Introduction
Primær glaukom er en ødelæggende øjensygdom der påvirker en anslået 60.500.000 mennesker i hele verden 1, hvilket kan føre til liv ændre synstab og blindhed 2. Forskning i sygdomme, og udvikling af nye terapeutiske midler til glaukom, er afhængig af gode modeller af sygdommen som rekapitule- nogle af kendetegnene for patologi.
Vi præsenterer her en rotte glaukom model baseret på metoden til Samsel et al. 3. Det overordnede mål med denne teknik er at øge det intraokulære tryk (IOP) i øjet ved at injicere magnetiske mikrokugler ind i det forreste kammer, og ved hjælp af en magnetisk ring, direkte dem i iridokorneal vinkel. Det hæmmer vandig udstrømning, hvilket øger IOP, der fører til neuronal skade og celletab. Protokollen blev udviklet for at forsøge at tilvejebringe en enklere, inducerbar model af glaukom.
Denne protokol kan have nogle fordelei forhold til eksisterende teknikker. Genetiske musemodeller såsom DBA / 2J er til rådighed, som ikke kræver procedurer til at indlede; men disse kan have en uforudsigelig indtræden af sygdomsprogression 4. I modsætning hertil inducerbare modeller, hvoraf de fleste er afhængige af kirurgisk opløftende IOP hos gnavere, har den fordel, at indledningen kan styres af brugeren. Nogle af disse metoder kan have ulemper ved deres egen dog herunder være teknisk udfordrende 5, og kan kræve flere procedurer til opretholdelse forhøjet IOP 6.
I modsætning hertil den inducerbare metode beskrevet i dette manuskript er en enkel, effektiv og reproducerbar teknik, der frembringer stabile, robuste stigninger i tryk, med minimalt behov for reinjektion. Derudover betyder det ikke involverer dyrt udstyr, og kræver kun grundlæggende kirurgiske færdigheder til at udføre. Denne protokol kan være hensigtsmæssigt for læsere, der søger at etablere en mindre teknisk krævende inducerbarglaukom model i deres laboratorium.
Protocol
Etik erklæring: Alle dyreforsøg er blevet udført i overensstemmelse med de institutionelle Animal Care og brug Udvalg (IACUC), og blev godkendt efter aftale med Storbritannien hjemmekontor retningslinjer ( http://goo.gl/FLkirW , sidste adgang 10. juni , 2014) og ARVO Erklæring om anvendelse af dyr i Ophthalmic og Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , sidste adgang 10. juni 2014).
1. okulær hypertension Induktion
- Fremkald eksperimentel glaukom ved at løfte det intraokulære tryk (IOP) via unilateral injektion af paramagnetiske mikrokugler ind i det forreste kammer i Brown Norway-rotter, baseret på fremgangsmåden ifølge Samsel et al. 3 Andre pigmenterede rotter kan være egnet, selv om disse skulle valideres først af brugeren.
- House 250-300 g kvindeligeex-opdrætter Brown Norway rotter i en konstant lav-lys miljø (40-60 lux) for at minimere døgnets udsving i IOP 7, med adgang til foder og vand ad libitum.
- Tag baseline IOP målinger i vågne dyr 8 før anæstesi og perle injektion, ved hjælp af en rebound tonometer kalibreret til brug i rotteøjet 9. IOP tages som gennemsnittet af fem aflæsninger.
- Bedøve rotter med 37,5 mg / kg ketamin og 0,25 mg / kg medetomidinhydrochlorid leveret intraperitonealt. Bekræft anæstesidybde ved at teste dyrets bageste fod reflekser før povidoniod ansøgning (se trin 1.5), og perle injektion (se trin 1.8). Indgiv 0,5% proparacainhydrochlorid for analgesi.
BEMÆRK: Du må ikke spile eleven på noget tidspunkt. Dette vil hjælpe perlerne at bosætte bedre ind i iridokorneal vinkel, og forhindre binding til linsen. Påfør okulær salve for at forhindre corneal tørring på un-betjente kontralaterale øje. - Wash den udløsende øje med 5% povidon jod i vand 10 5 min før injektion.
- Efter 5 minutter væge den povidoniod off anvendelse af sterilt gaze, og vask øjet med 0,9% sterilt saltvand. Hold øje fugtig under anæstesi med regelmæssig anvendelse af sterilt saltvand.
- Placer en ringformet magnet omkring øjet.
- Injicer 25 pi af en opløsning indeholdende 30 mg / ml gamma-bestråling steriliseret 8 um magnetiske mikrokugler i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ind i det forreste kammer, ved anvendelse af en 33 G affaset nål.
