Introduction
Primär glaukom är en förödande ögonsjukdom drabbar uppskattningsvis 60.500.000 människor i hela världen 1, vilket kan leda till livsförändrande synförlust och blindhet 2. Forskning om sjukdomsmekanismer och utveckling av nya behandlingsmetoder för glaukom, är beroende av goda modeller av sjukdomen som rekapitulera några av kännetecknen för patologi.
Vi presenterar här en råtta glaukom modell baserad på metoden för Samsel et al. 3 Det övergripande målet med denna teknik är att öka det intraokulära trycket (IOP) i ögat genom att injicera magnetiska mikrosfärer i den främre kammaren, och med hjälp av en magnetisk ring, direkt dem i iridokorneal vinkel. Detta hindrar vattenutflöde, vilket ökar IOP, vilket leder till neuronal skada och cellförlust. Den protokoll utvecklades för att försöka åstadkomma ett enklare, inducerbar modell av glaukom.
Detta protokoll kan ha vissa fördelaröver existerande tekniker. Genetiska musmodeller såsom DBA / 2J är tillgängliga, vilket inte kräver rutiner för att initiera, men dessa kan ha ett oförutsägbart debut sjukdomsprogression 4. Däremot inducerbara modeller, varav de flesta är beroende av kirurgiskt upplyft IOP på gnagare, har den fördelen att initieringen kan styras av användaren. Vissa av dessa metoder kan ha nackdelar egna dock även vara tekniskt utmanande 5, och kan kräva flera förfaranden för att upprätthålla förhöjt IOP 6.
I motsats härtill är den inducerbara metod beskrivs i detalj i detta manuskript en enkel, effektiv och reproducerbar teknik som producerar stabila, robusta ökningar i tryck, med minimalt behov av återinjektion. Dessutom tar det inte innebär dyr utrustning, och endast kräver grundläggande kirurgiska färdigheter att utföra. Detta protokoll kan vara lämplig för läsare som funderar på att inrätta ett mindre tekniskt krävande inducerbartglaukom modell i deras laboratorium.
Protocol
Etik uttalande: Alla djurförsök har utförts i enlighet med Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC), och godkändes i samförstånd med Storbritannien Home Office riktlinjer ( http://goo.gl/FLkirW , senast tillgängliga 10: e juni , 2014) och Arvo Uttalande om användning av djur i oftalmisk och Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , senast tillgängliga 10: e juni, 2014).
1. okulär hypertension Induktion
- Framkalla experimentell glaukom genom att lyfta det intraokulära trycket (IOP) via unilateral injektion av paramagnetiska mikrosfärer i främre kammaren i Brown Norway råttor, baserat på den metod för Samsel et al. 3 Övriga pigmenterade råttor kan vara lämpliga, även om dessa skulle behöva valideras först av användaren.
- Hus 250-300 g kvinnligaex-uppfödare Brown Norway råttor i en konstant svagt ljus miljö (40-60 lux) för att minimera dagaktiva fluktuationer i IOP 7, med tillgång till mat och vatten efter behag.
- Ta baslinjemätningar lOP i vakna djur 8 före anestesi och vulst injektion, med användning av en rekyl tonometer kalibrerad för användning i råttögon 9. IOP tas som medelvärdet av fem avläsningar.
- Bedöva råttor med 37,5 mg / kg ketamin, och 0,25 mg / kg medetomidinhydroklorid levereras intraperitonealt. Bekräfta anestesidjup genom att testa djurets bakre fot reflexer, före povidonjodid ansökan (se steg 1.5), och pärla injektion (se steg 1,8). Administrera 0,5% proparakain hydroklorid för smärtlindring.
OBS: Ta inte vidga pupillen i något skede. Detta kommer att hjälpa pärlorna att lösa bättre i iridokorneal vinkel och förhindrar bindning till linsen. Applicera okulär salva för att förhindra hornhinnan torkning på icke-opererad kontra öga. - WGlödga operativa ögat med 5% povidonjod i vatten 10 5 min före injektion.
- Efter 5 minuter, veken povidon jod av med steril gasbinda, och tvätta ögat med 0,9% steril koksaltlösning. Håll ögat fuktigt under anestesi med regelbunden applicering av steril saltlösning.
- Placera en toroid magnet runt ögat.
- Injicera 25 ul av en lösning innehållande 30 mg / ml av gammabestrålning steriliserad 8 xm magnetiska mikrosfärer i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) i den främre kammaren, med användning av en 33 G avfasad nål.
