Abstract
Ultracentrifugação analítica (AUC) pode ser usado para estudar as interacções reversíveis entre macromoléculas sobre uma ampla gama de forças de interacção e em condições fisiológicas. Isso faz com que AUC um método de escolha para avaliar quantitativamente estequiometria e termodinâmica dos homo e hetero-associação que são transitórias e reversíveis nos processos bioquímicos. Na modalidade de equilíbrio de sedimentação (SE), um equilíbrio entre difusão e sedimentação fornece um perfil como uma função da distância radial que depende de um modelo de associação específica. Nisto, um protocolo detalhado SE é descrita para determinar a energia associação tamanho e monómero-monómero de uma pequena oligómero de proteína de membrana usando uma ultracentrífuga analítica. ES-AUC é livre de marcador, apenas com base em princípios físicos, e pode ser usado em ambas as proteínas solúveis da membrana e água. Um exemplo é mostrado deste último, o pequeno hidrofóbico (SH) nas proteínas do vírus sincicial respiratório humano (HRSV), Um polipeptídeo de ácido 65-amino com um único transmembranar (TM) de domínio helicoidal-α que forma canais de iões pentaméricos. Dados estrutural à base de RMN mostra que a proteína tem duas SH protonável resíduos de His no seu domínio transmembranar que são orientados de frente para o lúmen do canal. SE experimentos foram concebidos para determinar como pH afeta constante de associação e do tamanho da proteína oligomérica SH. Embora a forma pentamérica foi preservada em todos os casos, a sua constante de associação foi reduzida a pH baixo. Esses dados estão de acordo para uma dependência de pH semelhante ao observado para atividade canal SH, consistente com uma orientação do lúmen das duas Seus teor de resíduos no proteína SH. Este último pode experimentar repulsão eletrostática e estabilidade oligômero reduzida em pH baixo. Em resumo, este método é aplicável sempre que a informação quantitativa sobre proteína-proteína subtis alterações de associação em condições fisiológicas têm de ser medidos.
Introduction
Ultracentrifugação analítica 1-5 é um dos métodos mais importantes para estudar as interações de macromoléculas em condições fisiológicas, sendo acessível para ambas as interações fracas e fortes. O método é livre-label e utiliza a absorção de luz ou interferência, e até mesmo sistemas ópticos de fluorescência pode ser usado para acessar faixas de concentração ao longo de várias ordens de magnitude 6.
Este método é especialmente útil, pois a maioria dos processos bioquímicos dependem de interações reversíveis. A estequiometria e resistência destas interacções têm de ser quantitativamente caracterizada para compreender os processos biológicos, e um número de métodos existentes para este fim 7, 8. No entanto, as interacções transientes são difíceis de estudar 9.
A escolha de um método para caracterizar as interacções macromoleculares depende da sua natureza estática ou dinâmica. No primeiro caso, SEDIM entação velocidade (SV) é usada, em que a taxa de transporte radial é medida e complexos são fraccionados com base em diferenças na massa e forma flutuante.
Em contraste, as associações dinâmicas que são reversíveis na escala temporal da experiência não pode ser fisicamente separadas. Neste caso, auto ou hetero-interacções que as interacções não covalentes são em um equilíbrio que depende da concentração de proteína total. Estas interacções dinâmicas pode ser estudado por ambos equilíbrio de sedimentação (SE) e velocidade de sedimentação (SV) 10. No entanto, o primeiro método é mais simples de realizar e é descrito aqui. Em SE, a centrifugação é realizada a uma velocidade suficientemente baixa de modo a que se atingir um equilíbrio entre difusão e sedimentação. Neste ponto, o perfil de equilíbrio de um sinal óptico (UV-VIS), como uma função da distância radial, pode ser analisada utilizando modelos termodinâmicos pré-definido para associações 11.
ve_content "> No presente documento, um estudo de equilíbrio de sedimentação, é apresentado o auto-associação de uma proteína da membrana virai que forma canais de iões. Devido à sua hidrofobicidade, a experiência é executado em presença de detergentes, e no presente caso, a densidade de solvente tem de ser compensada com a do detergente. No entanto, o protocolo descrito seria idêntica no caso de uma proteína solúvel em água, excepto que sem correspondência de densidade solvente seria necessário.A proteína utilizada é codificado no vírus respiratório sincicial humano (hRSV), um pneumovirus envelopado na família paramyxoviridae que causa a doença do trato respiratório inferior em crianças, idosos e imunocomprometidos populações em todo o mundo 12. Até 64 milhões de casos notificados de infecção hRSV e 160.000 mortes ocorrem a cada ano.