- For at forberede perler, vask ved re-suspension, derefter centrifugering 3 gange ved 10.000 xg i 5 min med 1 ml HBSS, før den endelige løsning 30 mg / ml. Bevar sterile forhold hele vejen igennem.
- Til injektion, være omhyggelig med at undgå at indsætte nålen til iris, for at minimere risikoen for iris traumer. Dette kan forhindres ved at orientere nålen tangerer hornhindens overflade, som er parallel mediris som muligt. Dette vil også bidrage til at minimere tab af perler fra injektionsstedet.
BEMÆRK: Sprøjt perler i et hastigt tempo for at sikre en jævn fordeling omkring iridokorneal vinkel, som er afgørende for at øge IOP. Derudover gemme perler, nåle og magnetiske ringe separat, således at perlerne ikke danner klynger, hvilket gør dem svære at indlæse i sprøjten og injicere, og nålen ikke bliver magnetiseret.
- Lad nålen på plads i 1 min post-injektion for at sikre, at perlerne afregne i iridokorneal vinkel at hindre vandige afløb fra trabekelværket. Lidt vinkel nålen efter perlerne er oprindeligt afgjort at tillade nogle udsivning af vandig, for at minimere forbigående stigninger i IOP. Ved afslutningen af operationen skylle nålen igennem med første phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter 70% ethanol efterfulgt af destilleret vand, for at sikre fortsat brug af nålen i separate procedurer. Alternativt kan man anvendeengangsnåle hvis den korrekte gauge og sprøjte kombination er tilgængelig. Valgfrit: nåle kan skærpes ved hjælp af en beveller at forlænge deres anvendelse.
- På dette tidspunkt, hvis nødvendigt fjernes magneten, og bruge det til at trække perler i områder med ufuldstændig dækning.
- Lad magneten på plads omkring øjet i yderligere 10 min post-injektion for at sikre perler afvikle godt ind i iridokorneal vinkel.
- Reverse anæstesi anvendelse af 0,25 mg / kg atipemezole hydrochlorid.
- Administrere chloramphenicol eller anden antibiotisk salve, fx gentamycin eller terramycin topisk at forhindre infektion, og 0,5% proparacainhydrochlorid for analgesi. Lad dyrene at komme på en varme måtten indtil de genvinde bevægelse, derefter overføre til en varm kasse og forsyning med ekstra næring, såsom et kosttilskud eller fugtet regelmæssig kost, indtil bedring er færdig. Systemisk eller lokal analgesi bør gives til dyr, der udviser tegn på smerte 24 timer efter operationen. Hvis THESe symptomerne fortsætter trods behandling, skal dyrene humant aflivet.
- Brug kontralaterale øje som en ikke-opererede kontrol.
- Tag IOP målinger hver 2-3 dage efter perle administration, og hver 2-3 dage derefter ved hjælp af en rebound tonometer kalibreret til brug i rotteøjet 9.
- Kriterierne for, herunder øjne i undersøgelser kan være: hvis 1) den IOP er hævet over den kontralaterale kontrol trykket med 5 mmHg, og 2) ikke overstiger 60 mmHg.
- Øjne hvor trykket vender tilbage til baseline (normalt ved en uge efter injektion), bør ikke indgå i undersøgelserne, men det er muligt at re-injicere perler i øjnene, der ikke udvikle high IOP, hvis det ønskes.
- Aflive dyr ved CO2-kvælning ved slutningen af eksperimentet.
- Dissekere øjne og optiske nerver, og fastgør i 4% paraformaldehyd (PFA) natten til yderligere histologisk analyse.
2. Vurdering Retinal Neuron Skade Brug TUNEL Sholdende
- For at kvantificere apoptotiske celler i hele mount retinasuse terminalen deoxynucleotidyltransferase-medieret dUTP nick-mærkning (TUNEL) assay i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Skær nethinden fra øjet kop, vaskes i 3 x 5 min i 0,3% Triton X-100 i phosphatpufret saltvand (T-PBS).
- Permeabilisere vævet i 3% T-PBS i 2 timer.
- Pre-ækvilibrere nethinder i ækvilibreringsbuffer i 10 minutter, før inkubering i TUNEL reaktionsopløsningen i 1 time ved 37 ° C.
- Vask vævet i 3 x 5 min i 0,3% T-PBS, skylles i 0,3% T-PBS indeholdende 5 pM DAPI, og flad-montere i montering medier.
