. I motsetning til dette, induserbare modeller, hvorav de fleste er avhengige av kirurgisk heve IOP hos gnagere, har den fordel at initiering kan kontrolleres av brukeren. Noen av disse metodene kan ha ulempene med sin egen imidlertid herunder være teknisk utfordrende 5, og kan kreve flere prosedyrer for å opprettholde forhøyet IOP 6.
I motsetning til dette, den induserbare metoden beskrevet i dette manuskriptet er en enkel, effektiv og reproduserbar teknikk som frembringer stabilt, robust økninger i trykk, med minimalt behov for reinjeksjon. I tillegg betyr det ikke involverer dyrt utstyr, og krever bare grunnleggende kirurgiske ferdigheter til å utføre. Denne protokollen kan være hensiktsmessig for lesere som ønsker å sette opp en mindre teknisk krevende induserbarglaukom modell i sitt laboratorium.
Protocol
Etikk uttalelse: Alle dyreforsøk er utført i samsvar med Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), og ble godkjent i enighet med Storbritannia hjemmekontoret retningslinjer ( http://goo.gl/FLkirW , sist åpnet 10. juni 2014) og den ARVO erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og Vision forskning ( http://goo.gl/4LFOjD , sist åpnet 10. juni, 2014).
1. okulær hypertensjon Induksjon
- Indusere eksperimentell glaukom ved å heve det intraokulære trykk (IOP) via ensidig injeksjon av paramagnetiske mikrokuler inn i det fremre kammer av Brown Norway rotter, basert på fremgangsmåten til Samsel et al. 3 Andre pigmenterte rotter kan være egnet, selv om disse ville trenge å bli validert først av brukeren.
- Huset 250-300 g kvinneligeex-oppdretter brune norske rotter i konstant et miljø med lite lys (40-60 lux) for å minimere dagaktive svingninger i IOP 7, med tilgang til mat og vann ad libitum.
- Ta baseline IOP målinger i våkne dyr 8 før anestesi og vulsten injeksjon, ved hjelp av en rebound tonometer kalibrert for bruk i rotte øyet 9. IOP er tatt som gjennomsnittet av fem målinger.
- Bedøver rotter med 37,5 mg / kg ketamin, og 0,25 mg / kg medetomidin hydroklorid levert intraperitonealt. Bekreft anestesidybden ved å teste dyrets bakre fot reflekser, før povidonjodid søknad (se trinn 1.5), og perle injeksjon (se trinn 1.8). Forvalte 0,5% proparacaine hydrochloride for smertelindring.
MERK: Du må ikke strekke eleven på noe tidspunkt. Dette vil bidra til at perlene bosette bedre inn i iridocorneal vinkel, og hindre binding til objektivet. Påfør okulær salve for å hindre at hornhinnen tørking på ikke-operert motsatt øye. - Waske operative øyet med 5% povidon-jod i vann 10 5 min før injeksjon.
- Etter 5 minutter ble den veke povidon-jod ved hjelp av sterilt gasbind, og vask øye med 0,9% steril saltoppløsning. Hold øye fuktig under anestesi med regelmessig bruk av sterilt saltvann.
- Plasser en toroidal magnet rundt øyet.
- Injisere 25 pl av en oppløsning inneholdende 30 mg / ml av gamma-bestråling sterilisert 8 um magnetiske mikrosfærer i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) i den fremre kammer, ved anvendelse av en 33 G nål avfaset.
- For å fremstille perler, vaskes ved ny suspende, deretter sentrifugering tre ganger ved 10 000 xg i 5 minutter med 1 ml HBSS, før den endelige 30 mg / ml oppløsning. Opprettholde sterile forhold hele.
- For injeksjon, være forsiktig for å unngå å sette inn nålen til iris, for å minimere risikoen for iris traumer. Dette kan forhindres ved å orientere nålen tangentielt til hornhinneoverflaten, som paralleltiris som mulig. Dette vil også bidra til å minimere perle tap fra injeksjonsstedet.
MERK: Sprøyt perler i et hurtig tempo for å sikre en jevn fordeling rundt iridocorneal vinkel, noe som er avgjørende for å heve IOP. I tillegg butikk perler, nåler og magnetiske ringer separat, slik at perlene ikke danne klynger, noe som gjør dem vanskelig å laste inn i sprøyten og injisere, og nålen ikke blir magnetisert.
- La nålen på plass for 1 min etter injeksjon for å sikre at perler bosette i iridocorneal vinkel å hindre vanndreneringen fra trabecelverket. Litt vinkel nålen etter perlene har i utgangspunktet avgjort å tillate noen lekkasje av vandig, for å minimalisere forbigående økning i IOP. Ved slutten av operasjonen spyle nålen gjennom først med fosfatbufret saltvann (PBS), deretter 70% etanol, etterfulgt av destillert vann, for å sikre fortsatt bruk av nålen i separate prosedyrer. Alternativt kunne man brukeengangsnåler hvis denne fastheten og sprøyte kombinasjonen er tilgjengelig. Valgfritt: nåler kan slipes med en beveller å forlenge deres bruk.
- På dette stadiet om nødvendig, fjerne magneten, og bruke den til å trekke perlene inn i områder av ufullstendig dekning.
- La magneten på plass rundt øyet i ytterligere 10 min etter injeksjon for å sikre at kulene slå seg godt inn i iridocorneal vinkel.
- Reverse anestesi bruker 0,25 mg / kg atipemezole hydroklorid.
- Administrere kloramfenikol, eller annen antibiotika salve, for eksempel gentamycin eller Terramycin lokalt for å hindre smitte, og 0,5% proparacaine hydrochloride for smertelindring. La dyr å gjenopprette på en varmematte før de gjenvinne bevegelse, og deretter overføre til en varm boks og forsyning med ekstra ernæring, slik som et kosttilskudd eller fuktet vanlig kosthold til utvinning er fullført. Systemisk eller lokal analgesi skal gis til dyrene viser tegn på smerte 24 timer etter operasjonen. Hvis these symptomene vedvarer til tross for behandling, bør dyrene bli humant avlivet.
- Bruk kontralaterale øyet som en unoperated kontroll.
- Ta IOP målinger hver 2-3 dager etter perle administrasjon, og etter 2-3 dager etterpå ved hjelp av en rebound tonometer kalibrert for bruk i rotte øye 9.
- Kriteriene for blant annet øyne i studier kan være: Hvis 1) IOP er hevet over den kontralaterale styretrykk ved 5 mm Hg, og 2) ikke overstiger 60 mm Hg.
- Øyne hvor trykket vender tilbake til baseline (vanligvis ved 1 uke etter injeksjon) ikke bør inkluderes i studiene, men det er mulig å re-injisere perler i øynene som ikke klarer å utvikle høy IOP hvis ønskelig.
- Avlive dyrene etter CO 2 kvelning ved slutten av forsøket.
- Dissekere øyne og synsnerver, og fikse på 4% Paraformaldehyde (PFA) over natten for ytterligere histologisk analyse.
2. Vurdere Retinal Neuron Skade Bruke TUNEL Sholde
- Å kvantifisere apoptotiske celler i hele mount retinasuse terminalen deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick-merking (TUNEL) analysen, i henhold til produsentens anvisninger.
- Dissekere retina fra øyet kopp, vaske i 3 x 5 minutter i 0,3% Triton X-100 i fosfatbufret saltvann (PBS-T).
- Permeabilize vevet i 3% T-PBS i 2 timer.
- Pre-ekvilibreres netthinne i ekvilibreringsbuffer i 10 min, før inkubasjon i TUNEL reaksjonsoppløsningen i 1 time ved 37 ° C.
- Vask vev for 3 x 5 min i 0,3% T-PBS, skyll i 0,3% T-PBS som inneholder fem mikrometer DAPI, og flat-mount i monterings media.
- Å kvantifisere Tunel positive kjerner bruke en konfokal mikroskop for å ta 10 mikrometer z-stabler gjennom ganglion celle laget på 20X forstørrelse. Ta tre bilder på hver av de fire blader, på steder i nærheten av den optiske nerven, i midten av periferien, og helt til periferien av netthinnen, noe som gir en total på 12 bilder per hele mount, prøvetaking ca 7.000 celler. Morfologiske kriterier diskriminert ikke-nevronale (endothelial og glial) celler fra nerveceller.
- Utvalgte områder for avbildning ved hjelp av bare DAPI kanal, og maske etterforskere til behandlingsgruppene.
3. Vurdere Optic Nerve Damage hjelp toluidinblått Farging
- Fix optiske nervene over natten i Karnovsky løsning ved 4 ° C.
- Behandle prøvene i 2 timer i 1% (w / v) osmiumtetroksyd, og deretter tørke i 100% etanol.
- Inkuber synsnerver i propylen oksid i 30 min, og legg i en 50:50 blanding av propylen oksid: araldite over natten.
- Endre denne oppløsningen til 100% Araldite, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 60 ° C.
- Cut semithin seksjoner (0,75 mm tykk) og flekken med 1% toluidinblått / boraks (TB) i 50% etanol før eksamen ved lysmikroskopi.
4. Statistisk analyse
- Gjennomføre statistisk analyserer bruker en passende statistikk programvarepakken. En to-veis ANOVA med Newman-Keul post-hoc testen kan brukes til å beregne statistisk signifikans for IOP endrer seg over tid.
- En p-verdi på mindre enn 0,05 kan bli betraktet som signifikant.
Representative Results
Injeksjon av magnetiske kuler inn i iridocorneal vinkel gående indusert en langvarig og robust trykkøkning (figur 1), som var lett observerbar ved det første tidspunkt, 3 dager etter injeksjon. Videre ble økningen i trykk som opprettholdes under hele forsøket, og selv om våre tidsforløpet ferdig på 18 dager etter injeksjon, andre har rapportert at trykket vedvarer langvarig 3. Den gjennomsnittlig IOP i gjennomsnitt over hele lengden av forsøket for kontroll, ikke-kule-injiserte øynene var 19,7 ± 0,3 mmHg, sammenlignet med 40,5 ± 2,8 mmHg for kule-injiserte øyne (p <0,001). I tillegg økte peak IOP fra 22,8 ± 0,3 mmHg til 49,9 ± 2,3 mmHg.
Å avgjøre om heving i IOP fører til døden av retinal ganglion celler, utførte vi TUNEL flekker på netthinner, og histologi på tverrgående synsnerven seksjoner (figur 2). I netthinnen vi observert en økning i TUNEL flekker (Figur 2A) i perle-injisert øynene med forhøyet IOP. Antallet apoptotiske kjerner steg omtrent 15-ganger, fra 1,6 ± 0,5 celler i kontralaterale kontroller, til 24,5 ± 0,5 celler i hypertensive netthinne (figur 2B; p <0,05). Videre er det i øynene som magnetiske kuler ble injisert men trykket ikke øker (sannsynligvis på grunn av ufullstendig blokkering av iridocorneal vinkel), antallet TUNEL-positive celler var ikke signifikant forskjellig fra uinjiserte kontroller (p> 0,05). Dette tyder på at celledød var knyttet til trykket øker, ikke på grunn av direkte toksisitet av de magnetiske mikrosfærer. Til slutt, undersøkte vi synsnerven patologi i glaukom-modellen, og så akkumulering av toluidinblått i mange av aksoner, noe som indikerer degenerering av disse cellulære prosesser (figur 2C).
ure en "src =" / files / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Heving av intraokulært trykk ved hjelp av magnetiske mikrosfærer. Injeksjon av magnetiske mikrosfærer i fremre kammer indusert en robust, betydelig økning i intraokulært trykk (IOP) i forhold til kontralateral kontroll, ikke-injisert øyne. Y-aksen enheter = millimeter kvikksølv (mmHg). Data = gjennomsnitt ± SEM. * = P <0,001; N = 12. Dette tallet har blitt forandret fra Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.
Figur 2. Heving av IOP ved injeksjon av magnetiske mikrokuler inn i iridocorneal vinkel, indusert neuronal død i ganglion celle lag (GCL). (A) Representative bilder av netthinne fra kontroll (venstre) og glaukom (høyre) øyne farget for apoptotiske kjerner av TUNEL (grønn;hvite piler) og DAPI (blå), angis antall apoptotiske kjerner økt som IOP rose. (B) Kvantifisering av Tunel positive celler i GCL, som viser at øynene med forhøyet IOP (i midten), hadde signifikant mer apoptotiske celler i forhold til kontroll (venstre). I kontrast, i perle-injisert øyne hvor trykket ikke stiger (til høyre), ingen signifikant økning i TUNEL farging ble observert. Data = gjennomsnitt ± SEM. * = P <0,05; N = 7-8 (C) Representative bilder av synsnerven flekker, viser en økning i toluidinblått akkumulering (svarte piler) i ødelagte axoner fra glaukom (til høyre), men ikke kontroll øyne (til venstre).. Skala barer = 50 mikrometer. Dette tallet har blitt forandret fra Bjørnstad et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.