O genoma hRSV transcreve 11 proteínas, incluindo as proteínas de membrana de três F, G, e pequeno hidrofóbico (SH). SH proteína está envolvidana patogênese da infecção pelo VSR. RSV sem o gene SH (RSVΔSH) era viável, causou a formação de sincícios e cresceu tão bem como o tipo selvagem (WT) vírus 13-16. No entanto, o vírus RSVΔSH replicado 10 vezes menos eficientemente do que o WT no tracto respiratório superior 15, 16. Além disso, o vírus RSVΔSH foi atenuada nos no rato vivo e modelos chimpanzé 13, 17.
A proteína é um SH (RSV subgrupo A) 64 ou 65 (RSV subgrupo B) aminoácidos de comprimento do tipo II de proteína integral da membrana que se acumula maioritariamente nas membranas do Golgi compartimento 18. SH proteína tem um único previu uma hélice transmembranar (TM) 19 de domínio que é altamente conservada 20,21. Os domínios extramembrane C- e N-terminais são orientados lumenally / extracelularmente e no citoplasma, respectivamente.
Ambos domínio TM sintético (resíduos 18-43) E SH proteína de comprimento completo foram mostrados para formar homopentamers em uma variedade de detergentes. A forma homopentameric é responsável pela atividade do canal em bicamadas lipídicas planas 22,23. A orientação correcta dos monómeros TM na bicamada lipídica foi primeiro determinada utilizando dicroismo local específico de infravermelhos 23, o qual mostrou His-22 para estar em uma luminal, perto de inter-helicoidal, a orientação. O domínio TM mesma orientação foi confirmada por estudos de RMN que reconstituídas a pentamérica um feixe helicoidal da proteína de comprimento completo em dodecylphosphocholine (DPC) 22 micelas. Neste modelo 'micela', um único domínio TM a- helicoidal foi flanqueada no terminal-N por uma a-hélice, e C-terminal por uma b-gancho de cabelo estendida. Os dois resíduos de proteína protonáveis SH, His-22 e His-51, estão localizados no domínio TM (orientada lumenally), e na extremidade do C-terminal extramembrane β hairpin (medida a partir da poro do canal), respectivamente. Em um ambie bicellarnment, no entanto, o TM α-hélice estende-se a His-51, e ambos os resíduos His são acessíveis para o lúmen do canal 24. A estrutura do canal adopta uma arquitectura em forma de funil 22, onde a região mais estreita (Ser-Cys-29 a 45) 22 está alinhada com cadeias laterais hidrofóbicas (Ile-32, Ile-36, Ile-40 e Leu-44), e Ile-36 define o ponto mais estreito no lúmen do canal. His-22 está localizado na maior abertura deste funil, enquanto que His-51 está na ponta de abertura mais pequena.
No presente documento, centrifugação analítica em equilíbrio de sedimentação de um modo foi usado para determinar se a sua protonação afecta a estabilidade do pentâmero da proteína de CS. Neste caso, SH proteína foi solubilizada em detergente de betaína-C14, que tem sido utilizado anteriormente para mostrar que as formas de proteínas pentaméricas oligómeros SH 22.
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Protocol
Este protocolo é baseado nos seguintes recursos, que devem ser encaminhados para mais detalhes e considerações especiais 3, 25-28.