- For at kvantificere TUNEL positive kerner anvende et konfokalt mikroskop for at tage 10 um z-stakke gennem ganglion cellelag ved 20X forstørrelse. Tag 3 billeder på hver af de 4 kronblade, på steder tæt på synsnerven, i midten af periferien, og ved langt periferien af nethinden, hvilket giver i alt 12 billeder pr hele Mount, prøveudtagning ca. 7.000 celler. Morfologiske kriterier diskrimineret ikke-neuronal (endotel og glia-celler) fra neuronale celler.
- Vælg områder for billeddannelse kun bruger den DAPI kanal og maske efterforskere til behandlingsgrupper.
3. Vurdering Optik nerveskader Brug Toluidinblåtfarvning
- Fix synsnerver natten over i Karnovsky opløsning ved 4 ° C.
- Behandl prøverne i 2 timer i 1% (w / v) osmiumtetroxid og derefter dehydrerer i 100% ethanol.
- Inkubér synsnerver i propylenoxid i 30 minutter, og placer i en 50:50 blanding af propylenoxid: Araldite natten over.
- Skift denne opløsning til 100% Araldite, efterfulgt af inkubation natten over ved 60 ° C.
- Cut semithin sektioner (0,75 mm tyk) og pletten med 1% toluidinblåt / borax (TB) i 50% ethanol før eksamen ved lysmikroskopi.
4. Statistisk analyse
- Udføre statistiske analyserer anvendelse af en passende statistikker softwarepakke. En to-vejs ANOVA med Newman-Keul post-hoc test kan anvendes til at beregne statistisk signifikans for IOP ændrer sig over tid.
- En p-værdi på mindre end 0,05, kan betragtes som væsentlig.
Representative Results
Injektion af magnetiske perler i iridokorneal vinkel konsekvent inducerede en langvarig og robust trykstigning (figur 1), som var let observeres ved det første tidspunkt, 3 dage efter injektion. Desuden blev stigningen i trykket opretholdes under hele forsøget, og selv om vores tid kursus færdig ved 18 dage efter injektion, mens andre har rapporteret, at presset fortsætter langsigtet 3. Den gennemsnitlige IOP gennemsnit over den fulde længde af eksperimentet for kontrol, ikke-perle-injicerede øjne var 19,7 ± 0,3 mmHg sammenlignet med 40,5 ± 2,8 mmHg for perle-injicerede øjne (p <0,001). Derudover peak IOP steg fra 22,8 ± 0,3 mmHg til 49,9 ± 2,3 mmHg.
For at bestemme hvorvidt den stigning i IOP fører til døden af retinale ganglieceller, udførte vi TUNEL-farvning på nethinder og histologi på tværgående optiske nerve sektioner (figur 2). I nethinden vi observeret en stigning i TUNEL-farvning (figur 2A) i perle-injicerede øjnene med forhøjet IOP. Antallet af apoptotiske kerner steg ca. 15-fold, fra 1,6 ± 0,5 celler i kontralaterale kontrol til 24,5 ± 0,5 celler i hypertensive nethinder (figur 2B; p <0,05). Desuden, i øjne, hvor magnetiske kugler blev injiceret men tryk ikke stige (sandsynligvis på grund af ufuldstændig blokering af iridokorneal vinkel), antallet af TUNEL-positive celler var ikke signifikant forskellige fra de ikke-injicerede kontroller (p> 0,05). Dette antyder, at celledød var relateret til trykket stiger, som ikke skyldes direkte toksicitet af de magnetiske mikrosfærer. Endelig undersøgte vi synsnerven patologi i glaukom model, og så akkumulering af toluidinblåt i mange af de axoner, der angiver degeneration af disse cellulære processer (figur 2C).
ure 1 "src =" / files / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Højde af intraokulært tryk under anvendelse af magnetiske mikrokugler. Injektion af magnetiske mikrokugler i forkammeret inducerede en robust, væsentlig stigning i intraokulært tryk (IOP) i sammenligning med kontralateral kontrol, ikke-injicerede øjne. Y-akse-enheder = millimeter kviksølv (mmHg). Data = middelværdi ± SEM. * = P <0,001; N = 12. Dette tal er blevet ændret fra Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.
Figur 2. Forhøjelse af IOP ved injektion af magnetiske mikrokugler i iridokorneal vinkel, induceret neuronal død i ganglion cellelag (GCL). (A) Repræsentative billeder af nethinder fra kontrol (til venstre) og grøn stær (højre) øjne farvet for apoptotiske kerner af TUNEL (grøn;hvide pile) og DAPI (blå), der angiver antallet af apoptotiske kerner steget som IOP rose. (B) Kvantificering af TUNEL-positive celler i GCL, der viser, at øjnene med forhøjet IOP (midten), havde signifikant mere apoptotiske celler i forhold til kontrol (venstre). I modsætning hertil i perle-injicerede øjne, hvor trykket ikke stiger (til højre), ingen signifikant stigning i TUNEL farvning blev observeret. Data = middelværdi ± SEM. * = P <0,05; N = 7 - 8 (C) Repræsentative billeder af synsnerven farvning, hvilket viser en stigning i toluidinblå akkumulation (sorte pile) i beskadigede axoner fra grøn stær (til højre), men ikke kontrol øjne (til venstre).. Scale barer = 50 um. Dette tal er blevet ændret fra Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.
Discussion
Her vise vi en fremgangsmåde til at inducere forhøjet IOP i rotter ved at injicere magnetiske mikrokugler ind i det forreste kammer i øjet. Denne metode er enkel at udføre, og kræver lidt kirurgisk ekspertise, eller timers øvelse og raffinement. Endvidere procedure er effektiv; sjældent kræver mere end en enkelt injektion af perler til at inducere en stærk, robust trykstigning (ca. 10% reinjektionsprocent). Det kan give en fordel i forhold til eksisterende inducerbare metoder, såsom den teknisk udfordrende episceral vene sklerose 11 model, eller laser fotokoagulation protokol 6, som kan kræve flere procedurer til opretholdelse rejst IOP.
For at metoden til at blive en succes men der er nogle små vigtige skridt, der skal træffes. For det første er det nyttigt at anvende en toroidformede magnet til at trække perlerne ind i iridokorneal vinkel. Dette trin er en modifikation af den oprindelige protokol, Where perlerne blev injiceret i det forreste kammer, og derefter flyttes frihånd omkring øjet 3. Ved hjælp af en ringformet magnet betyder, at mikrosfærer skal bosætte jævnt omkring vinklen, der kræver minimal manuel omfordeling. For det andet bør hastigheden af injektionen være hurtig - for langsom og perlerne vil overvejende samle sig på den ene side af den vinkel, hvilket fører til ufuldstændig dækning, og potentielt ingen trykstigning. Generelt om fremgangsmåden er ligetil nok, at brugeren let kan foretage ændringer af protokollen, såsom at variere størrelsen eller mængden af mikrosfære partikler, måske for at forsøge at ændre graden af IOP elevation.
, En potentiel ulempe ved fremgangsmåden er imidlertid, at man har lidt kontrol over omfanget af den hypertension, som i ca. 5-10% af tilfældene vi observerede steg over 60 mmHg. Overdreven stigninger i IOP kan være meget ødelæggende for retinal væv, og kan gøre at studere de mekanismer og biologien af celledød udfordrende. Imidlertid er fremgangsmåden frembringer en ensartet neuronal patologi, både i nethinden og synsnerven, som kan manipuleres farmakologisk 12. Dette kan gøre model attraktiv for udvikling af nye terapeutiske midler til behandling af glaukom. Desuden, fordi perlerne ledes ind i iridokorneal vinkel, dette giver den visuelle akse fri for levende billeddannelse af nethinden eller optisk disk. Vi forventer, at denne model vil blive tilpasset og anvendes til fremtidige anvendelser i andre arter, herunder mus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats | Harlan UK | 203 | |
| Tonolab Rebound Tonometer | Tiolat | TV02 | |
| Ketaset (ketamine) | Fort Dodge Animal health | BN1000118 | 37.5 mg/kg |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) | Orion Pharma | 140-999 | 0.25 mg/kg |
| Povidone iodine | Ecolab | BN4369LE10 | 5% in H2O |
| Minim's Saline Solution | Bausch and Lomb | PL00033/5017 | |
| Toroidal magnet | Supermagnete | R-10-07-03-N | |
| Magnetic Microspheres | Bangs Laboratories | UMC4N/9692 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| 33 G beveled needle | Hamilton | 7747-01 | Custom needle |
| Luer tip syringe | Hamilton | 80601 | |
| Antisedan (atipemezole hydrochloride ) | Orion Pharma | 141-003 | 0.25 mg/kg |
| Chloramphenicol ointment | Medicom | 18956-0005 | |
| TUNEL staining kit | Promega | G3250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review. JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Libby, R. T., et al. Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration. Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).
- Morrison, J. C. Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat. J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).
- Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat. Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).
- Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).
- Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).
- Isenberg, S. J. The ocular application of povidone-iodine. Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
- Foxton, R. H., et al. VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma. Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).
