Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).
Analytisk ultracentrifugering (AUC) kan användas för att studera reversibla interaktioner mellan makromolekyler över ett brett område av interaktions styrkor och under fysiologiska betingelser. Detta gör AUC en metod för val att kvantitativt bedöma stökiometri och termodynamik homo- och hetero förening som är övergående och reversibla i biokemiska processer. I modaliteten av sedimente jämvikt (SE), en balans mellan diffusion och sedimentation ger en profil som en funktion av radiellt avstånd som är beroende av en specifik förening modell. Häri är ett detalj SE protokoll som beskrivs för att bestämma storleken och monomer-monomer association energi av en liten membranprotein oligomer använder en analytisk ultracentrifug. AUC-ES är etikettfritt, endast bygger på fysikaliska principer, och kan användas på både vattenlösliga och membranproteiner. Ett exempel visas av den senare, den lilla hydrofoba (SH) protein i humant respiratoriskt syncytialvirus (HRSV), En 65-aminosyrapolypeptid med en enda α-helixtrans (TM) domän som bildar penta jonkanaler. NMR-baserade strukturell data visar att SH proteinet har två protonatable His-rester i dess transmembrandomän som är orienterade som vetter mot lumen av kanalen. SE experiment har utformats för att bestämma hur pH-värdet påverkar associationskonstant och den oligomera storlek SH-protein. Medan den pentamera formen bevarades i samtliga fall, var dess associationskonstant minskas vid lågt pH. Dessa data överensstämmer med en liknande pH beroende observerats för SH kanalaktivitet, förenligt med en lumen orientering av de två His rester i SH-protein. Det senare kan uppleva elektrostatisk repulsion och minskad oligomer stabilitet vid lågt pH. Sammanfattningsvis är detta förfarande tillämpligt när kvantitativ information om subtila protein-proteinassociations förändringar i fysiologiska betingelser måste mätas.
Analytisk ultracentrifuge 1-5 är en av de viktigaste metoderna för att studera interaktioner mellan makromolekyler under fysiologiska förhållanden, vara tillgänglig för både svaga och starka växelverkan. Metoden är märkningsfri och använder Ijusabsorption eller störningar, och även fluorescens optiska system kan användas för att få tillgång till koncentrationsintervall över flera tiopotenser 6.
Denna metod är särskilt användbar eftersom de flesta biokemiska processer är beroende av reversibla interaktioner. Stökiometri och styrka dessa interaktioner måste kvantitativt att förstå biologiska processer, och ett antal metoder finns för detta ändamål 7, 8. Men transienta interaktioner är svårt att studera 9.
Valet av en metod för att karaktärisera makromolekylära interaktioner beror på dess statiska eller dynamiska karaktär. I det första fallet, sedim Utformning hastighet (SV) används, där andelen radiella transporter mäts och komplex fraktion utifrån skillnader i flytande massa och form.
Däremot dynamiska föreningar som är reversibla på tidsskalan för försöket inte kan separeras fysiskt. I detta fall, själv- eller hetero interaktioner som leder till icke-kovalenta interaktioner är i en jämvikt som beror på den totala proteinkoncentrationen. Dessa dynamiska interaktioner kan studeras genom både sedimente jämvikt (SE) och sedimentehastighet (SV) 10. Emellertid är den första metoden enklare att utföra och beskrivs här. I SE är centrifuge utförs vid en tillräckligt låg hastighet så att en jämvikt nås mellan diffusion och sedimentation. Vid denna punkt, jämviktsprofilen hos en optisk signal (UV-VIS) som en funktion av radiellt avstånd, kan analyseras med användning av förinställda termodynamiska modeller för föreningar 11.
ve_content "> I föreliggande papper, är en sedimenteringsjämvikt studie presenterades av självassociering av ett viralt membranprotein som bildar jonkanaler. På grund av sin hydrofobicitet, är experimentet körs i närvaro av detergent, och i detta fall densiteten för lösningsmedel måste matchas till den hos tvättmedel. Emellertid, det protokoll som beskrivits skulle identiska i fallet med ett vattenlösligt protein, med undantag av att inget lösningsmedel densitetsmatchning skulle krävas.Proteinet används är kodad i RSV (HRSV), ett hölje pneumovirus i Paramyxoviridae familjen som orsakar nedre luftvägsinfektioner hos spädbarn, äldre och nedsatt immunförsvar befolkningar i världen 12. Upp till 64 miljoner rapporterade fall av HRSV-infektion och 160.000 dödsfall inträffar varje år.