1. Densidade de harmonização de micelas detergentes com 2 H2O
Nota: A densidade da solução tampão deve ser adaptada à densidade das micelas detergentes. Agentes de ajuste de densidade comuns incluem 2 H 2 O, 2 H 18 O, 2 H 2 O 18, glicerol e sacarose 29. H 2 O 18 tem a mesma densidade que 2 H 2 O e pode ser uma escolha melhor se deuteração de protões permutáveis na proteína não é desejado. Neste processo, a densidade de 3- -propanesulfonate (C14SB) detergente (N, N-dimethylmyristylammonio) em Tris 50 mM pH 7,3, NaCl 100 mM será combinado com 2 H 2 O. Como uma estimativa inicial as seguintes concentrações de2 H2O será utilizado: 10, 30, e 50% v / v.
1.1. Preparação de amostra
- Preparar as seguintes soluções de reserva e esterilizar filtro através de um filtro de seringa de 0,2 um: 50 ml de Tris 500 mM pH 7,3 e NaCl 1 M (tampão 10X); 1 mL C14SB 250 mM (solução detergente 50X).
- Prepare a 200 ul de solução de amostra através da mistura de 20 uL 10X tampão, 4 ul 50X solução detergente, 20 ul de H 2 O 2 (99,9%), e 156 ul de H2O desionizada Prepare também 200 jil de solução de referência, através da mistura de 20 uL solução tampão 10X, 20 ul de H 2 O 2 (99,9%), e 160 ul de H2O desionizada
- Repetir o passo 1.1.2 para os outros 2 H 2 O concentrações, isto é, 30% e 50%, ajustando as quantidades de H 2 O 2 e H 2 O apropriadamente.
1.2. Assembleia de 6 canais AUC células e as amostras de carregamento para dentro das células.
Nota: Existem dois tipos de células AUC, dependendo do método de carregamento de amostra. As células sem preenchimento externa tem de ser carregados antes da sua selagem da célula, ao passo que as células de enchimento externo pode ser carregado depois as células são selados. Montagem de uma célula de AUC externa de enchimento foi descrito anteriormente 3. Neste protocolo, a montagem de uma célula AUC 6 canais sem abastecimento externo é descrito. A principal diferença é que tem anéis de rosca de ambos os lados que têm de ser apertadas separadamente, e ele não precisa de tampões de habitação (Fig. 1). A diferença de etapas de montagem são destacadas a seguir.
Figura 1. Vista explodida de uma célula AUC 6 canais sem abastecimento externo. Este valor foi modificado a partir do Beckman Coulter An-50 e An-Ti Ti 60 Analytical Rotor, Cells, e manual do usuário frontal.
- Preparar dois conjuntos de janelas para cada célula da AUC com janela de safira, em vez da janela de quartzo (Fig. 2). Coloque a junta da janela no suporte da janela. Ligeiramente dobrar o forro de janela e colocá-lo no suporte da janela de tal modo que a abertura é formada para a ranhura oposta titular janela. Coloque a janela de safira dentro do forro janela, alinhando a marca com a chaveta titular janela.
Nota:. A janela de quartzo é compressível e, portanto, irá produzir refracção mais luz a alta velocidade 28, 30 Portanto, para medições de interferência acima de 30000 rpm, como nesta experiência correspondente densidade, são utilizadas janelas de safira. Uma janela de safira, é mais pesado do que a janela de quartzo e tem um "X" para o lado gravado.
Figura 2. Vista explodida of o conjunto janela. Este valor foi modificado a partir do Beckman Coulter An-50 e An-Ti Ti 60 Analytical Rotor, de células e, manual do usuário Counterbalance
- Coloque o compartimento celular com o número de peça de cabeça para baixo. Com os keyways alinhadas com a chave da habitação, deslizar para dentro da caixa de células em primeiro lugar, uma peça central de 6 sector com o lado chanfrado para baixo, seguido por um conjunto de janela com a janela virada para baixo (Fig. 1, à esquerda).
- Cubra ligeiramente o roscas do anel de rosca e anel de parafuso arruela com spinkote. Coloque uma arruela anel de parafuso na parte superior do conjunto janela. Instale o anel de parafuso na habitação janela com a palavra "OUT" voltado para fora. Aperte o anel de parafuso utilizando a ferramenta de alinhamento celular.
- Usando a chave de torque, aperte o anel de parafuso para apenas 60 libras por polegada.
- Coloque a célula com o número de peça vertical e posicionadas em 12 horas. Load 120 ul de referência para as carreiras da esquerda e 110 ul de amostra para as carreiras da direita. Certifique-se de que cada amostra e referência está corretamente pareado.
Nota: O volume de amostra exacta não é crítica, mas a referência precisa de ter um pouco mais do que o volume da amostra (5-10 uL) de modo que o menisco da amostra sejam distintas. - Cuidadosamente deslize para dentro do conjunto habitacional celular uma janela com a janela virada para baixo (Fig. 1, à direita). Tome cuidado para não perturbar o celular excessivamente e derramar o conteúdo.
- Repita o passo 1.2. 3 e 1.2. 4, apertando o segundo anel de parafuso para 120 libras por polegada. Inverter o celular e voltar a apertar o primeiro anel de parafuso para 120 libras por polegada.
- Carregar as células dentro do rotor, instalar o rotor no centrifugador e instalar o monocromador de acordo com as instruções do fabricante 28.
Nota: Os detalhes deste step também pode ser encontrado nesta referência 3.
1.3. Configurando medição interferência
- Inicie o software de interface de usuário para o instrumento AUC e realizar a configuração de laser radial e calibração para cada célula a 3000 rpm, de acordo com as instruções do fabricante, que serão resumidos na etapa seguinte.
- 1.3.1.1 Depois de vácuo suficiente tiver sido atingido (<100 micra), executar a centrifugar a 3000 rpm. Visualize o padrão de interferência no software de interface de usuário e ajustar os parâmetros do laser para obter o mais alto contraste.
- Criar um novo ajustar o arquivo (File | New File) especificando "Equilibrium" e "interferência" de medição. Configurar um método de equilíbrio de sedimentação (botão "Method") para serem executadas em 45000 rpm ou a velocidade mais alta prevista para amostras de proteínas, o que for maior, com temperatura de execução a 20 ° C e coletar uma verificação a cada 15 minutos. Monitor equilíbrio andamento abrindo os arquivos de dados em HeteroAnalysis e selecionando a função "Match", depois de pelo menos 12 horas (aproximadamente durante a noite, Fig. 3).
Nota: a função similar também está disponível em SEDFIT (Opções | Carregando Opções | Teste abordagem para Equilibrium).
Figura 3. O resultado de função HeteroAnalysis Match. A função de fósforo pode ser usado para monitorar o progresso de equilíbrio, comparando RMSD entre as varreduras sucessivas e a última verificação. Este exemplo mostra para atingir o equilíbrio depois de 8 horas, tal como indicado por valores RMSD assimptóticas ao eixo-X.
1.4. Análise de dados
- Para cada conjunto de amostras, traçar o declive do perfil de distribuição radial contra o 2 H2O concentração.
Nota: A distribuição será um muito superficial exponencial que apabordagens linearidade. Intersecção do eixo-X corresponde à concentração de H 2 O 2 correspondentes. - Para resultados mais precisos, realizar o experimento em várias repetições. Alternativamente, repetir a experiência com uma faixa mais estreita de 2 H 2 O concentração.
2. Sedimentação equilíbrio do SH em micelas C14SB
2.1. Parâmetros de execução
- Calcular a densidade e viscosidade do tampão, a proteína volume específico parcial e velocidade de centrifugação usando SEDNTERP. Para calcular a densidade e viscosidade de buffer, selecione Compute na seção "Buffer de Dados Select" e insira os componentes do tampão em conformidade, incluindo a D 2 O concentração.
- 2.1.1.1 Para calcular proteína volume específico parcial, selecione Compute na secção de "V-bar" e digite a sequência de aminoácidos da proteína. Especifique o tamanho oligom�ica esperado mais alto em "Faça um oligômero deste monômero: N ="campo, neste caso N = 5. Calcule a velocidade ao entrar valores no campo RPM na janela principal até σ ≈ 1; esta é uma regra de ouro para garantir uma boa forma exponencial do perfil de distribuição radial 25.
Nota: Os valores calculados para esta experiência foi a seguinte: ρ = 1,03839 g / ml, 1,0267 η = cP = 0,7569 ml / g, 1 ω = 16000 rpm. - Calcule velocidades posteriores a seguir para garantir adequada diferença entre o perfil de distribuição em uma velocidade e no próximo 25.
Nota: Isto também pode ser feito a partir da função "Estimar equilíbrio rotor acelera função" em SEDFIT, que leva em conta a coluna de solução (volume de enchimento).
2.2. Preparações de amostras
- Prepare 1 ml de solução de referência com mM C14SB 5 e 32,3% 2 H 2 O, conforme determinado a partir de experimento correspondente densidade (seção 1), através da mistura de 100 l solutio 10X tampãon (passo 1.1.1), 20 ul de 50X solução detergente (passo 1.1.1), 323 ul de H 2 O 2 (99,9%) e 527 ul de H2O desionizada
- Dissolve-se liofilizado, SH péptidos purificados por HPLC (expressão e purificação descrito anteriormente 31) num solvente apropriado tal como metanol ou 50% v / v de acetonitrilo aquoso. Medir A280 dos péptidos dissolvidos em escala microlitro espectrofotómetro UV / Vis e alíquota para três amostras para dar um 280, 12 mm = 0,3, 0,5, e 0,8 (A280, 10 milímetros = 0,25, 0,417, e 0,67) quando diluída para cada 130 ul. Liofilizar as amostras durante a noite e ressuspender em 130 solução de referência ul (passo 2.2.1) para dar soluções de amostra.
Nota: proteína CS pode ser detectada a partir de UV / Vis a absorvância a 280 nm, porque contém resíduos de Tyr e Trp. Proteínas sem resíduos aromáticos podem ser detectados por marcá-los com um cromóforo adequado, utilizando um mutante contendo Trp, ou usando interferirnce em vez de medições de absorvância. - Siga as etapas na seção 1.2 para montar uma célula AUC 6 canais com janelas de quartzo. Carregar a amostra de maior concentração (280 A, 12 mm = 0,8) no canal mais próxima do centro do rotor e menor concentração da amostra (A280, 12 mm = 0,3) mais distante do centro do rotor.
2.3. Configurando medidas de absorbância
- Criar um novo ajustar o arquivo (File | New File) especificando "Equilibrium" e mensuração "Absorbance". Especificar 280 nm como o comprimento de onda do detector.
- Execute a calibração radial a 3000 rpm, verificando "calibração Radial antes da primeira varredura" em Opções de verificação, especificando a coleta de dados em baixa resolução, por exemplo, com tamanho do passo Radial = 0,01 centímetros, réplicas = 3 (baixa resolução, rápida), e executar uma única varredura . Após a verificação for concluída, desmarque a opção.
- Configurar um método de equilíbrio de sedimentação ("Method botão ") para ser executado na primeira velocidade calculada no passo 2.1.3, a 20 ° C, e recolher uma verificação a cada 30 minutos. Em "Detail" uns dos células, especifique a coleta de dados em baixa resolução como no passo 2.3.2. Monitorar o progresso de equilíbrio, abrindo os arquivos de dados em HeteroAnalysis e selecionando a função "Match", após pelo menos 18 horas (aproximadamente durante a noite, Fig. 4).
Nota: para atingir o equilíbrio podem demorar muito mais tempo para a primeira velocidade, enquanto velocidades subseqüentes levará menos tempo.
Figura 4. Os resultados de função HeteroAnalysis Match. A primeira e segunda velocidades (topo à esquerda e à direita) parecem ter atingido o equilíbrio, mas é melhor esperar mais algumas horas para ter certeza. Em comparação, a terceira e quarta velocidades (canto inferior esquerdo e direito) têm claramente atingido o equilíbrioem um tempo menor. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Uma vez que o equilíbrio foi atingido, recolher uma única varredura em alta resolução, por exemplo, com o tamanho do passo Radial = 0,001 centímetros, réplicas = 10 (alta resolução, lento).
- Após a verificação for concluída, repita o passo 2.3.3 e 2.3.4 para a próxima velocidade.
- Opcionalmente, quando necessário o tempo para atingir o equilíbrio para cada velocidade é conhecida (ou calculada a partir da experiência), configurar o método de equilíbrio de sedimentação de verificação para incluir todas as velocidades calculadas no passo 2.1.3 e recolher uma varredura após o tempo de equilíbrio para cada velocidade. Neste caso, especifique a coleta de dados de alta resolução em "Detail" cada célula.
2.4. A análise dos dados em SEDFIT e SEDPHAT
Nota: Para mais detalhes e considerações em leitor de análise de dados é chamado to seguinte site: www.analyticalultracentrifugation.com.
- Abertas scans de alta resolução em SEDFIT (Dados | dados de equilíbrio de carga de sedimentação) e dividir os dados em três canais (estas correspondem a diferentes concentrações para cada amostra; Opções | Carregando Opções | Salve 6 canais de dados brutos em 3 subconjuntos).
- Re-abertos arquivos de dados que pertencem a uma mesma amostra e mesma concentração, mas diferentes velocidades em SEDFIT. Ajuste o menisco (linha vermelha vertical), fundo de células (linha vertical azul) e os limites de montagem (linhas verdes verticais), e exportar os dados para uso em SEDPHAT (Data | Exportação de dados para SEDPHAT). Entrada dos parâmetros calculados na etapa 2.1.1, assim como o tipo de rotor e tipo central, conforme solicitado. Repita este passo para cada amostra e concentração.
- Abra todos os dados da mesma amostra (todas as concentrações e velocidades) em SEDPHAT e preencha parâmetros da experiência; um exemplo é mostrado na Fig. 5.
Nota: quando D 2 O é adicionado no buffer, deut peração de protões permutáveis alterar significativamente o peso molecular da proteína, especialmente para as proteínas solúveis em água. As proteínas da membrana, especialmente as pequenas, como proteína SH, são menos afetados porque as regiões incorporado à membrana são protegidos de câmbio. Para corrigir isso, introduzir o "tampão D fração mol".
Nota: Nesta etapa é recomendado para salvar o conjunto de dados editados separadamente, selecionando menu Data | copiar todos os dados e salvar como Nova Configuração. - Selecione um modelo e preencha parâmetros globais para esse modelo.
Nota: A título de exemplo, o modelo "Monómero-n-Mer auto-associação" e os seus parâmetros são apresentados na Fig. 6.
Figura 5. Um exemplo de como preencher parâmetros experimentais.
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Figura 6. Um exemplo de como preencher parâmetros globais para o modelo monômero-n-Mer Auto-Associação.
- Executar um Fit global selecionando o menu Fit | Global de Fit e esperar até que os converge ajuste. Anote (ou tomar um screenshot) os resultados de ajuste, especialmente o qui-quadrado mundial reduziu e log K de valores. Extrato de outros dados, como dados de ajuste e resíduos de montagem a partir do menu de cópia e exibe | Mostrar informação termodinâmica.
- Retornar para parâmetros globais e verificar M (1) para acomodar o peso molecular monômero e repita o passo 2.4.5. Anote o peso molecular equipada e reduziu qui-quadrado global.
- Repita o passo 2.4.3 a 2.4.6 para cada modelo a ser testado e comparar a qualidade ajuste de cada modelo, comparando a redução do valor do qui-quadrado global, bem como resíduos de montagem.
Nota: As pequenas e aleatórias resíduos montagem geralmente indica um bom ajuste, e o modelo que se encaixa melhor fariatem a menor redução do qui-quadrado global. O peso molecular do monómero colocada e que o valor de qui-quadrado não devem diferir substancialmente da do peso molecular (teórico) fixo. - Calcule o intervalo de confiança para o registro obtido Ka por valor selecionando primeiro Estatísticas | Critical qui-quadrado para as projeções de superfície de erro e de introduzir o intervalo de confiança desejado. Em seguida, vá para Estatísticas | Gerar projeção superfície de erro 1-dimensional e desmarque log Ka em diálogo parâmetros globais para obter os valores de qui-quadrado para log Ka.
Nota: Os leitores são aconselhados a consultar as seguintes fontes (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) para obter mais detalhes sobre o método 32, bem como ilustração deste método 33.
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Representative Results
O perfil radial de distribuição C14SB micelas detergentes em Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,3, forma um exponenciais muito raso que poderiam ser ajustados a um modelo linear (Figura 7A). O declive desta distribuição está inversamente correlacionada com a concentração de D 2 O (Figura 7B). O ponto em que o declive é zero, ou seja, o correspondente D 2 O concentração, verificou-se ser de 32,3%.
Veja a Figura 7 abaixo.
A mesma experiência foi repetida para diferentes tampões de: fosfato de sódio 50 mM, NaCl 100 mM pH 5,5 e 50 mM de fosfato-citrato, NaCl 100 mM, pH 3, para se obter D 2 O concentrações correspondentes de 30,3% e 41,0%, respectivamente.
Amostras de tipo selvagem SH (em peso) em detergente foram expostos a pH 3, 5,5 e 7,3 (total de 6 amostras), seguido por centrifugação a 15.000, 19.000, 23.000, 28.000, 34.000 e 42.000 rpm. Data obtido a uma velocidade inferior não pode ser montada de forma fiável, possivelmente porque o equilíbrio não foi atingido, portanto, foram utilizados os dados obtidos a partir dos quatro maiores velocidades. A pH 7,3, SH WT foi encontrado para formar pentâmeros (Figura 8 e Tabela 1), com um K aparente de log = 21,35 (Tabela 2). A constante associação não se alterou em pH 5,5, mas foi significativamente reduzida em pH 3. Isto é consistente com relatórios anteriores 24, que relataram uma diminuição da condutância em pH mais baixo, com um pK de 4,5.
Veja a Figura 8 abaixo.
Ver Tabela 1 abaixo.
Figura 7. Densidade de C14SB correspondência com D 2 O. (A) Radial DISTRIBUTIOn perfil formado por C14SB micelas detergentes em 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7,3 com 25, 30, e 35% de D 2 O. Os dados foram ajustados separadamente para um modelo linear (preto). (B) As pistas foram plotados contra D 2 O concentração (quadrados pretos) e ajustados a um modelo linear (linha vermelha). A correspondência D 2 concentração O é indicado (seta vermelha).
Figura 8. Instalação de SH em C14SB para monômero-pentâmero modelo. Perfil de distribuição radial de SH em C14SB em pH 7 (círculos abertos) foi encontrado para se ajustar melhor ao modelo de auto-associação monômero-pentâmero (linha sólida preta). Residual de montagem é mostrado abaixo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Modelo (n-meros) | Qui-quadrado (fixo MW) | Qui-quadrado (MW instalado) | Cabido MW |
| 3 | 15,444 | 1,0492 | 13477 Da |
| 4 | 3,8094 | 1,0469 | Da 9889 |
| 5 | 1,0499 | 1,0497 | Da 7822 |
| 6 | 2,5994 | 1.547 | Da 6504 |
| 7 | 6,1667 | 1,2112 | Da 5743 |
Tabela 1. Comparação de diminuição dos valores de qui-quadrado globais de diferentes modelos de monômero-n-Mer.
| pH | Limite inferior (163;) | Log Ka | Limite superior (1σ) |
| 3 | 17,432 | 17,576 | 17,737 |
| 5.5 | 20,064 | 20,419 | 20,839 |
| 7.3 | 20,687 | 21,052 | 21,492 |
Tabela 2. Comparação de aparente log K de valores em diferentes pH.
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Discussion
Este documento fornece um protocolo experimental para a preparação e análise de oligomerização de uma pequena proteína de membrana em detergente usando equilíbrio sedimentação da amostra. O protocolo descrito é igualmente válido para -e simpler- proteínas solúveis, como o passo correspondente da densidade não é necessária. Com efeito, o sistema é constituído por uma mistura de detergente e da proteína. Para realizar estudos de sedimentação, o detergente deve estar invisível para o campo gravitacional, de modo que não contribuem para a flutuação de partículas. Assim, a densidade do detergente tem de ser cuidadosamente combinados por adição de D 2 O para o tampão, com a limitação de que, se o detergente utilizado é muito denso, por exemplo., SDS, nem mesmo 100% D 2 O pode coincidir com ele. O passo correspondente densidade não é necessária quando se trabalha com uma proteína solúvel em água, uma vez que a amostra não tem o detergente.
Em nossa aplicação, uma pequena proteína viral que forma chann ionels foi usado. Como todos os viroporins, proteína SH tem um domínio transmembrana helicoidal-α, e, portanto, tem de ser estudado em um detergente que não vai atrapalhar seu tamanho oligom�ica nativa.
Antes destes estudos, por conseguinte, os detergentes adequados têm de ser rastreados. Por exemplo, em SE anterior estuda proteína SH formado oligômeros pentaméricos em DPC, C8E5 e C14-betaína, e pentâmeros também foram observados durante a electroforese no PFO detergente suave 22. Todos esses detergentes são adequados para a SE, uma vez que a sua densidade pode ser igualada por adição de D 2 O. As amostras devem também ser testados pela velocidade de sedimentação (SV), que fornece o número mínimo de espécies presentes 34.
Além disso, detergentes não apropriados irá produzir múltiplas espécies em SV, e várias bandas em PFO eletroforese, indicativos de associação não-específica múltipla. Informação útil a partir da SE é obtido quando o número predominante de espécies pré enviado no sistema não é maior do que dois; no caso da proteína SH, os dados foram ajustados a um equilíbrio entre monómeros e pentâmeros.
É importante notar que o modelo escolhido para ajustar os dados SE, deve também ser tão simples quanto possível, isto é., Uma única espécie de peso molecular desconhecido deve ser experimentado em primeiro lugar, seguido de equilíbrio reversíveis entre monómero e oligómeros, de tamanho crescente. Modelos mais complexos têm associado um maior ambiguidade. Além disso, pequenas populações de outros oligômeros menores ou maiores não podem ser detectados, eo modelo só vai indicar quais são as espécies predominantes presentes. No caso de viroporins, isto é especialmente evidente porque as mudanças de tamanho oligoméricas, dependendo das condições experimentais subtis, por exemplo, detergente utilizados, pH, concentração de proteína, da velocidade de centrifugação ou mutações, por exemplo, no vírus da hepatite C p7 35, 36 M2 influenza A ou SH proteína 24.
jove_content "> Os resultados obtidos para a proteína WT SH mostram claramente que a constante de associação do pentâmero é reduzido a um pH de 3. Estas medições da actividade do canal de fósforo resultados obtidos com a proteína CS nas bicamadas lipídicas sintéticas, onde condutância foi marcadamente reduzidos a pH 3 (pK ~ 4,5), enquanto que permaneceu constante entre pH 7 e 24 5. Com base nestes resultados, pode ser possível que a actividade do canal SH é regulada pelo pH ligeiramente inferior, quando presente em membranas biológicas nativas. Embora no lúmen de Golgi o pH é apenas uma unidade abaixo do que o citoplasma, pH intravesicular gotas ao longo da via endocítica de pH de 6,0-6,5 em endossomas precoces para pH 4,5-5,5 em endossomas tardios e lisossomas 37. Na célula infectada, o pKa para alterações de condutância ou estabilidade pode ser pentamérica mais elevado do que aqueles obtidos in vitro e aqui anteriormente 24, portanto, o pH pode de facto, desempenhar um papel na modulação da actividade do canal durante o ciclo de vidado vírus. A mutação de resíduos de His protonáveis no contexto da célula infectada é uma via interessante para futuras experiências 38.Finalmente, o estudo de proteínas SH é facilitada pela presença de Trp na sua sequência, facilitando medições de absorção de UV. No entanto, o conhecimento da estrutura do oligómero pode permitir a introdução de Trp em locais pouco sensíveis, por exemplo, lípido -ou solvente voltado para partes da proteína de membrana - ou proteínas soluble-. Alternativamente, a proteína pode ser marcada com um marcador visível de absorção ou de fluorescência.
Em resumo, este protocolo descreve a aplicação de SE para determinar as constantes de associação e de tamanho oligoméricas de um canal definido viral, quando os parâmetros experimentais são alteradas. Neste caso, o pH foi variado para estudar o efeito sobre a estabilidade da sua protonação, mas muitas outras hipóteses podem ser testados, tais como efeitos de mutações na estrutura emtegridade destes oligómeros.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
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