Discussion
Her vil vi vise en metode for å indusere forhøyet IOP hos rotte, ved injisering av magnetiske mikrokuler inn i det fremre kammer av øyet. Denne metoden er enkel å gjennomføre, og krever lite kirurgisk kompetanse, eller timer praksis og raffinement. Videre er fremgangsmåten effektiv; sjelden krever mer enn en enkelt injeksjon av perler å indusere en sterk, robust trykkøkning (ca. 10% reinjeksjon rate). Dette kan gi en fordel i forhold til eksisterende induserbare metoder, slik som den teknisk utfordrende episceral vene sklerose 11 modellen, eller laser fotokoagulering protokoll 6, som kan kreve flere prosedyrer for å opprettholde hevet intraokulært trykk.
For at fremgangsmåten skal være vellykket er det imidlertid noen små kritiske trinn som må tas. For det første er det nyttig å bruke en toroidal formet magnet for å trekke perler inn i iridocorneal vinkel. Dette trinnet er en modifikasjon av den opprinnelige protokoll, der hvore perlene ble injisert inn i det fremre kammer, og deretter beveges på frihånd rundt øyet 3. Ved hjelp av en toroidal magnet betyr at sfærer bør bosette jevnt rundt vinkel, noe som krever minimalt med manuell omfordeling. For det andre, bør frekvensen av injeksjons være rask - for langsom og vulstene vil hovedsakelig akkumulerer på den ene side av vinkelen, som fører til ufullstendig dekning, og potensielt ingen trykkstigning. Generelt er imidlertid den metode grei nok til at brukeren lett kan foreta modifikasjoner i protokollen, slik som å variere størrelsen eller volumet av mikrosfærepartiklene, kanskje for å forsøke å endre graden av IOP høyde.
Men en potensiell ulempe ved fremgangsmåten er at man har liten kontroll over omfanget av hypertensjon, som i omtrent 5 til 10% av tilfellene vi observerte steg over 60 mmHg. Dreven økning i IOP kan være svært ødeleggende for retinal vev, og kan gjøre studere mekanismene og biologi av celledød utfordrende. Imidlertid frembringer fremgangsmåten en konsistent neuronal patologi, både i retina og optisk nerve, som kan manipuleres farmakologisk 12. Dette kan gjøre modellen attraktive for utvikling av nye terapeutiske midler for behandling av glaukom. I tillegg, fordi kulene er rettet inn i det iridocorneal vinkel, forlater den visuelle akse fri for levende avbildning av netthinnen eller optisk plate. Vi forventer at denne modellen vil bli tilpasset og brukes for fremtidige anvendelser i andre arter, inkludert mus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats | Harlan UK | 203 | |
| Tonolab Rebound Tonometer | Tiolat | TV02 | |
| Ketaset (ketamine) | Fort Dodge Animal health | BN1000118 | 37.5 mg/kg |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) | Orion Pharma | 140-999 | 0.25 mg/kg |
| Povidone iodine | Ecolab | BN4369LE10 | 5% in H2O |
| Minim's Saline Solution | Bausch and Lomb | PL00033/5017 | |
| Toroidal magnet | Supermagnete | R-10-07-03-N | |
| Magnetic Microspheres | Bangs Laboratories | UMC4N/9692 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| 33 G beveled needle | Hamilton | 7747-01 | Custom needle |
| Luer tip syringe | Hamilton | 80601 | |
| Antisedan (atipemezole hydrochloride ) | Orion Pharma | 141-003 | 0.25 mg/kg |
| Chloramphenicol ointment | Medicom | 18956-0005 | |
| TUNEL staining kit | Promega | G3250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review. JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Libby, R. T., et al. Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration. Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).
- Morrison, J. C. Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat. J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).
- Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat. Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).
- Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).
- Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).
- Isenberg, S. J.
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
- Foxton, R. H., et al. VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma. Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).