- För att förbereda pärlor, tvätta genom återsuspensions, sedan centrifugera 3 gånger vid 10000 xg under 5 min med 1 ml HBSS, innan den slutliga 30 mg / ml lösning. Bibehåll sterila förhållanden hela.
- För injektion, vara noga med att undvika att föra in nålen till iris, för att minimera risken för iris trauma. Detta kan förhindras genom att orientera nålen tangentiellt till hornhinnans yta, som är parallell mediris som möjligt. Detta kommer också att hjälpa till att minimera pärla förlusten från injektionsstället.
OBS: Injicera pärlor i snabb takt för att säkerställa en jämn fördelning runt iridokorneal vinkel, vilket är avgörande för att höja IOP. Dessutom butikspärlor, nålar och magnetiska ringar separat så att pärlorna inte bildar kluster, vilket gör dem svåra att lasta in i sprutan och injicera, och nålen inte blir magnetiserad.
- Låt nålen på plats under 1 min efter injektion för att säkerställa att kulorna lösa in i iridokorneal vinkel för att hindra vattendränering från det trabekulära nätverket. Något vinkel nålen efter pärlorna har initialt bosatte att tillåta viss läckage av vatten, för att minimera övergående ökning av IOP. Vid slutet av operationen spola nålen igenom med första fosfatbuffrad saltlösning (PBS), därefter 70% etanol följt av destillerat vatten, för att säkerställa fortsatt användning av nålen i separata förfaranden. Alternativt kan man användaengångsnålar om rätt spårvidd och spruta kombinationen är tillgänglig. Tillval: nålar kan slipas med hjälp av en beveller att förlänga deras användning.
- I detta skede om det behövs, ta bort magneten, och använda den för att dra pärlor i områden med ofullständig täckning.
- Låt magneten på plats runt ögat i ytterligare 10 min efter injektion för att säkerställa pärlor bosätta långt in på iridokorneal vinkeln.
- Omvända anestesi använder 0,25 mg / kg atipemezole klorid.
- Administrera kloramfenikol, eller annan antibiotika salva, t.ex. gentamycin eller terramycin lokalt för att förhindra infektion, och 0,5% proparakain hydroklorid för smärtlindring. Lämna djuren att återhämta sig på en värmematta tills de återfår rörelsen, sedan överföra till en varm box och försörjning med extra näring, till exempel ett kosttillskott eller fuktad vanlig kost tills återhämtningen är klar. Systemisk eller lokal smärtlindring bör ges till djur som visar tecken på smärta 24 timmar efter operationen. Om these symtomen kvarstår trots behandling, bör djuren humant avlivas.
- Använd den andra ögat som en oanvänd kontroll.
- Ta IOP mätningar var 2-3 dagar efter pärla administration, och var 2-3 dagar därefter med hjälp av en rekyl tonometer kalibrerad för användning i rått ögat 9.
- Kriterierna för bland annat ögon i studier kan vara: om 1) IOP är upphöjd över den kontrastyrtrycket med 5 mmHg, och 2) inte överstiger 60 mmHg.
- Ögon där trycket återgår till baslinjen (vanligen med 1 vecka efter injektion) inte bör ingå i studierna, men det är möjligt att åter injicerar pärlor i ögonen som inte utvecklar högt IOP om så önskas.
- Euthanize djur genom CO2 kvävning vid slutet av experimentet.
- Dissekera ögon och synnerver, och fixa i 4% paraformaldehyd (PFA) över natten för vidare histologisk analys.
2. Bedöma Retinal Neuron Skador Använda TUNEL Slande
- För att kvantifiera apoptotiska celler i hela montera retinasuse terminal deoxinukleotidyltransferas-förmedlad dUTP nick-märkning (TUNEL) -analys, enligt tillverkarens instruktioner.
- Dissekera näthinnan från ögonkoppen, tvätta för 3 x 5 min i 0,3% Triton X-100 i fosfatbuffrad saltlösning (T-PBS).
- Permeabilize vävnaden i 3% T-PBS under 2 h.
- Pre-jämvikt näthinnor i jämviktsbuffert under 10 min, före inkubation i TUNEL reaktionslösningen under 1 h vid 37 ° C.
- Tvätta vävnaden för 3 x 5 min i 0,3% T-PBS, skölj i 0,3% T-PBS innehållande 5 iM DAPI, och platt-mount i monteringsmedier.
- För att kvantifiera Tunel positiva kärnor använder en konfokalmikroskop att ta 10 um z-stackar genom gangliecell lagret vid 20X förstoring. Ta 3 bilder på varje av de fyra kronblad, sker i närheten av synnerven, i mitten av periferin, och längst periferin av näthinnan, vilket ger totalt 12 bilder per hel Mount, provtagning cirka 7.000 celler. Morfologiska kriterier diskriminerade icke-neuronala (endotel och gliaceller) celler från nervceller.
- Välj områden för avbildning enbart med hjälp av DAPI kanalen, och mask utredare till behandlingsgrupper.
3. Bedöma optisk nervskada Använda toluidinblått Färgning
- Fix synnerver natten i Karnovsky lösning vid 4 ° C.
- Behandla exemplar för 2 h i 1% (vikt / volym) osmiumtetroxid och sedan dehydrera i 100% etanol.
- Inkubera synnerver i propylenoxid i 30 min, och placera i en 50:50 blandning av propylenoxid: Araldite natten.
- Ändra denna lösning till 100% Araldite, följt av inkubering över natten vid 60 ° C.
- Cut halvtunn sektioner (0,75 mm tjocka) och fläcken med 1% toluidinblått / borax (TB) i 50% etanol före undersökning med ljusmikroskop.
4. Statistisk analys
- Utför statistiska analyserar använder en lämplig statistik programpaket. En tvåvägs ANOVA med Newman-Keul post-hoc test kan användas för att beräkna statistisk signifikans för IOP förändras över tiden.
- Ett p-värde av mindre än 0,05 kan vara betydande.
Representative Results
Injektion av magnetiska kulor i iridokorneal vinkeln konsekvent inducerade en långvarig och robust tryckökning (Figur 1), som var lätt observerbar vid den första tidpunkten, 3 dagar efter injektion. Vidare var ökning av trycket upprätthålls under hela experimentet, och även om vår tid kursen slutade på 18 dagar efter injektion, har andra rapporterat att trycket kvarstår långsiktigt 3. Medelvärdet IOP medelvärde över hela längden av experimentet för kontroll, icke-pärla-injicerade ögon var 19,7 ± 0,3 mmHg, jämfört med 40,5 ± 2,8 mmHg för pärla-injicerade ögon (P <0,001). Dessutom ökade topp lOP från 22,8 ± 0,3 mmHg till 49,9 ± 2,3 mmHg.
För att avgöra om höjden i IOP leder till döden av retinala ganglieceller, utförde vi Tunel färgning på näthinnor, och histologi på tvärgående synnerven sektioner (Figur 2). I näthinnan vi observerade en ökning av TUNEL färgning (Figur 2A) i pärla-injicerade ögonen med förhöjt IOP. Antalet apoptotiska kärnor ökade ungefär 15-faldigt, från 1,6 ± 0,5 celler i kontralaterala kontroller, till 24,5 ± 0,5 celler i hypertensiva näthinnor (figur 2B, p <0,05). Vidare i ögonen där magnetiska pärlor injicerades men trycket ökade inte (troligtvis på grund av ofullständig blockering av iridokorneal vinkel), antalet TUNEL-positiva celler var inte signifikant från de av uninjected kontroller (P> 0,05). Detta tyder på att celldöd var relaterad till trycket ökar, inte på grund av direkt toxicitet av de magnetiska mikrosfärer. Slutligen undersökte vi synnerven patologi i glaukom modellen, och såg ackumulering av toluidinblått i många av axoner, vilket indikerar degeneration av dessa cellulära processer (figur 2C).
ure 1 "src =" / filer / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Förhöjning av intraokulärt tryck med användning av magnetiska mikrosfärer. Injektion av magnetiska mikrosfärer i den främre kammaren inducerade en robust, betydande ökning av det intraokulära trycket (lOP) i jämförelse med kontralaterala kontroll, icke-injicerade ögonen. Y-axeln heter = millimeter kvicksilver (mmHg). Data = medelvärde ± SEM. * = P <0,001; N = 12. Denna siffra har modifierats Foxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.
Figur 2. Höjd av IOP genom injektion av magnetiska mikrosfärer i iridokorneal vinkel, inducerad nervcellsdöd i ganglion cellager (GCL). (A) Representativa bilder av näthinnor från kontroll (vänster) och glaukom (höger) ögon färgade för apoptotiska kärnor av TUNEL (grön;vita pilar) och DAPI (blå), som anger antalet apoptotiska kärnor ökade IOP steg. (B) Kvantifiering av Tunel positiva celler i GCL, som visar att ögonen med förhöjt IOP (mitten), hade betydligt mer apoptotiska celler i jämförelse med kontroll (till vänster). Däremot i pärla-injicerade ögon där trycket inte stiger (till höger), ingen signifikant ökning av TUNEL färgning observerades. Data = medelvärde ± SEM. * = P <0,05; N = 7-8 (C) Representativa bilder av synnerven färgning, visar en ökning av toluidinblått ackumulation (svarta pilar) i skadade axoner från glaukom (höger), men inte kontroll ögon (till vänster).. Skalstrecken = 50 | im. Denna siffra har modifierats Foxton et al., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.
Discussion
Här visar vi en metod för att inducera förhöjt lOP i råtta, genom att injicera magnetiska mikrosfärer in i den främre kammaren i ögat. Denna metod är enkel att utföra, och kräver lite kirurgisk kompetens, eller timmar av praxis och förfining. Dessutom är det förfarande effektivt; sällan som kräver mer än en enda injektion av pärlor att framkalla en stark, robust tryckökning (ca 10% återföring hastighet). Detta kan ge en fördel jämfört med befintliga inducerbara metoder, såsom den tekniskt utmanande episceral ven skleros 11 modell, eller laserfotokoagulation protokoll 6, vilket kan kräva flera rutiner för att upprätthålla upphöjda IOP.
För att metoden ska lyckas men det finns några små kritiska steg som måste tas. Det första är det lämpligt att använda en toroidformad magnet för att dra pärlorna in i iridokorneal vinkel. Detta steg är en modifiering av det ursprungliga protokollet, where pärlorna injicerades i främre kammaren, och flyttade sedan frihand runt ögat 3. Med hjälp av en toroid magnet betyder att mikrosfärer bör bosätta jämnt runt vinkel, kräver minimal manuell omfördelning. För det andra bör injektionshastigheten vara snabb - för långsamt och pärlorna kommer främst samlas på en sida av vinkeln, vilket leder till ofullständig täckning, och potentiellt ingen tryckökning. Generellt sett är dock metoden tillräckligt enkla att användaren lätt kan göra ändringar av protokollet, såsom att variera storleken eller volymen av mikrosfärpartiklar, kanske för att försöka förändra graden av IOP höjden.
Emellertid är en potentiell nackdel med den metoden att man har liten kontroll över omfattningen av hypertoni, vilket i ca 5-10% av fallen vi observerade steg över 60 mmHg. Alltför stiger i IOP kan vara mycket destruktivt för näthinnevävnad, och kan göra att studera de mekanismer och bionik av celldöd utmanande. Emellertid producerar metoden ett konsekvent neuronal patologi, både i näthinnan och synnerven, vilket kan manipuleras farmakologiskt 12. Detta kan göra modellen attraktivt för att utveckla nya terapier för behandling av glaukom. Dessutom, eftersom pärlorna är riktade in i iridokorneal vinkel, detta lämnar synaxeln fri för levande avbildning av näthinnan eller optisk skiva. Vi räknar med att denna modell kommer att anpassas och användas för framtida tillämpningar inom andra arter, inklusive mus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 - 300g female Brown Norway ex-breeder rats | Harlan UK | 203 | |
| Tonolab Rebound Tonometer | Tiolat | TV02 | |
| Ketaset (ketamine) | Fort Dodge Animal health | BN1000118 | 37.5 mg/kg |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) | Orion Pharma | 140-999 | 0.25 mg/kg |
| Povidone iodine | Ecolab | BN4369LE10 | 5% in H2O |
| Minim's Saline Solution | Bausch and Lomb | PL00033/5017 | |
| Toroidal magnet | Supermagnete | R-10-07-03-N | |
| Magnetic Microspheres | Bangs Laboratories | UMC4N/9692 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| 33 G beveled needle | Hamilton | 7747-01 | Custom needle |
| Luer tip syringe | Hamilton | 80601 | |
| Antisedan (atipemezole hydrochloride ) | Orion Pharma | 141-003 | 0.25 mg/kg |
| Chloramphenicol ointment | Medicom | 18956-0005 | |
| TUNEL staining kit | Promega | G3250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 |
References
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
- Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review. JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).
- Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).
- Libby, R. T., et al. Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration. Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).
- Morrison, J. C. Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat. J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).
- Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat. Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).
- Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).
- Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).
- Isenberg, S. J. The ocular application of povidone-iodine. Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).
- Foxton, R. H., et al. VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma. Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).