HRSV genomet transkriberar 11 proteiner, inklusive de tre membranproteiner F, G, och små hydrofoba (SH). SH-protein är inblandati patogenesen av RSV-infektion. RSV saknar SH-genen (RSVΔSH) var lönsamt, orsakade bildning av syncytia och växte liksom vildtypen (WT) virus 13-16. Emellertid RSVΔSH viruset replik 10-faldigt mindre effektivt än WT i de övre luftvägarna 15, 16. Dessutom var RSVΔSH virus dämpas i in vivo mus och schimpans modellerna 13, 17.
SH-proteinet är en 64 (RSV subgrupp A) eller 65 (RSV subgrupp B) aminosyror lång typ II integralt membranprotein som ackumuleras mestadels på membranen i Golgi-facket 18. SH-protein har en enda förutspådde en-helixtrans (TM) domän 19 som är mycket bevarad 20,21. C- och N-terminala extramembrane domänerna är orienterade lumenally / extracellulärt och cytoplasmatiskt, respektive.
Både syntetiska TM domän (rester 18-43) Och full längd SH protein har visat sig bilda homopentamers i en mängd olika rengöringsmedel. Den homopentameric formen är ansvarig för kanalaktivitet i plana lipiddubbelskikt 22,23. Den korrekta orienteringen av TM monomerer i lipiddubbelskiktet bestämdes först med användning av platsspecifik infraröd dikroism 23, som visade His-22 att vara i en lumen, nära inter spiralformig, orientering. Samma TM domän orientering bekräftades genom NMR-studier som rekonstruerade den pentamera a-helix bunt av fullängdsprotein i dodecylphosphocholine (DPC) miceller 22. I denna "micell" modell, var ett enda a- spiralformad TM-domänen flankerad N-terminalt av en a-helix, och C-terminalt av en utökad B-hårnål. De två protonatable rester av SH-protein, His-22 och His-51, är belägna i TM-domänen (lumenally orienterad), och vid spetsen av den extramembrane C-terminala β hårnål (långt från kanal por), respektive. I en bicellar Environment emellertid förlänger TM α-helix upp till His-51, och båda His-rester är tillgängliga för lumen i kanalen 24. Kanalen strukturen antar en trattliknande arkitektur 22, där den smalare regionen (Ser-29 till Cys-45) 22 är fodrad med hydrofoba sidokedjor (Ile-32, Ile-36, Ile-40 och Leu-44), och Ile-36 definierar den smalaste punkten i kanal lumen. His-22 ligger vid den största öppningen av denna tratt, medan His-51 är vid spetsen på den minsta öppningen.
I föreliggande dokument, har analytisk centrifugering i en sedimentejämviktsläge använts för att avgöra om hans protonisering påverkar stabiliteten i SH protein pentameren. I detta fall var SH protein löses i C14-betaindetergent, som har använts tidigare för att visa att SH proteinformer penta oligomerer 22.
Denna uppsats ger en experimentell protokoll för beredning och analys av oligomerisering av en liten membranprotein i tvättmedel använder jämviktssedimenteprov. Protokollet som beskrivs är lika giltiga -och simpler- för lösliga proteiner, som densiteten matchningssteget inte krävs. Faktum är att systemet utgörs av en blandning av detergent och protein. För att genomföra sedimente studier måste tvättmedels vara osynlig för gravitationsfältet så att det inte bidrar till partikel flotation. Sålunda har de…
The authors have nothing to disclose.
This work has been funded by the National Research Foundation grant NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) and Tier 1 grant RG 51/13.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |